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1.
以小麦条锈菌、杆锈菌、叶锈菌的夏孢子为材料，通过DNA提取、酶切、PCR扩增、凝胶电泳等系列程序摸索和优化，建立了锈菌的AFLP分子标记体系如下: 40μL酶切体系中采用了EcoRI,TrulI各5U,37℃3h,65℃3h双酶切4μL100ng/μL的DNA; 然后加入10μL连接混合液22℃连接3h,16℃10h; 连接产物5μL,10μmol/LEcoRI,10μmol/LTru1I预扩引物各1.5μL,PCR反应液25μL,ddH2O17μL进行预扩;预扩产物稀释20倍后取 5μL,50ng/μL EcoRI,Tru1I选扩引物各1μL,PCR反应液10μL,ddH2O3μL体系进行选择性扩增。为研究小麦锈病和其他真菌性病害的分子标记克隆及抗病育种的辅助选择提供了有力工具。 相似文献
2.
以芝麻细胞核雄性不育系95ms-5为材料,对AFLP反应体系中的酶切连接、预扩增和选择性扩增中的关键性因素进行了优化。结果表明,在模板DNA质量浓度为200ng/μL、37℃酶切连接6h的情况下,预扩增中最佳Mg2+浓度为1.0mmol/L,dNTP最佳浓度为0.3mmol/L,Taq酶量以0.5U为宜,预扩增引物终浓度为0.4mmol/L;选择性扩增中,预扩增产物稀释10倍后,以Mg2+0.8mmol/L、dNTP 0.2mmol/L、Taq酶1.0U、选扩引物0.6mmol/L为宜。 相似文献
3.
本文以青稞为材料,对AFLP酶切连接、预扩增、选择性扩增过程进行优化。结果表明,酶切反应条件为DNA模板200 ng、限制性内切酶Eco RI/Mse I 4U、酶切时间4h;连接反应条件为连接温度16℃,T4连接酶3 U,连接时间12 h以上;预扩增反应条件为r Taq聚合酶3 U、dNTP 4 mmol/L、镁离子浓度1.00 mmol/L;选择性扩增反应条件为r Taq聚合酶4 U、d NTP 4 mmol/L、镁离子浓度1.25 mmol/L及预扩产物稀释10倍。利用优化后的AFLP体系,以藏青2000、冬青18这2个供试材料的基因组为模板,从100对引物组合中筛选出10对重复性好、稳定性强、扩增条带清晰、分布均匀、多态性高的引物组合,为青稞种质资源鉴定及遗传多样性分析提供了基础。 相似文献
4.
以小麦条锈菌、杆锈菌、叶锈菌的夏孢子为材料,通过DNA提取、酶切、PCR扩增、凝胶电泳等系列程序摸索和优化,建立了锈菌的AFLP分子标记体系如下:40μl酶切体系中采用了EcoRI、TrulI各5U,37℃3h,65℃3h双酶切4μl100ng/μl的DNA;然后加入10μl连接混合液22℃连接3h,16℃10h;连接产物5μl,10μMEcoRI、10μMTru1I预扩引物各1.5μl,PCR反应液25μl,ddH2O17μl进行预扩;预扩产物稀释20倍后取5μl,50ng/μlEcoRI、Tru1I选扩引物各1μl,PCR反应液10μl,ddH2O3μl体系进行选择性扩增,为小麦锈病和其他真菌性病害的分子标记克隆及抗病育种的辅助选择提供了有力工具。 相似文献
5.
以采自广西、云南和河南等地的紫薇属Lagerstroemia植物紫薇L.indica,南紫薇L.subcostata,福建紫薇L.limii和桂林紫薇L.guilinensis叶片为材料,利用改良CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取叶片基因组DNA,获得了高质量的紫薇叶片DNA,并以其基因组DNA为模板进行了酶切连接,利用酶切连接的产物稀释一定倍数作为预扩增的模板,最后以稀释一定倍数的预扩增产物进行选择性扩增,进行紫薇和南紫薇的AFLP（扩增片段长度多态性）银染反应体系的优化。AFLP体系中每一步反应都设置了不同的反应体系,采用了160对引物作为初选引物,筛选出了10对适合紫薇基因组扩增的引物。结果表明,适宜紫薇基因组扩增的最佳酶切、预扩增和选择性扩增体系为：酶切连接体系1;预扩体系3;选扩体系3,反应体系中Mg2＋质量浓度为1.2×10-6kg.L-1时扩增效果较好。 相似文献
6.
[目的]该研究旨在初步建立适合于菠菜作物的AFLP反应体系。[方法]运用改良CTAB法提取6份菠菜品种的DNA,对AFLP反应体系中酶切连接、预扩、选扩等实验条件进行了优化分析。[结果]研究结果如下:(1)在PCR仪中酶切的效果比水浴的要好,酶切反应对酶切时间和DNA的浓度要求不敏感。(2)菠菜AFLP预扩选扩体系的反应体积为20μl,Mg2+(25mmol/L)1.2μl,dNTPs(2.5mmol/L)1.6μl,Taq-polymerase(5U/μl)0.2μl最佳。[结论]该研究建立的AFLP反应体系对与菠菜基因组分析时稳定有效的,该技术体系为菠菜品种亲缘关系的AFLP分子标记分析和遗传育种等提供一定的理论基础。 相似文献
7.
《江苏农业科学》2018,(19)
以内蒙古特色药用植物黄芪为试验材料,建立并优化1套适用于黄芪的扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,简称AFLP)反应体系。对AFLP反应体系的影响因素基因组DNA的提取、内切酶的确定及酶切时间、预扩增、选择性扩增反应等关键因素进行优化,并对AFLP适宜引物进行筛选。结果表明,黄芪基因组DNA的模板以50 ng/μL为宜,采用EcoRⅠ/MseⅠ进行双酶切,酶切连接采用一步法完成;最佳酶连时间为16 h;预扩增反应产物稀释20倍作为选扩模板,筛选出适用于黄芪AFLP分析的引物组合5对:E-AG/M-CGT、E-AT/MCTG、E-GA/M-CAA、E-TC/M-CAA、E-GT/M-CTG,为黄芪的分子标记辅助育种、遗传图谱构建、种质资源研究奠定了基础。 相似文献
8.
小麦基因组AFLP反应体系的建立 总被引：9，自引：1，他引：9
利用小麦抗叶锈近等基因系研究了小麦基因组AFLP反应体系,建立了适于小麦基因组的AFLP反应体系:40μL酶切体系中采用7.5UPstⅠ和5UMseⅠ37℃3h,65℃3h双酶切0.1～0.2μgDNA,然后加入10μL接头、T4连接酶混合液,16℃连接过夜;吸取未稀释的酶切连接液4μL,加入75ng预扩增引物,10mmol/LdNTP,1.5UTaq酶,1×buffer,加PCR水至40μL进行预扩,将预扩产物稀释20倍,吸取5μL,加入40ng选择性引物,1.25UTaq酶,7.5mmol/LdNTP,2%去离子甲酰胺,1×buffer,加PCR水至25μL进行选择性扩增。本研究为小麦抗叶锈基因的分子标记克隆及抗病育种的辅助选择提供有力的工具。 相似文献
9.
基于毛细管电泳的柳树AFLP分子标记研究 总被引：2，自引：0，他引：2
为构建柳树遗传图谱、进行分子育种等奠定基础,以柳树为材料,基于毛细管电泳技术体系建立并优化了AFLP分子标记技术,简化了AFLP分析流程。首先提取高质量的柳树基因组DNA,对基因组进行酶切与接头连接、预扩增和选择性扩增,最后通过毛细管电泳分析各因素的影响。基因组DNA提取采用改进的CTAB法,酶切模板DNA用量450 ng,EcoRⅠ酶切2 h,MseⅠ酶切2 h,接头过夜连接,选择性扩增时dNTP浓度0.3 mmol/L,Mg 2+ 浓度1.5 mmol/L,引物浓度0.125 μmol/L,DNA聚合酶浓度0.025 U/μL,预扩增产物最适稀释倍数20倍。经过重复实验,证明建立的AFLP 毛细管反应体系适用于柳树AFLP分析。 相似文献
10.
以豫杂一号泡桐组培苗为材料,通过对影响MSAP反应体系各主要因素的优化,建立了适于泡桐MSAP分析的反应体系.结果表明,最佳酶切体系(25μL)包含300 ng模板DNA,16 U的EcoR I和10 U的HapⅡ(MspI),各双酶切8 h后,80℃失活20 min;最佳连接体系(25μL)是酶切产物20μL,0.16μmol.L-1EcoR I接头,1.6μmol.L-1HapⅡ(MspI)接头,2.5μL 10×T4Buffer,2 U T4连接酶,22℃连接18 h;最佳预扩反应体系(20μL)是5μL稀释10倍的连接产物,100μmol.L-1dNTP,0.5 U Taq酶,EcoR I和HapⅡ(MspI)预扩引物各0.25μmol.L-1,2.5μL 10×PCR Buffer.最佳选择性扩增反应体系(20μL)为5μL稀释30倍预扩增产物,100μmol.L-1 dNTP,0.5 U Taq酶,EcoR I和HapⅡ(MspI)选扩引物各0.3μmol.L-1,2.5μL 10×PCRBuffer.最后,利用优化的体系,筛选出了96对适宜于泡桐MSAP分析的引物. 相似文献