共查询到20条相似文献，搜索用时 953 毫秒
1.
南方水稻黑条矮缩病毒S6编码一个沉默抑制子 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】分析南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）基因组S6编码的SP6蛋白的抑制子活性,明确SRBSDV是否编码RNA沉默抑制子来干扰植物的沉默。【方法】将分别含有SP6与GFP质粒的农杆菌共浸润转GFP基因的16c本氏烟纯合系,观察SP6对局部沉默和系统沉默的抑制作用;将含有SP6,GFP和dsGFP质粒的农杆菌三者共浸润,观察SP6对由dsRNA引起的沉默的抑制作用;在同一植株不同部位接种GFP和SP6,观察SP6对RNA沉默信号传导的影响;通过马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）在本氏烟上表达SP6,观察SP6是否能增强PVX的致病性。【结果】SP6能抑制由GFP正义RNA介导的沉默,但其抑制作用较弱,仅能延缓局部沉默和系统沉默的产生。SP6能灭活RNA沉默信号,阻止沉默信号的长距离传导,回复GFP的沉默,但不能抑制由dsRNA引起的沉默。利用PVX在本氏烟上表达SP6能增强PVX的致病性。【结论】SP6是病毒编码的RNA沉默抑制子,在RNA沉默的起始和信号传导阶段起作用。 相似文献
2.
采集安徽马鞍山水稻条纹叶枯病感病稻株,TRIzol法提取样本总RNA,设计特异性引物进行RT-PCR扩增,获得水稻条纹病毒(RSV)安徽分离物的RNA3部分片段,克隆并测序。序列分析表明,该片段全长874 nts,含有完整的NS3基因,NS3基因序列长度为636 nts,编码211个氨基酸。序列比对发现,RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市RSV分离物NS3基因间的序列相似性高达97.6%～99.4%,而与RSV云南分离物NS3基因间的序列相似性相对较低,为93.4%～95.4%。构建RSV NS3基因系统关系树,发现RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市8个RSV分离物NS3基因聚成一个单独的分支,说明华东各省市各个RSV分离物亲缘关系最近。将RSV安徽分离物NS3基因插入植物表达载体pBIN438,构建重组植物表达载体pBIN-NS3并转化农杆菌。将含pBIN-NS3的农杆菌和含pBIN-GFP的农杆菌共浸润16c本氏烟叶片,6天后紫外灯下观察发现,共浸润区表现出强烈的绿色荧光,说明16c本氏烟GFP基因局部沉默被抑制,可以初步证明RSV安徽分离物编码的NS3蛋白是一个RNA沉默抑制子。 相似文献
3.
采集安徽马鞍山水稻条纹叶枯病感病稻株,TRIzol法提取样本总RNA,设计特异性引物进行RT-PCR扩增,获得水稻条纹病毒（RSV）安徽分离物的RNA3部分片段,克隆并测序。序列分析表明,该片段全长874 nts,含有完整的NS3基因,NS3基因序列长度为636 nts,编码211个氨基酸。序列比对发现,RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市RSV分离物NS3基因间的序列相似性高达97.6%～99.4%,而与RSV云南分离物NS3基因间的序列相似性相对较低,为93.4%～95.4%。构建RSV NS3基因系统关系树,发现RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市8个RSV分离物NS3基因聚成一个单独的分支,说明华东各省市各个RSV分离物亲缘关系最近。将RSV安徽分离物NS3基因插入植物表达载体pBIN438,构建重组植物表达载体pBIN-NS3并转化农杆菌。将含pBIN-NS3的农杆菌和含pBIN-GFP的农杆菌共浸润16c本氏烟叶片,6天后紫外灯下观察发现,共浸润区表现出强烈的绿色荧光,说明16c本氏烟GFP基因局部沉默被抑制,可以初步证明RSV安徽分离物编码的NS3蛋白是一个RNA沉默抑制子。 相似文献
4.
以GFP为报告基因构建植物表达载体pCB302-3-GFP,采用农杆菌叶片注射法对其在本氏烟叶片中瞬时表达条件进行优化。分析基因沉默抑制子p19、菌液不同浓度以及侵染时间对GFP荧光强度的影响,结果显示,当农杆菌菌液D600为0.8~1.0并与含有p19基因的载体共注射条件下,农杆菌注射3~5d后本氏烟草叶片表现出很强的绿色荧光,实现了GFP在本氏烟草中的高效瞬时表达。 相似文献
5.
辣椒疫霉(Phytophthora capsici)是一种重要的病原卵菌,能产生大量的RxLR效应分子帮助病原菌定殖。前期实验证明RxLR504效应分子能够抑制INF1引发的细胞死亡,并证实囊泡分选蛋白(VPS)与其相互作用。本文借助VIGS tool在线工具设计靶标基因沉默片段;利用烟草脆裂病毒(TRV)介导的基因沉默技术(VIGS)沉默本氏烟靶标基因;提取沉默样品叶片组织RNA,构建c DNA文库;利用qRT-PCR检测靶标基因表达水平;在沉默植株叶片上表达RxLR504,24 h后接种INF1,观察病斑症状。结果表明:本氏烟中设计沉默片段长度为300 bp,构建c DNA文库质量较高;荧光定量PCR结果显示,沉默植株中靶标基因表达水平下降86.2%,与对照相比差异性显著;接种实验证明RxLR504在沉默植株与对照植株上均能抑制INF1引发的细胞死亡。RxLR504与VPS互作不影响其抑制INF1引起的细胞坏死,为进一步揭示病原物利用植物靶标基因抑制植物免疫从而促进自身寄生的机制打下基础。 相似文献
6.
以番茄斑驳花叶病毒(Tomato mottle mosaic virus, ToMMV)外壳蛋白(Coat protein, CP)为研究对象,通过荧光素酶互补技术(Luciferase complementation imaging assay, LCI)研究ToMMV CP与本氏烟组蛋白H4在植物体内的互作情况。亚细胞共定位结果显示,ToMMV CP定位于细胞核和细胞质中,组蛋白H4定位于细胞核中,两者共定位于细胞核中。双分子荧光互补(BiFC)试验结果表明,ToMMV CP与组蛋白H4的互作位置主要在细胞核中。上述2种试验结果证明,烟草花叶病毒CP与本氏烟组蛋白H4在植物体内存在互作。采用病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)技术沉默本氏烟烟草中的H4基因,对沉默H4基因的植株接种ToMMV,接种后第4 d,通过实时荧光定量PCR检测方法检测系统叶的病毒含量,发现病毒含量显著低于对照组,结果表明H4基因的沉默会影响ToMMV在植株中的复制,组蛋白H4可能是ToMMV侵染植株的本氏烟感病因子。病毒编码的CP可能与寄主组蛋白H4在细... 相似文献
7.
[目的]从烟草cDNA中扩增出1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因(去除终止密码子TAA),并对其进行亚细胞定位分析。[方法]利用RT-PCR技术分离、克隆DXS,将烟草DXS基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因重组构建亚细胞定位表达载体,转入根癌农杆菌LBA4404后注射侵染本氏烟烟草幼苗进行瞬时表达;并利用激光共聚焦扫描显微镜观察转GFP植株的表达情况。[结果]显微镜观察发现,DXS和GFP融合蛋白仅在本氏烟叶肉细胞(尤其是保卫细胞)的叶绿体中产生绿色荧光,DXS基因在叶绿体中特异表达。[结论]DXS定位在叶绿体中,为接下来对DXS基因功能研究提供了理论依据。 相似文献
8.
小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)隶属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)大麦黄花叶病毒属(Bymovirus),其基因组由两条正义单链RNA组成,共编码10个蛋白。先前的研究表明,马铃薯Y病毒组多种病毒编码的保守蛋白P3具有多种功能,在病毒复制、致病性、克服宿主抗性、细胞间移动等方面均具有重要作用,而P3在大麦黄花叶病毒属中是否有类似功能目前还未见报道。本研究利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的本氏烟基因沉默系统,明确了WYMV的P3碳端在本氏烟上具有致病功能域P3-C,但完整的P3则不具有致病能力。进一步移码突变研究表明,P3-C的致病性是由其编码的多肽引起的,而非病毒来源的小干扰RNA介导的宿主基因沉默。同时P3-C的两个跨膜结构域对致病性具有重要作用,单独表达任何一个跨膜结构域P3-C均不能在本氏烟上引起明显症状。 相似文献
9.
【目的】通过分析发现木尔坦棉花曲叶病毒（cotton leaf curl Multan virus,CLCuMuV）C4开放阅读框（open reading frame,ORF）附近可编码3个不同大小的蛋白,而NCBI数据库登录的CLCuMuV各个分离物编码的C4蛋白大小也不尽相同,本研究试图通过分析该3个假定的“C4 ORF”编码蛋白对病毒致病性的影响,以明确CLCuMuV C4蛋白ORF的确切定位。【方法】根据双生病毒编码蛋白的保守性,在CLCuMuV C4 ORF附近查找到3个大小不等的ORF,分别标记为C4-L（567 nt）、C4-M（546 nt）和C4-S（303 nt）。利用同源重组的方法将该3个ORF分别构建到PVX异源表达载体,通过农杆菌介导的植物接种法,分析PVX介导的3个蛋白在本氏烟表达对本氏烟症状的影响。利用同源重组的方法构建CLCuMuV野生型及C4-L或C4-S缺失突变型的侵染性克隆,同样通过农杆菌介导的植物接种法,分别与其伴随DNA-β分子的侵染性克隆接种本氏烟,分析C4-L或C4-S缺失对CLCuMuV致病性的影响,并利用Southern blot和Western blot分别对接种烟草的病毒基因组的积累量和病毒C4蛋白的表达量进行分析。同时利用Gateway系统载体对C4-L和C4-S蛋白在本氏烟叶片表皮细胞中的亚细胞定位进行分析。【结果】PVX异源表达载体接种本氏烟,结果发现PVX-C4-L和PVX-C4-S接种的本氏烟叶片卷曲、叶柄伸长,并且PVX-C4-S症状更重,而PVX-C4-M接种的本氏烟症状较轻或基本无症状,Western blot试验也在PVX-C4-L和PVX-C4-S接种组检测到了C4蛋白的表达,说明C4-S ORF编码的蛋白对PVX异源病毒的致病性影响最大。侵染性克隆接种本氏烟,结果发现野生型（CLCuMuV）和C4-L突变型（CLCuMuV-ΔL）接种的本氏烟叶片皱缩增生、叶柄和茎秆扭曲,而C4-S突变型（CLCuMuV-ΔS）和对照组（Mock）接种的本氏烟未显示任何症状,并且前两者的植株高度明显矮于后两者,同时Southern blot试验在CLCuMuV和CLCuMuV-ΔL接种的本氏烟中均检测到大量病毒基因组的积累,而Western blot试验也在其中检测到C4蛋白的表达,说明C4-S ORF编码的蛋白在CLCuMuV诱导寄主产生症状过程中起关键作用。亚细胞定位发现YFP-C4-L主要定位在本氏烟叶片表皮细胞的叶绿体,YFP-C4-S则定位在细胞膜或细胞质周边,并有点状聚集体结构。【结论】C4-S ORF编码的蛋白对CLCuMuV的侵染必不可少,而C4-L和C4-M ORF编码的蛋白对CLCuMuV的侵染不是必需。 相似文献
10.
RNA干扰用siRNA的体外转录合成 总被引：4，自引：0，他引：4
RNA干扰(RNA interference，RNAi)作为一种特异性沉默基因表达的方法，正在成为研究基因功能、胚胎发育及病毒性疾病治疗的重要工具，而获得符合干扰要求的短双链干扰RNA(small interference RNA，siRNA)是进行RNA；研究的首要步骤。本研究建立了体外转录合成siRNA方法。并用其生成的siRNA干扰鸡成纤维细胞外源绿荧光蛋白(GFP)基因和内源3—磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的表达。结果显示，siRNA能特异性降低鸡成纤维细胞中内外源基因的表达。本实验认为这种以DNA为模板体外转录合成siRNA方法操作简单、成本低、产物得率高，值得从事RNA研究者参考借鉴。 相似文献
11.
《中国农业科学》2020,(4)
【目的】马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是危害烟草、马铃薯、番茄、辣椒等主要农作物的重要病毒,给农业生产带来巨大损失。论文旨在克隆Hsc70-2蛋白在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中的基因序列并分析其生物学信息,研究NbHsc70-2蛋白对PVY侵染烟草的影响,为进一步解析PVY的侵染机制提供理论依据。【方法】以本氏烟为材料,克隆NbHsc70-2蛋白的基因编码序列(coding sequence,CDS),利用MEGA 6.0进行多序列比对并构建系统进化树;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析NbHsc70-2在本氏烟各组织中的表达水平;采用在线软件BaCeILo和SignalP 4.0对NbHsc70-2进行生物信息学分析;构建NbHsc70-2-RFP融合蛋白确定该蛋白的亚细胞定位;研究PVY处理对本氏烟叶片中NbHsc70-2的影响;利用激光共聚焦观察PVY-GFP处理对NbHsc70-2-RFP定位的影响;构建NbHsc70-2 VIGS沉默体系及瞬时表达载体,采用qRT-PCR比较NbHsc70-2在沉默/过表达后对PVY表达的影响。【结果】NbHsc70-2编码649个氨基酸,系统进化树分析表明,NbHsc70-2与普通烟NaHsc70-2序列相似性最高,亲缘关系最近,属于热激蛋白家族,C端具有热激蛋白家族的高度保守基序结构;qRT-PCR分析表明,NbHsc70-2在叶中表达量最高,在根和茎中的表达量较低;BaCeILo预测及激光共聚焦显微镜观察均显示NbHsc70-2定位在细胞质中,并且PVY-GFP侵染本氏烟后NbHsc70-2-RFP部分转移至细胞核,与PVY-GFP共定位在细胞质及细胞核中;将NbHsc70-2基因沉默载体pTRV::NbHsc70-2导入本氏烟中7 d后相比于对照组,沉默组出现心叶皱缩及矮化现象;接种PVY-GFP 7 d后通过手持紫外灯观察到沉默组中无明显绿色荧光出现,而对照组中PVY-GFP系统侵染使得非接种叶片呈现荧光现象,沉默组荧光点数约为对照组28%;接种PVY后,利用qRT-PCR检测沉默NbHsc70-2后1、3、5 d的PVY CP基因积累量,结果表明沉默NbHsc70-2后PVY CP基因积累量下降,其中3 d和5 d与对照相比差异显著,基因表达水平分别为对照的14%和0.004%;将NbHsc70-2过表达载体pEarleyGate100::GWC::NbHsc70-2与PVY同时导入本氏烟后,结果表明相比于对照组,过表达组48 h和72 h其PVY CP基因积累量显著上升,基因表达水平分别为对照组的2.31、2.56倍。【结论】PVY侵染会引起NbHsc70-2表达量上升;NbHsc70-2是PVY侵染本氏烟重要的组成成分,沉默该基因显著抑制PVY的表达,过表达NbHsc70-2则显著提高PVY的表达,即NbHsc70-2的表达水平与PVY复制呈正相关,NbHsc70-2蛋白促进PVY对烟草的侵染。 相似文献
12.
【目的】克隆获得苦瓜α-MC、商陆PAP,在烟草中异源表达观察两个蛋白在细胞中的定位情况。研究α-MC对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的抑制作用及其引起的抗性防御反应。【方法】根据已报道的商陆抗病毒蛋白PAP基因全序列和苦瓜素基因全序列,设计并合成扩增PAP和α-MC基因全长引物,通过RT-PCR及基因克隆方法,从苦瓜和商陆春叶克隆得到苦瓜α-MC、商陆PAP;用Wolf PSORT预测蛋白定位,将苦瓜α-MC、商陆PAP分别融合在GFP和Ds Red2的N端,构建融合蛋白表达载体,采用GFP和Ds Red2标记进行亚细胞定位,验证预测结果;通过农杆菌介导在本氏烟中瞬时表达α-MC,再接种烟草花叶病毒,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分别检测病毒在接种叶片的蛋白积累量和RNA表达量,分析瞬时表达α-MC的抗病毒效果。利用q RT-PCR分析植物防卫相关基因NPR1、PR1、PR2的表达,探究其抗病毒机理。【结果】克隆得到基因α-MC和PAP全长,分别为861和939 bp。Wolf PSORT预测显示α-MC和PAP主要定位于细胞质膜上。共聚焦荧光显微镜下观察发现,分别用GFP和Ds Red2标记的α-MC和PAP均定位在本氏烟叶片表皮细胞质膜上,与Wolf PSORT预测的α-MC和PAP定位结果相一致。异源表达的PAP对植物细胞毒性作用强,导致表达部位细胞坏死,异源表达α-MC的植物细胞无明显毒性,表达部位细胞完整。在本氏烟中异源表达α-MC后,再接种TMV-GFP,在紫外灯下观察发现α-MC处理后的本氏烟在接种TMV-GFP 48 h后没有出现绿色荧光,而对照组出现荧光。72 h后处理组出现零星荧光,但对照组的绿色荧光开始扩散,连续观察,处理组几乎没有变化,接种TMV-GFP 6 d后,发现处理组的绿色荧光几乎没有扩大的趋势,而对照组的绿色荧光已扩散至心叶;ELISA检测表明,在接种TMV-GFP 6 d后的叶片中,对照组与健康植物的OD492比值几乎已达到处理组的10倍以上;q RT-PCR检测TMV RNA的含量,结果显示对照组TMV RNA表达量是处理组的149倍左右,表明α-MC对TMV复制和移动均有明显抑制;q RT-PCR结果分析显示,NPR1在只注射TMV、单独表达α-MC以及表达α-MC后注射TMV的本氏烟中均被诱导表达,但后者的表达量是前两个处理的约2.5倍左右,在只接种α-MC和表达α-MC后注射TMV的本氏烟中均检测到PR1、PR2,但后者的表达量显著高出前者5—7倍,表明异源表达α-MC可诱导植物中防卫相关基因NPR1、PR1、PR2的表达,从而引起更强的防御反应。【结论】异源表达α-MC显著抑制TMV,能够激活植物防卫反应,且对植物细胞无明显毒性。研究结果为利用异源表达α-MC方法开发控制植物病毒新产品提供了参考依据。 相似文献
13.
为了解本课题组分离的鳗鲡疱疹病毒福建株（AngHV-FJ） ORF51的结构特征,扩繁了 AngHV-FJ ,提取其基因组DNA ,经PCR扩增,获得ORF51基因,将其克隆至pMD19-T载体中,进行DNA测序,用生物信息学方法分析AngHV-FJ ORF51基因及其编码蛋白的结构和功能。结果显示,扩增到长约720 bp的ORF51基因序列,其与GeneBank上鳗鲡疱疹病毒欧洲株（AngHV-1） ORF51基因的序列完全一致。该基因编码239个氨基酸;预测ORF51基因编码蛋白的分子量为26107.1 Da ,等电点为7.66,是疏水性蛋白且偏碱性;有4个跨膜域;抗原表位预测显示抗原性较好;结构预测显示,存在1个N-糖基化位点、1个O-糖基化位点、10个磷酸化位点;亚细胞定位预测显示其主要存在于内质网。本研究为解析ORF51的功能及开展AngHV的基因工程疫苗研究奠定了基础。 相似文献
14.
黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是瓜类作物上一种重要的病毒,近年来在中国多地陆续报道其危害,给西瓜、黄瓜等作物生产造成了惨重的损失。本研究选择2012年采自江苏洪泽的CGMMV西瓜分离物为研究对象,经克隆和序列测定显示其CP基因全长486 bp,编码一个17 500的蛋白质。为进一步研究其亚细胞定位特征,本研究构建了带有YFP荧光标签的重组表达载体CP-YFP,转化农杆菌后浸润接种本氏烟(Nicotiana benthamiana),激光共聚焦显微镜观察结果显示浸润处理后本氏烟叶片表皮细胞的细胞质及细胞核都有较强的绿色荧光信号,Western blot结果显示带荧光标签的CP在本氏烟叶片中表达正常。这些结果说明CGMMV编码的CP蛋白在细胞质和细胞核均有分布,为进一步研究其功能奠定基础。 相似文献
15.
《宁夏农林科技》2021,62(2)
【目的】本项研究旨在通过建立一个异源VIGS体系,为枸杞重要性状相关基因的功能鉴定提供前期信息。【方法】从枸杞叶片中克隆获得409 bp长的八氢番茄红素脱饱和酶基因(phytoene desaturase, PDS)的编码区片段,构建入基于烟草脆裂病毒的VIGS空载体中,通过农杆菌介导的侵润接种,将重组的病毒沉默载体p TRV2-PDS转入本氏烟中。【结果】本氏烟幼苗被侵染接种后,沉默处理植株的叶片呈现整叶白化的表型,而阴性对照植株叶片一直未出现变白的症状,q RT-PCR检测表明,接种17 d后,与阴性对照植株相比,沉默处理植株PDS基因的表达显著地被抑制(P0.05),说明枸杞PDS基因的同源基因在本氏烟中得到了有效沉默。【结论】该VIGS体系的构建,可用于对枸杞部分基因功能的快速初步鉴定和筛选,旨在提高枸杞基因功能研究的效率。 相似文献
16.
【目的】马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）是危害烟草、马铃薯、番茄、辣椒等主要农作物的重要病毒,给农业生产带来巨大损失。论文旨在克隆Hsc70-2蛋白在本氏烟（Nicotiana benthamiana）中的基因序列并分析其生物学信息,研究NbHsc70-2蛋白对PVY侵染烟草的影响,为进一步解析PVY的侵染机制提供理论依据。【方法】以本氏烟为材料,克隆NbHsc70-2蛋白的基因编码序列（coding sequence,CDS）,利用MEGA 6.0 进行多序列比对并构建系统进化树;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析NbHsc70-2在本氏烟各组织中的表达水平;采用在线软件BaCeILo和SignalP 4.0对NbHsc70-2进行生物信息学分析;构建NbHsc70-2-RFP融合蛋白确定该蛋白的亚细胞定位;研究PVY处理对本氏烟叶片中NbHsc70-2的影响;利用激光共聚焦观察PVY-GFP处理对NbHsc70-2-RFP定位的影响;构建NbHsc70-2 VIGS沉默体系及瞬时表达载体,采用qRT-PCR比较NbHsc70-2在沉默/过表达后对PVY表达的影响。【结果】NbHsc70-2编码649个氨基酸,系统进化树分析表明,NbHsc70-2与普通烟NaHsc70-2序列相似性最高,亲缘关系最近,属于热激蛋白家族,C端具有热激蛋白家族的高度保守基序结构;qRT-PCR分析表明,NbHsc70-2在叶中表达量最高,在根和茎中的表达量较低;BaCeILo预测及激光共聚焦显微镜观察均显示NbHsc70-2定位在细胞质中,并且PVY-GFP侵染本氏烟后NbHsc70-2-RFP部分转移至细胞核,与PVY-GFP共定位在细胞质及细胞核中;将NbHsc70-2基因沉默载体pTRV::NbHsc70-2导入本氏烟中7 d后相比于对照组,沉默组出现心叶皱缩及矮化现象;接种PVY-GFP 7 d后通过手持紫外灯观察到沉默组中无明显绿色荧光出现,而对照组中PVY-GFP系统侵染使得非接种叶片呈现荧光现象,沉默组荧光点数约为对照组28%;接种PVY后,利用qRT-PCR检测沉默NbHsc70-2后1、3、5 d的PVY CP基因积累量,结果表明沉默NbHsc70-2后PVY CP基因积累量下降,其中3 d和5 d与对照相比差异显著,基因表达水平分别为对照的14%和0.004%;将NbHsc70-2过表达载体pEarleyGate100::GWC::NbHsc70-2与PVY同时导入本氏烟后,结果表明相比于对照组,过表达组48 h和72 h 其PVY CP基因积累量显著上升,基因表达水平分别为对照组的2.31、2.56倍。【结论】PVY侵染会引起NbHsc70-2表达量上升;NbHsc70-2是PVY侵染本氏烟重要的组成成分,沉默该基因显著抑制PVY的表达,过表达NbHsc70-2则显著提高PVY的表达,即NbHsc70-2的表达水平与PVY复制呈正相关,NbHsc70-2蛋白促进PVY对烟草的侵染。 相似文献
17.
采用病毒诱导基因沉默技术从本氏烟(Nicotiana benthamiana)cDNA文库中筛选受3种不同激发子(Nep1、harpin和INF1)诱导的过敏性细胞死亡的调控基因。以农杆菌Gv3101为宿主、利用PVX病毒表达载体构建了含有7 000个单克隆的本氏烟cDNA文库,采用牙签刺伤法和注射接种法,从6 000个克隆中筛选到了34个能使激发子诱发的过敏性细胞死亡表型发生改变的克隆。对上述阳性克隆进行序列测定和分析,发现其中13个与已知的基因具有较高的同源性,其中克隆Nb14-4编码1个特异的ALY蛋白;克隆Nb3-9和Nb4-26分别编码1个苹果酸脱氢酶和果糖二磷酸醛缩酶;Nb4-28编码普通烟草中的14-3-3 d-2蛋白。还有21个克隆在公共数据库中没有同源基因。上述结果表明:利用病毒表达载体建立cDNA文库,并采用病毒诱导基因沉默技术可从烟草全基因组内筛选受不同激发子诱导的过敏性细胞死亡的调控基因,为揭示植物过敏性细胞死亡分子机制提供试验依据。 相似文献
18.
《湖北农业科学》2015,(15)
根据乙型单纯疱疹病毒(HSV-2)UL54基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,将其定向克隆至真核表达载体p GPU6/GFP/Neo中,经脂质体介导转染HEK293细胞,倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率,MTT法检测HEK293细胞的存活率,RT-PCR检测UL54基因m RNA的表达,Western blot检测UL54基因编码蛋白质的表达,终点滴定法测定细胞上清液中的病毒感染滴度。结果显示,sh RNA1081能抑制UL54基因m RNA和蛋白质的表达,能显著降低子代病毒滴度,提高细胞的存活率。表明本研究构建的重组表达载体p GPU6/GFP/Neo-UL54 sh RNA能在HEK293细胞中表达,并抑制HSV-2复制。 相似文献
19.
【目的】制备Ⅱ型鲤疱疹病毒（CyHV-2）ORF6多克隆抗体,为深入探究ORF6在CyHV-2急性感染或潜伏感染过程中的作用机制提供技术支持。【方法】利用MEGA 6.0、Adobe Illustrator CS6及BepiPred-2.0等在线软件分析CyHV-2的ORF6基因序列信息,采用PCR从CyHV-2基因组中扩增ORF6基因片段,将其连接至原核表达载体pET-28a后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导和尿素洗涤纯化获得融合蛋白。以纯化的融合蛋白ORF6免疫健康Babl/c小鼠制备ORF6多克隆抗体,并通过Western blotting和间接免疫荧光技术鉴定ORF6多克隆抗体的特异性。【结果】CyHV-2的ORF6基因全长3003 bp,与CyHV-3和CyHV-1的ORF6氨基酸序列相似性均高于30.00%,其中与CyHV-3的相似性高达39.36%;其抗原表位最可能存在于第1~300位氨基酸序列中。将PCR扩增获得的ORF6基因片段连接至原核表达载体pET-28a可成功构建重组质粒pET-28a-ORF6,转化BL21（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导4 h即获得融合蛋白ORF6;原核表达的融合蛋白ORF6主要以包涵体形式进行表达,其分子量为17.13 kD,经6 mol/L尿素洗涤纯化后的浓度为0.1 mg/mL。以纯化融合蛋白ORF6免疫Babl/c小鼠制备获得的ORF6多克隆抗体能特异性识别融合蛋白ORF6及CyHV-2感染的异育银鲫尾鳍细胞（GiCF）;利用制备的ORF6多克隆抗体对CyHV-2感染GiCF细胞进行间接免疫荧光分析,结果在CyHV-2感染GiCF细胞周围能观察到特异性绿色荧光,而在未感染CyHV-2的GiCF细胞周围未观察到特异性绿色荧光,进一步说明ORF6多克隆抗体可特异性识别CyHV-2。【结论】制备获得的ORF6多克隆抗体能与CyHV-2感染GiCF细胞发生特异性免疫反应,即可用于鉴定CyHV-2感染,为探究ORF6蛋白功能是否与CyHV-2潜伏感染相关打下了基础。 相似文献
20.
《（《农业科学与技术》）编辑部》2019,(2)
【目的】由可侵染单子叶植物和双子叶植物的病毒Foxtail mosaic virus (FoMV)构建病毒表达载体。【方法】通过在病毒3’端非编码区插入Potato virus X (PVX)病毒的启动子PVXprom和外源基因序列构建病毒表达载体。【结果】构建了重组病毒表达载体pCB301-FoMV-CP-PVXprom-GFP,该载体能在本氏烟接种叶中表达GFP绿色荧光蛋白。【结论】成功构建了重组病毒表达载体pCB301-FoMV-CP-PVXprom-GFP。 相似文献