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1.
木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌中的高效表达 总被引：1，自引：0，他引：1
参照Genebank中疏棉状嗜热丝孢菌木聚糖酶A基因序列,以引物拼接方式,人工合成采用大肠杆菌优势密码子的基因xynA,插入pET-20b载体,获得重组表达载体pET-20b-xynA。重组菌在16℃下诱导效果最好,10 h酶活达到42.05 U/mL,重组酶占全细胞蛋白的47%,粗酶在65℃和pH 5～8条件下很稳定。 相似文献
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黑木耳漆酶基因在毕赤酵母中的表达及其酶学性质研究 总被引：2，自引：1，他引：1
应用SignalP 3.0 Server软件对黑木耳漆酶基因lac1(GenBank No.AY450405)编码的蛋白质序列进行分析,发现在其N端存在18个氨基酸的信号肽序列。通过RT-PCR克隆了lac1基因,分别构建带有自身信号肽的lac1基因毕赤酵母表达载体pPICN-lac1和以α因子信号肽替换自身信号肽的lac1基因毕赤酵母表达载体pPIC9-lac。将这两个载体转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115细胞,获得基因工程菌GS115-pPICN-lac1与GS115-pPIC9-lac。SDS-PAGE分析和酶活性测定结果表明,在转化后者中漆酶基因得到了有效分泌表达,而在转化前者中漆酶基因未能得到有效分泌表达。进一步研究确定GS115-pPIC9-lac菌株液体发酵的最适pH为4.0,在此发酵条件下,其分泌表达的漆酶最高酶活为0.149U·mL-1。酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH为5.0,在最适反应条件下其pH稳定性和热稳定性均较好。 相似文献
3.
一种来源于Bispora betulina的酸性木聚糖酶基因克隆及其酶学性质研究 总被引：2，自引：1，他引：1
利用简并PCR和TAIL-PCR技术从嗜酸性真菌Bispora betulina中克隆得到一个酸性木聚糖酶基因xyn11BB。该基因全长1 207 bp,含有三段内含子、一段外显子和一个终止密码子,编码由297个氨基酸组成的蛋白质,推测蛋白质含有一个CBM1结构域。将不带原基因信号肽编码序列的cDNA基因以正确阅读框架克隆到表达载体pPIC9上,并在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中诱导表达,其表达活性达121.15 U/mL。重组蛋白经硫酸铵分级沉淀和阴离子交换柱纯化后达到电泳纯。对其酶学性质分析表明,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH为4.5,在酸性条件下具有良好的活性和稳定性,可作为饲料用酶的备选。 相似文献
4.
通过引物拼接的方式合成采用大肠杆菌优势密码子的疏棉状嗜热丝孢菌木聚糖酶基因xynA,插入到热激质粒pHsh和质粒pET-20b中构建重组质粒pHsh-xynA和pET-20b-xynA,再转入大肠杆菌JM109表达。经热激和IPTG诱导后,木聚糖酶在重组菌中获得特异性表达,产物以胞内可溶性蛋白和包涵体形式存在。重组菌pET-20b-xynA在16℃下表达量最大,胞内酶活达42.13 U/ml,重组菌pHsh-xynA在42℃下胞内酶活最大,为35.06 U/ml。与质粒pHsh相比,pET-20b质粒更有利于重组木聚糖酶的表达。 相似文献
5.
将来源于瘤胃真菌Neocallimastix frontalis的高比活木聚糖酶基因xyn-w整合到毕赤酵母表达载体pPIC9上,通过电击转化得到重组转化子。SDS-PAGE分析和表达产物的研究表明,木聚糖酶基因xyn-w得到了高效分泌表达,在5 L发酵罐中木聚糖酶蛋白表达量达到1 mg/mL,酶活性达到13 000 IU以上。XYN-W 的C端57个氨基酸序列为连接序列和锚定区域,利用PCR方法将此段序列去除,得到截短的木聚糖酶序列xyn-m。用相同方法构建高效表达XYN-M蛋白的毕赤酵母工程菌株,表达产物经纯化后进行酶学性质测定, 结果表明, 其比活为19 856.6 IU/mg, Kcat值为4 433.8 s-1,与纯化的XYN-W蛋白(比活性13 795.3 IU/mg、Kcat值2 717.1 s-1)相比,分别提高了43.9%和63.2％。 相似文献
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通过构建硫色曲霉酸性木聚糖酶基因xynA串联双拷贝工程菌,提高酶的发酵活力。10 L发酵罐中,双拷贝菌株发酵活力达3 574 U/mL。重组木聚糖酶的最适催化温度为50℃,最适反应pH为2.2~3.4,在pH 1.7的酸性缓冲液下保持100 min,酶活残留70%以上。重组木聚糖酶对胃蛋白酶和胰蛋白酶也具有较好的耐受性。该木聚糖酶在低pH条件下的高催化活性、耐酸性及蛋白酶耐受性,使之具有较好的应用前景。通过体外模拟猪胃肠道环境以快速评价重组酶的作用效果。试验以小麦型日粮作为基础日粮,设计4个处理组,重组酶的添加量分别为0 U/kg、2 000 U/kg、4 000 U/kg和6 000 U/kg,每个处理5个重复,使用SDS\|Ⅱ单胃动物仿生消化系统模拟猪的胃肠道环境消化试验日粮,消化后的残渣烘干后测定其总能、粗蛋白质、中性洗涤纤维含量以计算其消化率。结果表明,添加重组酸性木聚糖酶显著提高了总能、粗蛋白质（线性和二次;P<0.01）和中性洗涤纤维的消化率（线性和二次;P<0.05）。重组酶的最适宜添加量为4 000 U/kg。 相似文献
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漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,在有机农药残留和木质素的降解方面具有潜在的工业价值。从特异腐质霉Y1(Humicola insolens Y1)中分离到了漆酶基因Lac1,其全长1 803 bp,编码600个氨基酸,与NCBI蛋白数据库比对结果表明,与来源于Chaetomium globosum CBS 148.51(XP_001228806)的多酚氧化酶序列相似性最高为71%,表明是一个新的漆酶基因。将其克隆入毕赤酵母表达载体pPIC9r中,通过PCR和SDS-PAGE检测证实基因已经整合入酵母基因组中且能分泌表达。在3 L发酵罐中,重组Lac1蛋白表达量达到3.79mg/mL发酵液,酶活性达到1.3 U/mL发酵液。酶学性质分析结果显示,漆酶的最适作用温度为65℃,最适反应pH为4.5,且在pH 6～11的范围内酶的相对活力均在70%以上。 相似文献
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利用简并PCR和TAIL PCR从嗜热特异腐质霉Humicola insolens Y1中克隆得到一个新的耐热型木聚糖酶基因xynD。该基因全长1 104 bp, 共编码367个氨基酸，不含有内含子，N端的22个氨基酸为信号肽。成熟蛋白在毕赤酵母中进行了重组表达，重组蛋白经超滤和离子交换柱纯化后达到电泳纯。对其酶学性质分析表明，XynD的最适pH为6.0，在pH 4.0～7.0可以保持80%以上的酶活性，在pH 5.0～10.0具有良好的pH稳定性。最适作用温度为70℃，在60℃条件下保持稳定。多数金属离子对XynD酶活力没有明显的影响。麦芽汁降解实验表明，XynD与商用β 葡聚糖共同作用可以提高麦芽的过滤速率(45.7％)并降低粘度(81％)。因此XynD在酿酒业，特别是啤酒制造业具有潜在的应用价值。 相似文献
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鸡β防御素1在鸡防御系统中起重要作用,为实现其在真核细胞中的表达,本研究利用RT PCR从狼山鸡法氏囊中扩增出鸡β防御素1成熟肽基因,同时参照酵母密码子的偏好性,设计合成Gal 1成熟肽片段新基因,并在其3′端添加6×His序列以检测鸡β防御素1的表达情况,分别构建分泌型表达载体pPIC9K-Gal-1和pPIC9K-Gal-1-a-His,线性化后电转化导入毕赤酵母菌株GS115,G418抗性筛选高拷贝转化子,阳性克隆用甲醇诱导,Tricine SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定表达上清液。结果表明,从狼山鸡法氏囊中扩增出鸡β防御素1成熟肽基因,其序列与GenBank登录号AF033335的序列同源性为100%;Gal-1和Gal-1-a-His基因均成功整合到毕赤酵母基因组中,重组酵母蛋白Gal-1-His获得了成功表达。本研究为后续鸡β防御素1的高效表达和生物学活性研究奠定了基础。 相似文献
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[目的]利用毕赤酵母分泌表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）。[方法]以酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）基因组DNA为模板,通过PCR扩增出S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因2（sam2）,构建重组毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体pPIC9Ks-am2,转化毕赤酵母GS115,以甲醇诱导表达分泌蛋白SAM合成酶,并用HPLC测定重组蛋白的酶活力。[结果]经SDS-PAGE鉴定重组蛋白分子量约50kD,比理论值42.5 kD稍大,可能是分泌过程中糖基化等加工造成。体外酶促反应结果显示,伴随甲醇诱导及初步纯化过程的进行,蛋白活力逐步提高,纯化后比活力为61.48 U/mg。[结论]该研究首次实现了SAM合成酶的胞外表达,为开发和建立体外酶促法生产SAM工艺奠定了基础。 相似文献
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黑曲霉木聚糖酶基因xynA的克隆及真核表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
从黑曲霉(Aspergillus niger)GI M3.452中克隆得到木聚糖酶基因xynA的成熟肽编码序列。通过重叠延伸PCR将不带原基因信号肽编码序列的xynA基因片段和猪腮腺分泌蛋白(parotid secretory protein,PSP)基因的信号肽进行拼接得到融合片段SPA,并将其克隆到真核表达载体pcDNA6/HisTMA中,得到重组质粒pcDNA-SPA,重组质粒经过酶切、测序鉴定其读码框的正确性,在脂质体介导下将重组质粒pcDNA-SPA转染猪肾细胞(PK15),通过RT-PCR证实其在PK15细胞中表达,并在细胞培养液中检测到木聚糖酶活性为7.6I U/mL。 相似文献
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根据GenBank中已公布的编号为AAB2200的Exendin-4氨基酸片断,及酵母密码子偏好性,设计了Exendin-4在酵母中的表达序列。利用基因工程技术,将编码Exendin-4的蛋白基因亚克隆到含有分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达栽体pPIC9K-E4。用电转化法将线性化的pPIC9K-E4转化入毕赤酵母菌株GSll5,转化子经MD平板筛选,得到的阳性菌株再用浓度梯度递增的G418筛选多拷贝重组子。将MM和MD平板筛选得到Muts菌株用甲醇诱导表达6d,每隔24h取样。Tricine-SDS-PAGE检测结果显示,诱导后第6天表达量达到最高。 相似文献
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【目的】通过构建毕赤酵母工程菌株,以期获得重组海藻酸裂解酶,并对其性质加以研究。【方法】采用PCR的方法,以铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）基因组DNA 为模板,克隆出约1.0kb的海藻酸裂解酶基因algL的成熟蛋白编码序列,并将其插入巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K-algL。重组质粒线性化后用聚乙二醇（PEG）法导入毕赤酵母菌株GS115中表达。【结果】用甲醇诱导培养基进行摇瓶发酵,表达得到40 kD的目的蛋白,酶活力达540 U•ml-1左右。经测定,该重组酶的最适反应pH为8.5,最适反应温度为40℃,并且在20～45℃,pH 3.0～12.0具有较好的稳定性。50 mmol•L-1的Co2+和Ca2+对酶活力均有显著的促进作用,Zn2+、Cu2+和Fe2+在不同浓度下对酶活力均有不同程度的抑制作用。在重组酶的辅助作用下,抗生素的抑菌效果明显提高。【结论】用重组毕赤酵母可高效表达外源海藻酸裂解酶,为其今后在工农业中的应用奠定了基础。 相似文献
15.
利用PCR技术从毛果杨(Populus trichocarpa)中分离得到1条丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PtrSPI,该基因cDNA编码区全长为1176 bp,可编码391个氨基酸。BlastP预测结果显示,该丝氨酸蛋白酶抑制剂属于SERPIN超家族。多序列比对结果表明,毛果杨PtrSPI基因的氨基酸序列与已报道的胡杨(P.euphratica)丝氨酸蛋白酶抑制剂氨基酸序列XP_011030699同源性最高,相似性为92%,且蛋白的C端氨基酸序列都含有高度保守的反应中心环(RCL)。在此基础上,成功构建了PtrSPI基因的重组真核表达载体pPICK-PtrSPI并获得了重组毕赤酵母菌株GS115-PtrSPI。利用终质量分数为0.5%甲醇诱导重组真核蛋白表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在42648.45处出现了重组蛋白,与预期值一致。 相似文献
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毕赤酵母是使用最广泛、最具有发展前景的异源蛋白表达系统之一。在毕赤酵母GS115中实现了来源于棉铃虫(Helicoverpa armigera)葡萄糖氧化酶基因hagox的异源表达。以棉铃虫hagox基因连接pPICZαA质粒构建重组表达载体,电击转化毕赤酵母GS115H菌株后得到含有hagox基因的重组酵母菌株。通过平板显色、酶活力测定和SDS-PAGE分析,重组酵母中HaGOX成功表达。HaGOX含606个氨基酸,理论分子量66.9 kD,预测等电点pH 4.78。经测试重组HaGOX的最适pH为6.0～7.0,最适温度为40℃,对6-脱氧-葡萄糖和D-葡萄糖具有高催化活力,以D-葡萄糖为底物的比活力为13.63 U·mg~(-1),对其他吡喃糖和二糖没有催化活力。 相似文献
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为探讨前导区对米曲霉碱性蛋白酶基因在毕赤酵母中表达的必要性,本试验首先将米曲霉碱性蛋白酶的成熟肽编码基因(alp-m)和表达载体pPIC9K双酶切后连接,得到重组表达载体pPIC9K/alp-m.然后将其线性化后电转化毕赤酵母GS115.筛选阳性转化子进行甲醇诱导表达,并进行SDS-PAGE分析和碱性蛋白酶活力测定,同时在转录水平上对目的基因进行了Northern blot检测.将得到的结果与以前研究中得到的带有前导区的米曲霉碱性蛋白酶成熟肽基因在毕赤酵母中的表达结果进行对比.结果表明:如果没有前导区,米曲霉碱性蛋白酶成熟肽基因在毕赤酵母中表达,无论在胞内和胞外均检测不到目的蛋白.由此可见,米曲霉碱性蛋白酶基因在毕赤酵母中表达时必须有前导区的参与. 相似文献
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米黑根毛霉脂肪酶RML是一种重要的工业用酶,具有非常广泛的应用前景。本研究将人工合成的RML基因rml克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建pPIC9K-rml诱导型表达载体。表达载体经线性化后转化巴斯德毕赤酵母GS115,并使用抗生素G418筛选、三丁酸甘油酯-MM板及PCR方法筛选阳性重组工程菌。工程菌发酵液经SDS-PAGE分析、三丁酸甘油酯板鉴定,表明脂肪酶RML在毕赤酵母中获得高效表达,且蛋白分子大小与预期一致。进一步优化了发酵条件,包括对培养基组分、诱导剂浓度和发酵温度等的优化。优化后的培养基组成为：甘油4.0%,（NH4）2SO45.000 g/L,CaSO40.465 g/L,K2SO49.100 g/L,MgSO4.7H2O7.450 g/L;培养条件为：pH值6.0,生长阶段温度30℃,诱导阶段采用22℃低温诱导,诱导期每24 h补加甲醇浓度为3%。优化后,发酵液中的RML活力最高达到116 U/ml,比优化前提高了3.14倍。 相似文献
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以微小毛霉基因组为模板,PCR扩增得到凝乳酶结构基因,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,连接穿梭载体pPIC9K,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,并测定其核苷酸序列。测序结果证实扩增得到的片段为凝乳酶基因,与GenBank报道的序列（No.X06219）存在6对碱基的区别。将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,构建重组菌P.pastorisGS115/pPIC9K-m cp,通过筛选得到抗G418浓度达到3.0 mg/m l、具有多拷贝基因的整合重组菌pPIC9K-m cp-03。用甲醇诱导进行初步发酵试验,测得该重组菌凝乳酶活力为5 660 U/m l,比微小毛霉发酵液提高50多倍,且发酵液电泳结果表明毕赤酵母自身分泌的蛋白很少,只能看到约38.5 ku的凝乳酶蛋白条带。 相似文献
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葡萄糖氧化酶(GOX)已广泛应用于各种工业生产中。目前,除了曲霉和青霉属来源的GOX外,鲜有新型GOX被报道。经基因克隆和序列同源性分析,Cladosporium tianshanense SL19来源的葡萄糖氧化酶基因CtgoxB是一个新基因,该基因全长1 707 bp,无内含子,编码568个氨基酸,N-端第1～16个氨基酸为信号肽,与已报道的GOX序列最高一致性为35%。CtgoxB在毕赤酵母中实现异源表达,但重组蛋白CtGOXB未检测到GOX活性。通过序列和结构分析,同源重组构建的突变体CtGOXB-C1最终恢复了GOX活性。经SDS-PAGE鉴定,重组蛋白CtGOXB-C1表观分子量约为120 kDa,大于理论分子量(61.6 kDa)。经酶学性质测定,CtGOXB-C1比活为123.8 U/mg,在pH 8.0和30℃条件下具有最高的酶活,且在10℃时依然维持65%的酶活,具有嗜低温特性。CtGOXB-C1在pH 6.0～9.0条件下保温1 h后,剩余酶活维持在80%以上,可以在中碱性条件下维持较高酶活,并且对表面活性剂SDS具有较强的抗性。这些性质表明CtGOXB-C1在水产饲料和洗涤剂等行业中具有良好的应用潜力。 相似文献