| 摘 要： | 【目的】为了从分子水平上揭示美国白蛾飞行能力的机制,利用基因组编辑技术对翅形成相关基因Wnt-1进行功能研究。【方法】根据美国白蛾的基因组和转录组信息设计引物,克隆得到HcWnt-1基因CDS区全长,利用在线软件分析HcWNT-1蛋白的结构特征;通过RT-PCR确定该基因在其生长发育过程中的时间表达模式,并通过免疫组化方法确定HcWNT-1蛋白的时空表达模式;通过CRISPR/Cas9技术对HcWnt-1基因进行编辑,观察胚胎期突变体表型和基因型特点,利用直接PCR和阳性克隆测序检测HcWnt-1基因突变。【结果】HcWnt-1基因核苷酸序列大小为1 221 bp,编码407个氨基酸,HcWNT-1蛋白含有螺旋-转角-螺旋DNA结合基序和24个保守的半胱氨酸残基,并且高度保守的Motif分散分布于整个序列。转录水平和翻译水平验证表明:美国白蛾HcWnt-1基因在胚胎早期高表达,且其表达水平随着体节分化和附肢发育而呈时序性变化;24 h时,早期胚带形成,转录水平出现第1个表达高峰,HcWNT-1蛋白表达主要集中于原头区;随着胚胎的发育,HcWnt-1基因表达水平逐渐下降,HcWNT-1蛋白表达沿着前后体轴由头部向尾部逐渐延伸;在144 h,转录水平出现第2个表达高峰,HcWNT-1蛋白表达主要集中于附肢。美国白蛾HcWnt-1基因的突变造成了胚胎期99.8%的个体死亡(注射1 000头),突变率为62.5%,PCR测序结果显示2个靶点之间存在片段删除,最大删除片段为423 bp;大部分突变体不能形成胚胎,少数能形成胚胎的个体体节形成异常和附肢发育受阻。【结论】美国白蛾胚胎发育类型符合短胚带和中间胚带型;CRISPR/Cas9基因组编辑技术可以对美国白蛾基因组进行高效编辑,可为林业以及非模式害虫基因功能研究提供理论支持;HcWnt-1基因敲除影响美国白蛾体节分化和附肢形成,说明该基因对于美国白蛾胚胎发育至关重要。此外,HcWnt-1突变造成美国白蛾胚胎期死亡,可作为未来美国白蛾遗传防治的靶标基因。
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