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淀粉分支酶(SBE)催化葡萄糖以α-(1,6)糖苷键连接,形成分支结构。SBE有3种同工酶形式：SBEⅠ、SBEⅡa和SBEⅡb,目前的研究主要集中在SBEⅡb上,而对于SBEⅠ在淀粉合成的作用报道极少。为了明确SBEⅠ在玉米淀粉合成中的作用,扩增了玉米SBEⅠ基因的337 bp片段,以pMD19-T为中间载体,pCambia3301为目标载体,构建玉米SBEⅠ基因的RNAi载体,命名为pC3301-SBEⅠ。通过限制性内切酶酶切鉴定,表明pC3301-SBEⅠ载体构建正确,可用于农杆菌介导的玉米自交系转化工作。 相似文献
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在前期的研究中,一个玫瑰RdGASA4-like基因的cDNA和DNA序列全长利用同源克隆结合RACE的方法首次得到克隆。为深入了解该基因在赤霉素调控植物发育过程中的作用,通过TAIL-PCR的方法首次克隆该基因起始密码子ATG上游685bp的5’-UTR和部分启动子序列,在启动子序列分析的基础上,构建其与GUS基因融合表达载体,命名为pBI-GP685。通过农杆菌介导的方法对甘蓝外植体子叶-子叶柄进行启动子瞬时表达研究,结果表明分离得到的启动子具有启动报告基因GUS表达的活性。 相似文献
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为研究SbCYP79A1基因功能及其转化玉米抗虫能力的研究,本试验根据NCBI公布的SbCYP79A1基因序列设计PCR引物,利用高粱品种BTX623克隆到同源性达到100%的SbCYP79A1基因全长cDNA序列,该序列开放阅读框包含1 887 bp,由629个氨基酸组成。构建SbCYP79A1基因植物超表达载体,PCR及测序结果均显示植物表达载体pMDC141-CYP79A1构建成功。将该表达载体导入农杆菌EHA105中,热激法转化到玉米A188幼胚,共培养7 d后,在幼胚检测到GUS基因瞬时表达,说明该农杆菌介导的玉米转化体系的转化效率具有可靠性;经选择培养获得54株转化植株,经PCR鉴定获得38株阳性植株,同时利用GUS基因对阳性植株的叶片和根部进行组织定位分析,均观测到较强的GUS基因表达,进一步验证了PCR检测结果。以上结果均证明高粱的SbCYP79A1基因已经整合到玉米基因组中,该研究结果为进一步获得玉米抗虫的新材料提供依据。 相似文献
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香蕉果实凝集素基因的克隆及原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
【研究目的】植物凝集素具有重要的生理功能,通过原核表达香蕉凝集素基因(BanLec)并探讨其功能具有重要意义。【方法】提取了巴西蕉果肉总RNA,利用RT-PCR方法扩增BanLec cDNA 全长序列,并对该序列进行分析。将BanLec克隆至表达载体pET-30a,并将筛选到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行诱导表达。【结果】克隆到的BanLec cDNA 序列为460bp,开放读码框为426bp,编码142个氨基酸。与其它已知的香蕉凝集素基因相比较,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94%和93%以上。SDS-PAGE 分析结果表明,经IPTG诱导,BanLec基因以融合蛋白形式表达,相对分子量约为20kD。【结论】该研究为探讨香蕉凝集素的活性及生化功能等奠定基础。 相似文献
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为了揭示水稻中肽链释放因子eRF1在蛋白质生物合成中的作用,对水稻eRF1基因的全长cDNA和启动子进行了克隆与表达模式分析。通过RT-PCR技术克隆获得1个水稻eRF1基因,命名为OseRF1-3,序列分析表明,该基因CDS序列全长1 308 bp,编码436个氨基酸,包含N、M、C共3个保守结构域。qRT-PCR结果表明,OseRF1-3是组成型表达,在水稻穗中表达最高。以水稻叶片基因组DNA为模板,通过PCR技术克隆了该基因起始密码子上游2 120 bp启动子序列,构建该基因启动子融合GUS植物表达载体,并通过农杆菌介导法导入水稻愈伤组织。GUS组织化学染色分析表明,OseRF1-3基因启动子驱动GUS基因在水稻各组织部位都表达即组成型表达,在根中表达较弱,在水稻花、硬壳中检测到GUS基因较强表达。GUS检测OseRF1-3基因启动子驱动GUS表达的结果与qRT-PCR得出的结果相一致。因此,该研究将为进一步探索OseRF1-3基因的功能奠定理论基础。 相似文献
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小麦AGPase基因LSU Ⅱ的克隆及反义表达与RNAi干扰载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号的发育籽粒中克隆出小麦淀粉合成关键酶-AGPase质体型大亚基(AGPase plastidial large subunit,LSU Ⅱ)cDNA一段特异保守序列,长度为535 bp(GenBank No.EF378944),与DQ409820(小麦)、U66876(大麦)、AK069296(水稻)和DQ406819(玉米)分别有98%,97%,88%,88%的同源性,表明克隆出了小麦LSU Ⅱ基因的部分cDNA序列.以pWM101质粒表达载体为基础,将LSU Ⅱ反向置于pWM101质粒的CaMV35S启动子之后,构建了LSU Ⅱ的反义表达载体pWM101LSU ⅡA;另外,用pFGC5941干扰载体构建了LSU Ⅱ基因的RNAi载体pFGC5941 LSU ⅡSA,这些载体的构建为研究LSU Ⅱ基因的功能打下了基础. 相似文献
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【研究目的】对猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点进行克隆和原核表达载体的构建。【方法】参考GenBank上公布的TGEV S基因A抗原位点序列,应用Primer6.0设计一对含酶切位点的引物,用于RT-PCR扩增A抗原位点目的片段,将扩增产物连接于paesy-T克隆载体上构建克隆载体,用EcoR I和Xhol I对表达载体PET-32a（+）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（+）多克隆位点上,连接、转化至BL21(DE3),构建A位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。【结果】所扩增的目的片段的大小为534bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其它猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEV S 基因A抗原位点的原核表达载体。【结论】TGEV S 基因A抗原位点原核表达载体的成功构建,填补了中国国内单独针对此位点进行研究的空白,也为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。 相似文献
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玉米淀粉分支酶基因反义表达载体的构建和功能分析 总被引：6，自引：0，他引：6
淀粉是玉米籽粒的主要成分。根据分子结构将淀粉分为直链淀粉和支链淀粉,其合成过程受到一系列酶的调控。淀粉分支酶是淀粉生物合成过程中的一个关键酶,它催化葡萄糖以α-(1,6)键连接,形成分支结构[1,2]。目前,对淀粉分支酶及其基因已从分子水平和生物化学方面进行了一些研究,淀粉分支酶基因的生理功能基本清楚[3~5]。由于反义RNA（antiscnse RNA, as RNA)技术提供了直接有效地人为控制基因表达的方法,现已成为基因工程研究中的一项重要技术[6]。本项研究利用基因工程技术,克隆玉米淀汾分支酶基因,构建反义表达载体。通过花粉管通道法将其导入玉米自交系,旨在抑制淀粉分支酶基因的表达,提高直链淀粉的含量。 相似文献
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抗体是蛋白质功能研究的重要试剂。玉米蛋白的功能研究因缺乏相应的抗体而难以开展。玉米淀粉合酶Ⅱb与淀粉合酶Ⅱa均属于淀粉合酶,其主要负责支链淀粉的延伸。但对淀粉合酶Ⅱb的报道较少,本研究以原核表达的淀粉合酶Ⅱb的C端(455～704 aa) GST融合蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔,分离血清制备SSⅡb多克隆抗体。Western blot试验发现, SSⅡb多克隆抗体不但能识别SSⅡb-C (455～704 aa)抗原,而且能识别玉米不同发育阶段胚乳中SSⅡb蛋白。利用该多克隆抗体的Western blot试验表明,玉米SSⅡb蛋白的表达在授粉后10 d到30 d的胚乳中表达模式是先增后降,授粉后15 d表达量最高,而半定量RT-PCR的结果表明授粉后20 d SSⅡb的转录水平最高。这些结果表明成功制备了特异的玉米SSⅡb的多克隆抗体,并能在Western blot中特异识别玉米内源SSⅡb蛋白,为进一步深入研究SSⅡb蛋白功能奠定基础。 相似文献
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谷子DnaJ蛋白基因的克隆 总被引：6，自引：0，他引：6
DnaJ蛋白是近年研究较多的同热激等胁迫反应相关的基因。本研究用0.8%NaCl胁迫下的谷子幼苗提取RNA,用反转录酶M-MLV扩增得到第一链cDNA,再以第一链cDNA为模板进行PCR扩增,克隆获得了完整的谷子DnaJ蛋白基因,该基因cDNA全长1 260 bp,编码419个氨基酸,具有DnaJ蛋白分子伴侣系统的3个保守结构域。将谷子DnaJ蛋白基因构建入表达载体pGFP,获得了谷子DnaJ基因的表达载体。该基因的克隆和表达载体构建,为谷子DnaJ蛋白基因的功能分析以及谷子耐热抗旱机理研究有重要意义。 相似文献
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捕光叶绿素a/b结合蛋白基因是绿色植物光合系统中的重要基因,其编码的蛋白与色素所形成的蛋白复合体在光化学反应、光保护等方面都起着重要的作用.采用RT-PCR技术和与RACE-PCR技术,从绿竹中克隆到捕光叶绿素a/b结合蛋白基因的全长cDNA编码区,命名为cab-BO2(GenBank登记号:EF088668).该基因编码区长为792 bp,编码263个氨基酸.通过加酶切位点的方法,将基因的编码区直接构建到载体pBI121多克隆位点.经过酶切检测,获得了包含35S启动子、cab基因、GUS报告基因和NOS终止区域的植物表达载体. 相似文献
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SBE3是位于水稻第2号染色体上的水稻淀粉分支酶基因,该基因表达量的降低引起水稻抗性淀粉(resistant starch,RS)含量的提高。本研究应用CRISPR/Cas9系统对SBE3基因进行编辑,根据基因编码区序列(CDS)在第8外显子区域设计长度为20 bp的引导序列,化学合成引导序列并构建成sgRNA,将其插入到Cas9质粒骨架载体中,转化农杆菌。通过农杆菌介导的遗传转化方法将构建好的p CAMBIA1300:SBE3sgRNA:Cas9表达载体转入水稻受体材料沪LPR18中。使用PCR扩增转基因阳性植株中含有CRISPR/Cas9靶点的片段并测序验证,确定12个突变单株,其中2个是纯合型,通过后代分离,得到没有潮霉素基因筛选标记的SBE3纯合突变单株,测定其抗性淀粉含量高达10%以上。以上结果表明,本研究已经通过CRIPR/Cas9技术获得稳定的高抗性淀粉水稻纯合突变体材料,为高抗性淀粉育种提供了新的种质资源和创建方法。 相似文献
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《分子植物育种》2021,19(16):5389-5397
为研究青蒿素合成的关键酶基因AaADS过表达对黄花蒿腺毛发育和青蒿素含量的影响,本研究根据GenBank收录的黄花蒿AaADS基因启动子和cDNA序列设计引物,采用同源克隆的方法从黄花蒿品种(428-A)中扩增出AaADS基因启动子和cDNA序列。构建GUS报告载体AaADSpro::GUS和植物表达载体AaADSpro::AaADS,利用农杆菌介导的叶盘转化法转化黄花蒿。通过对转基因植株叶片腺毛的GUS基因活性检测和不同组织器官AaADS基因RT-PCR半定量分析,以及过表达AaADS基因的植株叶片下表皮腺毛荧光显微观察、统计和植株青蒿素含量的测定,结果表明:AaADS基因能在黄花蒿腺毛细胞中高效表达;转基因植株中AaADS基因表达量明显高于对照,且在叶片组织表达量最高;转基因植株叶片腺毛细胞较对照植株明显增大,过表达AaADS基因植株中青蒿素含量达27.3 mg/g DW,比对照植株中青蒿素含量12 mg/g DW提高了2.3倍。本研究说明AaADS基因过表达能有效促进黄花蒿腺毛细胞的生长和青蒿素的生物合成,为选育高青蒿素含量的黄花蒿新品系提供可行性方法。 相似文献
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芽孢杆菌蛋白酶基因apr的克隆、 表达及序列分析 总被引：1，自引：1，他引：0
【研究目的】克隆从新疆吐鲁番地区土样分离获得产蛋白酶菌株Bacillus tequilensis C9蛋白酶基因apr,建立蛋白酶基因异源表达体系。【方法】采用PCR技术克隆获得目的基因,利用生物信息学软件进行序列分析,构建pET-28a原核表达重组质粒,转化BL21大肠杆菌,37℃下IPTG诱导表达融合蛋白,测定酶活。【结果】蛋白酶基因apr全长1098 bp,与Bacillus subtilis aprE (AB734697)有98%的同源性,编码含有299个氨基酸残基的成熟蛋白,是易溶、亲水性较强的蛋白,属于Peptidases_S8_S53 superfamily蛋白家族,融合蛋白分子量为29 kDa,蛋白酶酶活为28.4 u/mL。【结论】试验为构建蛋白酶基因高效表达体系奠定理论基础。 相似文献
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以玉米B73基因组DNA为模板, 通过特异PCR扩增, 克隆出玉米启动子ZmPR4序列。序列分析表明, 该启动子与AJ969166序列同源性为100%。构建了ZmPR4或玉米泛素基因(Ubiquitin)启动子控制的报告基因GUS的表达载体。通过基因枪介导法转化小麦幼胚愈伤组织。瞬间表达实验表明, 在小麦幼胚愈伤组织中, 玉米ZmPR4启动子的本底表达活性明显比Ubi启动子的低, 但经纹枯病菌诱导后, ZmPR4 启动子控制的GUS基因的表达明显增强。PCR检测结果证实ZmPR4 启动子在小麦愈伤组织中具有表达活性, 能够驱动GUS基因的表达。因此, 玉米ZmPR4启动子在小麦抗病基因工程育种中具有潜在的应用价值。 相似文献
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红掌漆酶基因Lac的表达载体构建与剑麻转化 总被引：1，自引：0，他引：1
用RT-PCR从红掌品种亚利桑那的cDNA中扩增出漆酶基因Lac并得到的基因的全长.将Lac片段克隆到pMD18-T载体,然后将此基因插入pBI121的CaMV35S启动子后取代原载体中的GUS基因构成表达载体pBI121-Lac.通过冻融法将表达载体导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404,并转化剑麻获得转基因植株.对转化植株进行的基因组PCR分析结果表明,Lac基因已成功的整合到剑麻的基因组中.转漆酶基因植株的获得为剑麻抗性的提高提供了可能性,并且为以后研究漆酶的具体功能提供了方便. 相似文献
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以玉米B73基因组DNA为模板,通过特异PCR扩增,克隆出玉米启动子ZmPR4序列。序列分析表明,该启动子与AJ969166序列同源性为100%。构建了ZmPR4或玉米泛素基因(Ubiquitin)启动子控制的报告基因GUS的表达载体。通过基因枪介导法转化小麦幼胚愈伤组织。瞬间表达实验表明,在小麦幼胚愈伤组织中,玉米ZmPR4启动子的本底表达活性明显比Ubi启动子的低,但经纹枯病菌诱导后,ZmPR4启动子控制的GUS基因的表达明显增强。PCR检测结果证实ZmPR4启动子在小麦愈伤组织中具有表达活性,能够驱动GUS基因的表达。因此,玉米ZmPR4启动子在小麦抗病基因工程育种中具有潜在的应用价值。 相似文献
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以70个有代表性的小麦品种,采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法检测淀粉粒结合SBE Ⅱb的品种间差异;并对SDS-PAGE凝胶中SBE Ⅱb进行回收、复性和酶活性测定.结果表明,淀粉粒结合蛋白(SGP)中分子量为85 kD的SGP-2是与淀粉粒结合的SBE Ⅱb,具有淀粉分支酶活性;SBE Ⅱb从淀粉粒释放并去除SDS后活性立即恢复,其活性高峰出现在花后21 d左右;SBE Ⅱb在小麦籽粒发育早期开始表达,不同发育时期表达量有差异,但其表达图谱在品种间没有差异,即编码SBE Ⅱb的基因位点不具有品种的遗传多态性. 相似文献
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紫杉烷14β-羟基化酶基因片段的克隆及其植物表达载体的构建 总被引：3，自引：0，他引：3
采用CTAB法提取中国红豆杉基因组DNA,利用PCR技术克隆得到紫杉烷14β-羟基化酶(简称14OH)基因前半段,测序结果表明DNA片段序列为915bp,与报道的14OH基因同源性为98.3%。然后将获得的DNA片段(915bp)正反向插入到二元载体pZh01的GUS两端,构建成14OHRNAi植物表达载体pZ14a,又选其中与羟基化酶家族其他成员同源性低的部分(390bp),正反向插入到二元载体pZh01的GUS两端,构建成14OHRNAi植物表达载体pZ14b。同时将克隆得到的DNA片段(915bp)反向插入到二元载体pZh01中,构建成14OH反义RNA植物表达载体pZ14c。经PCR和酶切图谱分析鉴定,确认载体构建成功。 相似文献