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1.
为了实现牛支原体p30蛋白在大肠杆菌中的高效表达,试验根据GenBank发表的p30(登录号为AIA33998.1)基因序列,在不改变p30蛋白氨基酸序列的情况下优化基因序列,全基因合成p30基因,并将其克隆到pET28a(+)载体中,构建的重组质粒pET28a(+)-p30转化至BL21(DE3)工程菌中进行诱导表达,筛选重组菌pET28a(+)-p30/BL21(DE3)诱导表达的最适诱导温度、诱导时间及IPTG诱导浓度,利用His-tag镍柱纯化p30重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:当重组菌株pET28a(+)-p30/BL21(DE3)诱导条件为37℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L、诱导4 h时,p30蛋白表达量最高;SDS-PAGE电泳显示经镍柱纯化后p30蛋白达到了电泳纯,经Western-blot分析,目的蛋白具有抗原特异性,在36 ku处有明显的蛋白印迹条带,与预期大小相符。说明成功实现了在大肠杆菌中高效表达牛支原体p30重组蛋白。 相似文献
2.
为了实现牛支原体P33蛋白在大肠杆菌中的高效表达,试验在不改变P33蛋白氨基酸序列的情况下,根据GenBank发表的P33基因序列(登录号为AIA33909.1)设计并合成特异性引物,利用PCR法扩增P33基因,进行双酶切并将基因片段克隆到pET28a(+)载体中,构建重组质粒pET28a(+)/P33,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后进行原核表达,再利用His-tag镍柱纯化P33重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:成功扩增得到牛支原体P33基因,其核苷酸序列长度为710 bp,重组菌株在温度为30℃、以0.5 mmol/L IPTG诱导12小时时,P33蛋白表达量最高;经His-tag镍柱纯化后P33蛋白在33 ku处有明显的蛋白印迹条带,与预期大小相符。说明成功实现了在大肠杆菌中表达牛支原体P33重组蛋白。 相似文献
3.
马尔堡病毒核蛋白的原核表达及纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
目的以原核表达的方式获得了马尔堡病毒的核蛋白,并纯化。方法将马尔堡病毒核蛋白基因亚克隆到原核表达质粒pET-28(a)中,构建重组表达质粒pET-28(a)-M-NP,并将重组质粒用热休克方法转化BL21(DE3)感受态细菌,用IPTG诱导蛋白表达后,以SDS-PAGE分析表达形式及表达量,并利用His-Band Ni+柱纯化。结果成功构建重组表达质粒pET-28(a)-M-NP,以1.0mmol/L终浓度的IPTG在37℃诱导表达5h后,破菌沉淀中有目的蛋白表达。结论成功表达并纯化了马尔堡病毒的核蛋白,为后续研究奠定了基础。 相似文献
4.
《中国兽医学报》2016,(10):1680-1685
利用RT-PCR方法扩增出牛呼吸道合胞体病毒(BRV)核蛋白基因(N)中1 176bp的特异性片段,将目的片段定向克隆到pET-32a(+)原核表达载体,转化BL21(DE3)表达菌;经IPTG进行诱导,并探讨IPTG浓度、诱导时间对重组蛋白的影响。表达的大肠杆菌超声破碎后,沉淀物用含有1%TritonX-100的PBS溶液洗去膜碎片和膜蛋白。在尿素变性条件下,用镍柱亲和层析法纯化NP包涵体,并通过梯度透析方法进行透析复性,Western blot检测目的蛋白的反应原性。结果显示,酶切和测序成功构建阳性重组质粒,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导后发现该重组蛋白主要以包涵体形式存在于细菌中,大小约为60 000,最佳诱导条件为0.000 8 mol/L IPTG诱导4h。通过BCA法测定镍柱纯化的N蛋白质量浓度为0.534g/L,复性后质量浓度为0.397g/L。Western blot检测表明N蛋白具有反应原性。结果表明,在大肠杆菌中成功表达并纯化出N蛋白,并通过复性获得具有反应原性的N蛋白,为N蛋白下一步的应用奠定基础。 相似文献
5.
《中国兽医学报》2019,(8):1506-1512
通过PCR扩增裂谷热病毒(RVFV) Gn蛋白胞外区(eGn)基因,连入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-RVFV-eGn。将重组质粒转化至感受态BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,经HisTrap~(TM)FF蛋白纯化柱纯化目的蛋白。将目的蛋白免疫BALB/c小鼠,分离小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体,免疫荧光鉴定制备的单克隆抗体特性。结果显示,PCR扩增出1 287 bp的目的基因;构建的重组质粒转化BL21细胞后可有效表达目的蛋白,确定最佳表达条件为30℃,0.8 mmol/L IPTG诱导5 h,目的蛋白以包涵体形式表达;纯化后目的蛋白纯度为94.136%;制备的单克隆抗体可特异性识别哺乳动物细胞表达的Gn蛋白,表明RVFV eGn蛋白具有良好的免疫原性。研究结果为裂谷热新型疫苗和快速诊断试剂的研制奠定基础。 相似文献
6.
为原核表达H3N2亚型犬流感病毒(CIV)HA1蛋白,本研究利用特异性引物扩增CIV H3分离株的HA1基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。再将其亚克隆于pET-32a(+)中构建重组表达质粒pET-HA1。将该质粒转化于大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约为58 ku。纯化的HA1蛋白经western blot和Dot-ELISA鉴定表明,表达的重组HA1蛋白可以与H3N2亚型CIV阳性血清发生特异性反应。 相似文献
7.
根据GenBank中H5N1亚型禽流感病毒RNA聚合酶PB1基因序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增H5N1亚型禽流感病毒的PB1_P基因,克隆到原核表达载体pET-28a载体中,经PCR、酶切和测序分析后,鉴定出阳性重组子。将阳性质粒pET-28a/PB1_P转化大肠杆菌BL21（DE3）,用0.5 mol/L IPTG,在37 ℃诱导表达4 h,经SDS PAGE和Western blot检测,获得重组蛋白PB1_P表达。并经Ni-NTA柱亲和层析与柱层析纯化表达蛋白,采用悬滴气相扩散法对纯化蛋白进行结晶。结果成功构建pET-28a/PB1_P重组质粒,SDS-PAGE结果显示重组蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,Western-blot证明表达的融合蛋白具有良好的免疫原性,经蛋白纯化、初筛结晶,得到PB1_P重组蛋白初筛晶体,为深入研究流感病毒聚合酶的生物学功能、开发新型H5N1亚型禽流感病毒检测试剂盒奠定了良好的基础。 相似文献
8.
利用PCR技术扩增获得C型口蹄疫病毒VP1基因,将其克隆到原核表达载体pET-30α(+)上,构建重组表达质粒pET-VP1。质粒pET-VP1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导VP1基因的表达,收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE、Western blot分析,结果得到分子量约为33 ku的目的条带,表达产物占菌体总蛋白的35%,且该目的条带能被C型FMDV阳性血清识别,说明VP1基因在大肠杆菌中得到高效表达。融合表达蛋白经镍柱纯化,重组蛋白纯度达90%以上。 相似文献
9.
《黑龙江畜牧兽医》2020,(6)
为了获得可初步鉴别诊断疫苗免疫和自然感染的蓝舌病病毒(BTV)抗原,试验将8型BTV S10基因中NS3蛋白对应的开放阅读框(ORF)克隆到原核低温诱导表达载体pColdⅠ中,构建重组表达质粒pCold-NS3,然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,通过对IPTG浓度和诱导温度条件优化,确立重组蛋白NS3最佳表达条件,通过镍柱纯化后用Western-blot和间接ELISA鉴定其免疫活性。结果表明:成功构建了pCold-NS3重组质粒,重组菌株在温度为15℃、以1.0 mmol/L IPTG诱导24 h时重组NS3蛋白表达量最高,分子质量约为29 ku;纯化后的重组蛋白能与BTV自然感染阳性血清和His-tag单克隆抗体发生特异性结合。说明成功获得了具有良好反应原性的BTV重组NS3蛋白。 相似文献
10.
《中国兽医学报》2017,(11):2114-2120
原核表达并纯化委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)E2蛋白胞外区,并以此为抗原免疫动物制备多克隆抗体。利用PCR扩增VEEV E2蛋白胞外区基因并将其插入到原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达。优化诱导条件并对目的蛋白进行亲和纯化,用纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光方法检测抗体的结合能力。通过PCR扩增出约为1 023bp的VEEV E2基因胞外区,成功构建重组表达质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,在37℃,0.6mmol/L IPTG诱导3h条件下目的蛋白表达量最高且主要以包涵体形式存在;将纯化的目的蛋白免疫BALB/C小鼠成功制备了抗VEEV E2蛋白胞外区鼠源多克隆抗体,经间接免疫荧光鉴定制备的抗体能够特异性识别真核表达的VEEV E2蛋白。VEEV E2基因胞外区在大肠杆菌中获得稳定表达,且表达的目的蛋白具有良好的免疫原性,为VEEV快速诊断方法及新型疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
11.
【目的】对华南地区分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)流行株NP蛋白进行原核表达,制备H9N2亚型AIV NP蛋白多克隆抗体。【方法】将1株H9N2亚型AIV的NP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建NP蛋白原核表达质粒。将重组质粒同时转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白。通过考马斯亮蓝染色和Western blotting分析并比较NP蛋白在两种表达菌中的表达量,进一步优化诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等条件,提高蛋白的表达效率。采用镍柱亲和层析法对NP蛋白进行纯化,用BCA法测定蛋白浓度。以纯化的NP蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光对所制备的多克隆抗体进行鉴定,通过间接ELISA测定抗体效价。【结果】试验成功构建pET-32a-H9N2-NP原核表达质粒并表达重组NP蛋白。考马斯亮蓝染色和Western blotting结果均表明,重组NP蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达水平远高于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,其大小约73 ku。诱导条件优化结果显示,重组NP蛋白在37 ℃、IPTG终浓度为1 mmol/L诱导7 h时的表达量最大,且通过镍柱纯化后得到纯度较高的重组蛋白。Western blotting和间接免疫荧光结果均表明,所制备的多克隆抗体能高效地与H9N2亚型AIV发生特异性结合。间接ELISA测得多克隆抗体的效价为1∶409 600。【结论】本研究制备的兔抗NP蛋白多克隆抗体效价较高,表明NP蛋白具有良好的免疫原性,为今后NP蛋白单克隆抗体的制备和ELISA检测方法的建立奠定了基础。 相似文献
12.
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提取猪日本脑炎病毒(JEV)上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,RT-PCR扩增JEV的NS3基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,酶切鉴定和PCR鉴定重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3,转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组His-JEV-NS3蛋白,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达,his-band试剂盒纯化重组蛋白。获得了1.8kb NS3基因片段,成功构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3。IPTG诱导获得分子质量为64ku的His-JEV-NS3蛋白,该蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占总菌体蛋白的30%以上,纯化后获得高纯度重组蛋白,其占总蛋白比例达70%以上。 相似文献
14.
鸡生长激素的原核表达、纯化及活性研究 总被引：1，自引：0，他引：1
鸡生长激素(cGH)是由脑垂体前叶合成并分泌的一种重要的多肽类激素,对于鸡的生长发育具有至关重要的调控作用。为实现cGH的原核表达,将其序列插入原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a-cGH,并转化大肠杆菌BL21(DE3),挑选阳性菌落液体培养IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测显示,诱导产物在25 ku处含有与预期大小一致的蛋白条带;通过镍柱纯化,得到了较高纯度的cGH重组蛋白;用纯化得到的cGH重组蛋白处理鸡肝癌LMH细胞,检测其IGF-Ⅰ基因mRNA水平上调,证明所得到cGH蛋白具有生物学活性。研究结果为进一步研究cGH的结构、功能和生产应用奠定了基础。 相似文献
15.
《中国兽医杂志》2014,(7)
从乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472基因组中PCR扩增usp 45基因,与pMD-18T载体连接获pT-usp 45质粒;酶切鉴定并测序正确后,将usp 45基因克隆入原核表达载体pET-28a,获重组质粒pET-28a-usp 45,转入E.coli BL21(DE3);经IPTG诱导表达及镍亲和层析纯化,由SDS-PAGE和Westren blot进行鉴定。结果表明,本试验获得1 371 bp长度的usp 45基因,构建pET-28a-usp 45质粒,诱导表达并纯化分子量约50 kDa的目的蛋白,为进一步研究usp 45蛋白奠定基础。 相似文献
16.
【目的】制备双峰驼亲环素A(cyclophylin A,Cyp-A)的多克隆抗体,为揭示双峰驼体内的黏膜免疫反应机理提供依据。【方法】从GenBank数据库中双峰驼Cyp-A基因序列(登录号：XM＿010969543.1)上选取编码区,截取不含信号肽的膜外序列进行碱基优化后,与pET-28a(+)载体连接构建重组质粒pET-28a-Cyp-A。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达并对表达条件进行优化,优化诱导条件后通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达情况。纯化重组蛋白并免疫家兔,制备兔抗双峰驼Cyp-A多克隆抗体,分别使用ELISA和Western blotting检测抗体效价及特异性,并采用HE和SABC免疫组化染色法对Cyp-A多克隆抗体进行定位观察。【结果】重组质粒pET-28a-Cyp-A主要以包涵体形式表达,Cyp-A蛋白约为17 ku,最佳诱导条件为0.7 mmol/L IPTG诱导8 h,杂蛋白最佳洗脱液为5 mmol/L咪唑。经ELISA和Western blotting检测,兔抗双峰驼Cyp-A多克隆抗体的效价为1∶64 000,能... 相似文献
17.
《中国动物传染病学报》2016,(3)
采用PCR方法扩增犬瘟热病毒N基因,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建犬瘟热N基因原核表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达重组N蛋白。从包涵体中纯化重组蛋白,制备多克隆抗体,采用Western blot检测其特异性。结果显示PCR扩增得到犬瘟热N基因,重组N蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到表达,制备的多克隆抗体能与N蛋白特异性反应。 相似文献
18.
为制备结核分枝杆菌(Mtb) rv3036c基因的多克隆抗体,本研究以Mtb强毒株H37Rv基因组DNA为模板,扩增rv3036c基因,克隆至表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-rv3036c,并转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L IPTG诱导表达组氨酸标签融合蛋白Rv3036c,采用Ni-NTA His-Bind Resin纯化目的蛋白,经western blot验证纯化蛋白.将Rv3036c蛋白纯化产物免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.SDS-PAGE和western blot分析结果表明,Rv3036c以可溶形式表达,蛋白分子量大小为28 ku,并且具有良好的免疫原性.以上结果为进一步研究rv3036c基因在Mtb的致病性作用奠定了基础. 相似文献
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《中国畜牧兽医》2016,(12)
为制备新型鸭呼肠孤病毒(new-type duck reovirus,NDRV)XX株σB蛋白的多克隆抗体,试验经RT-PCR扩增NDRV XX株σB基因编码序列,构建原核表达质粒pET-32a(+)-σB,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,经IPTG诱导获得His-σB重组蛋白。SDS-PAGE显示成功表达出约55ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,其表达时的最佳诱导时间、IPTG诱导浓度分别为3h和0.25mmol/L。经Ni 2+柱亲和层析纯化获得可溶性重组蛋白,将蛋白经Western blotting和蛋白质谱鉴定为高纯度的σB重组蛋白,将纯化后σB重组蛋白按合理免疫程序免疫家兔,获得多抗隆抗体经Western blotting分析显示出特异性的反应。本试验结果为NDRVσB蛋白功能的深入研究及基因工程疫苗的研发奠定了基础。 相似文献