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试验旨在敲除肝螺杆菌（Helicobacter hepaticus,H.hepaticus）的CdtB基因,采用pcDNA质粒构建自杀质粒,用于敲除肝螺杆菌ATCC 51449菌株CdtB基因。根据同源重组原理,通过电击转化方法将质粒转入肝螺杆菌构建肝螺杆菌CdtB基因缺失株（ΔCdtB）。采用PCR及测序技术对ΔCdtB缺失株进行鉴定。采用生化试验、生长曲线测定检测ΔCdtB缺失株与野生型肝螺杆菌区别。结果显示,获得以质粒pcDNA构建的同源重组敲除质粒pcDNA-ΔCdtB,电击转化肝螺杆菌后经过传代筛选可获得氯霉素阳性转化子。缺失株替换片段的PCR产物为964 bp,大于野生型肝螺杆菌对应产物884 bp,测序结果表明,氯霉素抗性基因已替换了CdtB基因。比较发现,ΔCdtB缺失株与野生型菌株的尿素酶试验结果均呈阳性,并且在生长速率方面与普通血琼脂平板上无显著差异,但最终缺失株在含氯霉素的血琼脂平板上生长更多。除此之外,将获得的缺失株持续传代并进行PCR鉴定未发现回复突变,有较好的遗传稳定性。综上所述,本研究构建的基因敲除质粒pcDNA-ΔCdtB实现了对肝螺杆菌中目标基因的敲除,为肝螺杆菌基因功能研究和致病因子的发掘提供了有效的基因操作工具。 相似文献
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《上海畜牧兽医通讯》2015,(4)
为了进一步评价E.coli OmpF的功能,我们构建了E.coli外膜蛋白F的缺失突变株。首先根据E.coli F-M-2的测序后的OmpF基因序列设计PCR敲除引物,引物5’端分别有50bp和48bp的拟敲除基因的同源臂,3’端为扩增引物,以pKD3为模板,扩增两侧含FRT位点的氯霉素抗性基因,然后利用pKD46的λ-Red重组系统替换E.coli F-M-2基因组上的OmpF基因,再利用表达FLP重组酶的质粒pCP20将FRT位点之间的氯霉素抗性基因删除,最后用鉴定引物进行鉴定并测序。结果成功地构建了云南撒坝猪致病性E.coli OmpF缺失突变株。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2020,(3)
为探究VirB基因对牛种布鲁氏菌A19株毒力的影响,深入了解布鲁氏菌胞内存活的机制,本研究以牛种布鲁氏菌A19株为模板,利用VirB基因的上下游同源臂融合kana抗性基因构建自杀质粒。以瞬间电击的方式,将自杀质粒电转进菌体,利用同源重组将VirB启动子用kana基因替换,构建A19ΔVirB缺失株。通过实时荧光定量PCR检测缺失株VirB相关蛋白的转录水平,并对缺失株的生长曲线、体外应激、黏附侵袭及胞内生存进行分析。结果显示,试验成功构建A19ΔVirB缺失株。实时荧光定量PCR结果显示,缺失株VirB相关蛋白的表达量极显著低于A19株(P0.01),其生长曲线虽然不同于亲本株,但生长趋势相同。体外应激结果显示,A19株和A19ΔVirB株热休克应激没有明显变化,但在强酸、强碱、高盐的刺激下,A19株的存活率显著高于A19ΔVirB株(P0.05)。黏附侵袭结果显示,缺失株对巨噬细胞的黏附侵袭能力近似于亲本株。胞内生存结果显示,随着时间的延长,A19株的胞内存活趋势逐渐上升,而缺失株A19ΔVirB总体趋势逐渐下降并且与A19的差距越来越大。综上所述,本研究成功构建了VirB启动子缺失株,极显著降低了相关蛋白的表达,为后续相关缺失株的构建及布鲁氏菌毒力的研究奠定基础。 相似文献
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通过等位基因交换,分别敲除牛流产型布鲁菌减毒活疫苗S19株和缺失株S19-Δbp26的znuA基因,构建了布鲁菌znuA基因单缺失株S19-ΔznuA和bp26、znuA基因双缺失株S19-Δbp26-ΔznuA,对获得的2种缺失株进行形态学、生长特性、稳定性和基因测序验证。结果表明,S19株和S19-Δbp26株的znuA基因均成功缺失,生长特性表示2种缺失株与亲本株生长基本无差异;体外连续传至20代,菌落PCR鉴定及基因测序结果显示2种缺失株均遗传稳定。牛流产型布鲁菌单缺失株S19-ΔznuA和双缺失株S19-ΔznuA-Δbp26的成功构建为布鲁菌新型疫苗的研发、布鲁菌感染动物过程中ZnuA蛋白的作用机理及其与Bp26蛋白之间关系的研究奠定了基础。 相似文献
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《畜牧与兽医》2015,(7):21-25
为构建乳房链球菌(Streptococcus uberis)透明质酸合成酶(has A)基因缺失株,采用PCR方法分别扩增氯霉素抗性基因及乳房链球菌has A基因上游、下游片段并克隆到温敏自杀载体p SET4s中,构建重组载体p EST4s:has A。然后,用电转化方法将p EST4s:has A导入乳房链球菌0140J感受态细胞中,通过同源重组获得has A基因敲除突变株。PCR和酶切结果均表明has A基因已被氯霉素抗性基因替换。本研究成功构建了乳房链球菌has A基因缺失株,为进一步探讨has A基因功能及乳房链球菌的致病机理奠定基础。 相似文献
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《畜牧兽医学报》2015,(6)
拟构建单核细胞增生李斯特菌(LM)非编码RNArli87基因缺失株,对其进行分子鉴定,分析rli87基因缺失对LM生长的影响。用融合PCR方法构建LM-SB5 rli87基因缺失突变体,并构建pKSV7-Δrli87穿梭载体,将其转化入LM-SB5感受态细胞,利用温度(42℃)和氯霉素(10μg·mL-1)的抗性双重压力来实现同源重组,筛选同源重组菌进行分子鉴定,测定缺失株与母源野毒株37℃条件下生长曲线。结果显示:PCR和测序结果证实成功获得了LM-Δrli87重组菌。通过25代的连续传代,PCR鉴定结果显示,该缺失株具有良好的遗传稳定性。与野毒株进行对比,在37℃条件下缺失株与野毒株的生长差异不显著(P0.05)。非编码RNArli87基因在37℃条件下对LM生长没有明显的调控作用。 相似文献
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本研究旨在构建弓形虫(Toxoplasma gondii)Ⅰ型RH虫株的膜占位与识别联结蛋白2(membrane occupation and recognition nexus protein,MORN2)基因敲除株,探究MORN2基因的表型功能。利用CRISPR/Cas9技术在sgRNA设计网站筛选出以MORN2基因为靶标的sgRNA并设计引物,以pSAG1∷CAS9-U6∷sgUPRT质粒为模板,在Q5酶作用下构建出MORN2靶向CRISPR的质粒;在MORN2靶点两翼约500bp设计同源臂引物,以pUPRT∷DHFR-D质粒为模板构建含有乙胺嘧啶药物抗性基因(DHFR)的同源片段;将CRISPR质粒与同源片段电转染到弓形虫速殖子中,进行乙胺嘧啶药物筛选、96孔板单克隆筛选及PCR鉴定。结果显示,试验成功获得MORN2基因敲除株,在体外噬斑试验中,该敲除株的生长速度与野生型RH虫株基本一致;在体内感染试验中,分别以100和1 000个敲除株的速殖子腹腔注射小鼠,小鼠的死亡时间与对照组基本一致,说明MORN2基因的缺失几乎不影响RH虫株在体外培养时的生长速度和感染小鼠的毒力。本研究证明了MORN2基因在RH虫株中无表型功能,为进一步探究弓形虫的功能基因奠定了基础。 相似文献
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【目的】构建布鲁氏菌BPE159基因缺失株,研究缺失株体外生长变化特征及其在宿主细胞中的存活能力,探究布鲁氏菌感染期间分泌蛋白BPE159对自噬因子表达的影响。【方法】同源重组方法构建布鲁氏菌BPE159基因重组质粒,电转化布鲁氏菌S2308感受态细胞构建BPE159基因缺失株S2308ΔBPE159。PCR扩增BPE159基因,连接转化构建pBBR1MCS-4-BPE159载体,提取质粒进行电转化,构建BPE159基因回补株S2308ΔBPE159-C。琼脂糖凝胶电泳检测缺失株和回补株遗传稳定性。构建布鲁氏菌感染小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子ATG5、Beclin1、LC3a和LC3b基因表达水平。以S2308、S2308ΔBPE159和S2308ΔBPE159-C株侵染小鼠巨噬细胞,收集细胞总RNA,实时荧光定量PCR检测BPE159基因缺失对布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子表达水平的影响。在相同起始浓度下培养S2308、S2308ΔBPE159及S2308ΔBPE159-C株,观察细菌生长变化趋势;评价S2308ΔBPE159株在不同... 相似文献
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本研究旨在构建弓形虫（Toxoplasma gondii）Ⅰ型RH虫株的膜占位与识别联结蛋白2（membrane occupation and recognition nexus protein，MORN2）基因敲除株，探究MORN2基因的表型功能。利用CRISPR/Cas9技术在sgRNA设计网站筛选出以MORN2基因为靶标的sgRNA并设计引物，以pSAG1∷CAS9-U6∷sgUPRT质粒为模板，在Q5酶作用下构建出MORN2靶向CRISPR的质粒；在MORN2靶点两翼约500 bp设计同源臂引物，以pUPRT∷DHFR-D质粒为模板构建含有乙胺嘧啶药物抗性基因（DHFR）的同源片段；将CRISPR质粒与同源片段电转染到弓形虫速殖子中，进行乙胺嘧啶药物筛选、96孔板单克隆筛选及PCR鉴定。结果显示，试验成功获得MORN2基因敲除株，在体外噬斑试验中，该敲除株的生长速度与野生型RH虫株基本一致；在体内感染试验中，分别以100和1 000个敲除株的速殖子腹腔注射小鼠，小鼠的死亡时间与对照组基本一致，说明MORN2基因的缺失几乎不影响RH虫株在体外培养时的生长速度和感染小鼠的毒力。本研究证明了MORN2基因在RH虫株中无表型功能，为进一步探究弓形虫的功能基因奠定了基础。 相似文献
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为研究荚膜在禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)致病过程中的作用,本研究利用同源重组基因敲除技术构建禽P.multocida C48-3株荚膜多糖输出蛋白基因hexABC的缺失突变株,并以小鼠为动物模型检测荚膜缺陷对细菌毒力的影响。PCR、RT-PCR和DNA测序结果均表明253 bp的hexC基因下游序列、798 bp的hexB基因全序列和290 bp的hexA基因上游序列完全被四环素抗性基因替代,表明构建了基因敲除突变株C48-3ΔhexABC。电镜观察结果表明突变株荚膜合成能力缺失,对小鼠的致病性试验结果显示突变株毒力基本丧失。本研究获得的无荚膜突变株为进一步研究禽P.multocida的致病机理奠定基础。 相似文献
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试验旨在构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统vceA基因缺失株,分析其生长特征及其在人胚胎滋养层细胞(HPT-8)中的存活能力。以布鲁氏菌S2308为模板,PCR扩增vceA基因上、下游同源臂,以pUC19K质粒为模板扩增kan基因,然后利用融合PCR技术将3段基因进行融合,再将此片段与pMD19-T载体连接,电转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,构建ΔvceA基因缺失株(S2308ΔvceA),通过卡那抗性对缺失株进行连续筛选,并检测其遗传稳定性。在相同培养条件下,观察亲本株S2308和S2308ΔvceA的生长变化趋势,以侵染复数(MOI)100∶1侵染HPT-8细胞,通过CFU计数检测亲本株S2308和缺失株S2308ΔvceA在细胞内的生存能力。结果显示,试验成功获得片段大小为372、510、1 093 bp的vceA基因上、下游同源臂和kan基因;且成功构建pMD19-T-vceA-kan自杀载体,将其电转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建基因缺失株,连续传代10次未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,缺失株S2308ΔvceA与亲本株S2308生长趋势相似,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染HPT-8细胞12 h时,缺失株S2308ΔvceA在细胞中的数量显著低于亲本株S2308(P<0.05)。综上所述,本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的布鲁氏菌vceA基因缺失株,该缺失株在体外培养条件下与亲本株生长趋势相似;但该缺失株在HPT-8细胞内的存活能力显著变弱。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(10):1722-1726
本研究旨在构建粪肠球菌胶原蛋白黏附素基因(ace)缺失突变株,为进一步探讨该基因编码的毒力因子Ace的功能奠定基础。利用pK18mobSacB质粒作为基因敲除载体,构建粪肠球菌ace基因重组自杀质粒pK001,通过体内同源重组筛选成功敲除ace基因的突变株,然后对突变株细菌黏附体外培养猪肠上皮细胞IPEC-J2及其细菌生物被膜形成的情况进行了检测。结果显示,同源重组后,经过卡那霉素抗性筛选、PCR及Southern blot鉴定,成功获得了ace基因缺失突变株肠球菌△ace。细菌生长曲线测定试验表明,ace基因敲除对细菌的生长繁殖并无明显影响,但体外生物被膜测定试验显示基因缺失突变株肠球菌△ace的生物被膜形成能力有所降低。本研究证实了毒力因子Ace对猪源粪肠球菌与宿主黏附的重要作用,该基因缺失突变株的构建为进一步的理论研究和疫苗研发奠定基础。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2015,(5)
为构建肠炎沙门氏菌(S.enterica)tu-fA基因缺失株及鉴定其生物学特性,本实验利用Red重组系统,以pKD3中的FRT-氯霉素抗性(cat~r)基因-FRT序列为模板,利用含有tu-fA基因两端序列的引物,经PCR扩增同源重组DNA片段(tu-fA5'-FRT-cat~r-FRT-tu-fA3'),将该DNA片段电转化于含有质粒pKD46的S.enterica SM6株中进行同源重组,通过氯霉素抗性筛选tu-fA基因缺失的SM6株(SM6△tu-f A::cat),再通过导入质粒pCP20于SM6△tu-fA::cat中敲除cat r基因,从而构建了tu-fA基因缺失株SM6△tu-fA。生物学特性鉴定结果表明,基因缺失株具有良好的遗传稳定性;与亲本株相比,细菌形态未发生明显改变,但基因缺失株体外生长速率略低,利用碳源的能力有所增强;缺失株侵袭Caco-2细胞的能力与亲本株相比有所降低,表明tu-f A基因编码的延伸因子(EF-Tu)在调控细菌侵袭细胞的过程中起着一定的作用。本研究通过构建tu-fA基因缺失的S.enterica株,为进一步研究tu-fA基因编码的EF-Tu的功能奠定基础。 相似文献
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试验旨在构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统vceA基因缺失株,分析其生长特征及其在人胚胎滋养层细胞(HPT-8)中的存活能力。以布鲁氏菌S2308为模板,PCR扩增vceA基因上、下游同源臂,以pUC19K质粒为模板扩增kan基因,然后利用融合PCR技术将3段基因进行融合,再将此片段与pMD19-T载体连接,电转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,构建ΔvceA基因缺失株(S2308ΔvceA),通过卡那抗性对缺失株进行连续筛选,并检测其遗传稳定性。在相同培养条件下,观察亲本株S2308和S2308ΔvceA的生长变化趋势,以侵染复数(MOI)100∶1侵染HPT-8细胞,通过CFU计数检测亲本株S2308和缺失株S2308ΔvceA在细胞内的生存能力。结果显示,试验成功获得片段大小为372、510、1 093 bp的vceA基因上、下游同源臂和kan基因;且成功构建pMD19-T-vceA-kan自杀载体,将其电转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建基因缺失株,连续传代10次未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,缺失株S2308ΔvceA与亲本株S2308生长趋势相似,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染HPT-8细胞12 h时,缺失株S2308ΔvceA在细胞中的数量显著低于亲本株S2308(P0.05)。综上所述,本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的布鲁氏菌vceA基因缺失株,该缺失株在体外培养条件下与亲本株生长趋势相似;但该缺失株在HPT-8细胞内的存活能力显著变弱。 相似文献
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为了开发出能有效防控副结核病的减毒疫苗,试验采用同源重组的方法构建MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株,以MAP K-10菌株基因组为模板,扩增PanCD基因的上下游同源臂,构建pHAE159-p0004s-PanCD重组质粒,转化入耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Msg)感受态细胞中获得噬菌体,并感染MAP K-10菌株,然后挑取单克隆扩大培养,提取基因组进行PCR鉴定;绘制MAP K-10菌株与MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株的生长曲线;用MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株感染小鼠并评价其毒力,解剖取肝脏和脾脏,分析组织荷菌量和肝脏病理变化。结果表明：成功扩增出PanCD基因的上下游同源臂,经PCR扩增和酶切鉴定成功构建出pHAE159-p0004s-PanCD重组质粒,将重组质粒电转化入Msg感受态细胞中获得噬菌体,感染MAP K-10菌株后成功构建出MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株;与MAP K-10菌株相比,MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株的生长速率明显下降;攻菌2周时,MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株感... 相似文献
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为研制更加安全的大肠杆菌疫苗株,并将其开发为新型活疫苗载体,本研究采用电转化将氯霉素抗性基因片段转化至益生菌EP株。采用同源重组技术使氯霉素抗性基因的PCR产物通过其两侧asd基因序列与益生菌EP基因组中的asd基因发生同源重组。通过氯霉素抗性平板筛选得到阳性克隆,对筛选得到的阳性克隆再导入编码Flp重组酶的质粒p CP20以去除抗性基因,从而构建成EP△asd突变株。该缺失突变株可以与表达链球菌asd基因的质粒形成功能性互补,转化有上述质粒的EP△asd突变株可长时间定居于仔猪肠道。本研究为进一步开发以益生菌EP△asd为染色体—质粒平衡致死系统宿主菌的用于预防仔猪肠道性传染病的细菌活载体疫苗研究奠定基础。 相似文献
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通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,构建鼠伤寒沙门菌SL1344株的crp基因缺失疫苗候选菌株,并对其生物学特性进行初步研究。首先构建含缺失321bp crp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp,然后利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选SL1344的Δcrp缺失株,用PCR鉴定结果表明该缺失株构建成功。生物学特性研究发现,缺失株ΔcrpSL1344保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12：i：1,2,且能够稳定遗传缺失321bp的crp基因;但是,与亲本株SL1344相比,其生化特性发生明显改变,生长速度明显减慢。缺失株ΔcrpSL1344口服感染1日龄雏鸡的LD50为7.40×109 CFU,毒力较亲本株SL1344降低32 456倍。以上研究结果表明,SL1344株crp基因缺失株构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,为进一步将其开发为鼠伤寒沙门菌弱毒疫苗候选菌株奠定基础。 相似文献