共查询到20条相似文献，搜索用时 703 毫秒
1.
为筛选马鼻肺炎（equine rhinopneumonitis,ER）基因缺失减毒活疫苗的候选毒株,本研究参考GenBank中EHV-1（登录号：KF644579.1）目的基因序列设计同源臂引物,以本地区流行株XJ2015株DNA为模板PCR扩增gE基因同源臂gEH1、gEH1,以EGFP表达盒（CMV+EGFP+polyA）为标记基因,酶切后依次连接至载体pUC-19,成功构建重组质粒pUC-gEH1H2-EGFP。将XJ2015基因组与质粒pUC-gEH1H2-EGFP共转染至RK-13细胞进行同源重组,以EGFP为标记进行gE基因缺失毒株的筛选及纯化,并测定重组毒株效价。结果显示：经5轮荧光噬斑纯化、PCR及测序鉴定,成功获取一株携带EGFP基因的重组毒株XJ2015-△gE-EGFP,且重组毒株效价（107.1TCID50/0.1 mL）较原毒株（108.8TCID50/0.1 mL）下降约101.7TCID50/0.1 mL。采用同源重组技术成功构建了1株马疱疹病毒1型流行株gE基因缺失突变株,为未来筛选马鼻肺炎基因缺失弱毒疫苗奠定了基础。 相似文献
2.
为了解新疆马疱疹病毒1型(EHV-1)主要毒力基因遗传进化情况并构建TK基因缺失株,本研究以EHV-1XJ2015株DNA为模板,对其主要毒力基因TK、gI和gE全长进行克隆、测序及生物信息学分析,并扩增TK基因左右重组臂TKL和TKR,构建质粒pUC-TKLR,将扩增后的增强绿色荧光蛋白(EGFP,含有CMV+polyA)插入pUC-TKLR质粒,构建TK基因缺失打靶质粒。TK、gI和gE基因同源性分析结果显示,XJ2015株与国外EHV-1分离株TK、gI和gE基因同源性均较高,分别为99.8%~100.0%、99.6%~100.0%和99.9%~100.0%;与EHV-3分离株同源性均最低,分别为72.9%、59.4%和62.1%;遗传进化分析显示,3个基因均与国外EHV-1同属于一个遗传进化分支,与EHV-9和EHV-4进化关系较近,但与EHV-3进化关系较远,表明XJ2015毒株与国外EHV-1毒株TK、gI、gE基因核苷酸上差异不明显,没有明显的地域性特征,功能基因保守且进化缓慢,同源基因功能相同或相近;经PCR扩增、酶切、测序及转染鉴定,本试验成功构建了用于TK基因缺失的打靶质粒pUC-TKLR-EGFP。通过对EHV-1主要毒力基因的分析及TK基因缺失打靶载体的构建,为新疆地区马鼻肺炎流行病学调查分析、TK基因缺失株的构建提供理论依据。 相似文献
3.
为了解新疆马疱疹病毒1型（EHV-1）主要毒力基因遗传进化情况并构建TK基因缺失株，本研究以EHV-1 XJ2015株DNA为模板，对其主要毒力基因TK、gI和gE全长进行克隆、测序及生物信息学分析，并扩增TK基因左右重组臂TKL和TKR，构建质粒pUC-TKLR，将扩增后的增强绿色荧光蛋白（EGFP，含有CMV+polyA）插入pUC-TKLR质粒，构建TK基因缺失打靶质粒。TK、gI和gE基因同源性分析结果显示，XJ2015株与国外EHV-1分离株TK、gI和gE基因同源性均较高，分别为99.8%~100.0%、99.6%~100.0%和99.9%~100.0%；与EHV-3分离株同源性均最低，分别为72.9%、59.4%和62.1%；遗传进化分析显示，3个基因均与国外EHV-1同属于一个遗传进化分支，与EHV-9和EHV-4进化关系较近，但与EHV-3进化关系较远，表明XJ2015毒株与国外EHV-1毒株TK、gI、gE基因核苷酸上差异不明显，没有明显的地域性特征，功能基因保守且进化缓慢，同源基因功能相同或相近；经PCR扩增、酶切、测序及转染鉴定，本试验成功构建了用于TK基因缺失的打靶质粒pUC-TKLR-EGFP。通过对EHV-1主要毒力基因的分析及TK基因缺失打靶载体的构建，为新疆地区马鼻肺炎流行病学调查分析、TK基因缺失株的构建提供理论依据。 相似文献
4.
《中国兽医学报》2020,(2)
根据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)US区基因序列(KJ789182),设计2对特异性引物,扩增PRV NY株gE/gI基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,构建转移质粒pUC-gE/gILR,同时插入绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因,构建转移质粒pUC-gE/gILRE,作为重组同源臂。以PRV NY流行株为亲本株,将其基因组与转移质粒pUC-gE/gILRE共转染ST细胞,通过筛选绿色荧光蚀斑,获得含有荧光蛋白的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~--EGFP~+。再以该毒株基因组与转移质粒pUC-gE/gILR进行同源重组,通过筛选无荧光蚀斑,纯化重组病毒,经PCR扩增、测序,证实获得了去除EGFP基因的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~-。该重组病毒在ST细胞上培养时,与亲本株PRV NY具有相似的生长曲线,但该重组病毒的体外生长动力学比亲本株弱。本研究成功构建了1株针对目前PRV流行株的gE/gI双基因缺失病毒,为我国根除PR提供技术支持。 相似文献
5.
《中国兽医学报》2020,(9)
将猪伪狂犬病病毒(PRV)转移质粒pUC-TKLR与含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的gE/gI/TK三基因缺失PRV变异株rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-/EGFP~+基因组经脂质体转染至ST细胞中,进行无荧光重组病毒蚀斑筛选、纯化,并对该病毒在多种细胞上增殖特性、病毒滴度、一步生长曲线和遗传稳定性及其对小鼠的安全性等进行初步研究。结果显示,成功获得重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-,不含EGFP。经PCR及测序鉴定,证实获得的rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-在TK基因上缺失311 bp。rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-在ST、PK-15、VERO和MDCK细胞上的TCID_(50)分别为10~(6.375)/0.1 mL,10~(5.625)/0.1 mL,10~(5.375)/0.1 mL,10~(3.875)/0.1 mL;与亲本毒株NY在ST细胞中的毒力(10~(6.5)/0.1 mL)相近;当rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-传至20代时,病变细胞仍无绿色荧光,缺失部分TK基因(311 bp),且对小鼠是安全的。 相似文献
6.
7.
《中国兽医学报》2014,(12):1883-1887
通过敲除痘苗病毒天坛株(vaccinia virus tiantan strain,VTT)复制非必需基因TA35R,结合双筛选标记及同源重组技术,构建TA35R基因缺失的VTT弱毒株rVTT-TA35R-。人工合成含有TA35R重组臂、同向loxp序列、早晚期启动子PE/L、EGFP及酶切位点的穿梭质粒pTA35R-EGFP。pTA35R-EGFP和野生型VTT共转染BHK-21细胞,通过绿色荧光蚀斑筛选,构建缺失TA35R基因且含FGFP基因的重组痘苗病毒rVTT-TA35R--EGFP+。采用Cre/Loxp系统敲除外源筛选标记EGFP,获得缺失TA35R基因的重组痘苗病毒rVTT-TA35R-,利用PCR方法和电子显微镜对其进行鉴定,通过MTT法检测细胞噬性以评价其减毒效果。结果表明,所构建的痘苗病毒弱毒株rVTT-TA35R-完全缺失了TA35R基因和外源筛选标记EGFP,且细胞毒性减弱。 相似文献
8.
本研究旨在通过敲除部分与天坛株痘苗病毒(vaccinia virus Tiantan strain,VTT)毒力和宿主范围等相关的复制非必需基因,并结合双标记筛选及外源筛选标记敲除技术,构建多基因缺失VTT弱毒株。人工合成7对重组臂,结合痘病毒早晚期复合强启动子pE/L和外源筛选标记增强型绿色荧光蛋白(Enhance green fluorescent protein,EGFP),构建穿梭载体质粒pTC-EGFP、pTA35-EGFP、pTA66-EGFP、pTE-EGFP、pTB-EGFP、pTI-EGFP和pTJ-EGFP。将上述质粒依次与VTT或基因缺失VTT共转/感染BHK细胞,并通过同源重组和荧光蚀斑筛选方法,逐一敲除拟缺失基因片段(TC:TC7LTK2L;TA35:TA35L;TA66:TA66R;TE:TE3L;TB:TB13RTK2L;TA35:TA35L;TA66:TA66R;TE:TE3L;TB:TB13RTB14R;TI:TI4L;TJ:TJ2R)。利用Cre/Loxp系统实现对外源筛选标记的敲除,最终获得天坛株痘苗病毒基因缺失弱毒株TTVAC7,并运用PCR方法对TTVAC7进行鉴定和遗传稳定性检测。结果表明,本研究成功构建了缺失7个目的片段的天坛株痘苗病毒弱毒株TTVAC7,且该弱毒株具有良好的遗传稳定性。 相似文献
9.
《畜牧与兽医》2020,(10)
通过对4株伪狂犬病病毒(PRV)流行株进行比较,选择免疫原性最高的HNQYY2012为亲本株,利用CRISPR-Cas9技术和Cre/loxP系统构建带有LoxP位点的HNQYY2012ΔgE/EGFP~+,然后利用环化重组酶(Cre)去除增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,构建PRV gE基因缺失株HNQYY2012ΔgE。PCR鉴定和测序结果表明,PRV gE基因缺失株构建成功;一步生长曲线表明,HNQYY2012ΔgE增殖速度慢于亲本株,但最高滴度与亲本株相近;HNQYY2012ΔgE和亲本株对小鼠的半数致死量分别为10~(3.8 )TCID_(50)和10~(2.5 )TCID_(50),表明gE基因缺失株毒力降低。制备的灭活疫苗免疫小鼠能完全抵御5LD_(50)和10LD_(50)强毒攻毒。本文利用CRISPR-Cas9技术和Cre/loxP系统成功构建PRV gE基因缺失株HNQYY2012ΔgE,为猪伪狂犬病灭活疫苗的研制提供了参考。 相似文献
10.
《中国兽医学报》2019,(9):1674-1683
2013-2016年期间,从云南陆良、富源、寻甸及西双版纳规模猪场经Bartha-K61疫苗免疫猪群中发生流产的胎儿内脏组织病料中成功分离获得4株伪狂犬病病毒流行毒株,分别命名为FY-YN-2014、LL-YN-2014、XSBN-YN-2015和XD-YN-2014株。经TCID_(50)测定、动物致病性试验、免疫保护试验及gE、gD、gC、TK基因序列分析,结果显示TCID_(50)分别为10~(-6.083)/100μL、10~(-5.75)/100μL、10~(-6.583)/100μL、10~(-6.5)/100μL。采用Bartha-K61疫苗免疫过的经产母猪血清样品对XSBN-YN-2015分离毒株进行微量病毒中和试验,其结果显示gB抗体阳性、gE抗体阴性的血清样品的中和效价在1∶16～1∶32之间,用gB、gE抗体均为阳性的血清样品时,其中和效价在1∶64～1∶128之间。4株分离毒株接种昆明小白鼠、家兔2～5 d后,均出现奇痒的典型伪狂犬病临床症状。对健康非免疫断奶仔猪进行攻毒,同样出现伪狂犬病的典型发病症状,且能从脑及内脏组织中扩增出伪狂犬病病毒gE基因并成功回收分离到病毒株。在昆明小白鼠上的LD_(50)分别是10~(2.625) TCID_(50)、10~(2.875) TCID_(50)、10~(2.625) TCID_(50)、10~(2.5) TCID_(50)。XSBN-YN-2015株在非免疫断奶仔猪(伪狂犬病病毒gE、gB抗体阴性)测得的LD_(50)=10~(5.33) TCID_(50)。XSBN分离毒株对免疫2次Bartha-K61疫苗的断奶仔猪的攻击试验结果显示,被攻击仔猪均出现高热、精神萎顿、厌食等临床表现,但1周后均能耐过并逐渐康复,提示Bartha-K61疫苗株免疫猪只对当前流行的伪狂犬病病毒云南变异毒株的攻击基本能够提供100%保护。4株伪狂犬病病毒云南流行毒株与近年来国内报道的TJ、HeN1、NH1201等变异毒株的gE、gC、gD及TK基因核苷酸及氨基酸序列均高度一致,同源性高达99%～100%,均分属于同一进化树分支,不过与早期的国内毒株SC、GDSH株,国外毒株Becker、Nia-1、CL15、Kaplan、Kolchis、Hercules、NIA3及疫苗株Bartha相比,均存在一定程度的变异,也未分属于同一进化分支,因此,4株伪狂犬病病毒云南流行毒株也属于变异毒株。 相似文献
11.
通过在E3L同源重组臂中插入含有增强型痘苗病毒早晚期启动子（pE／L）、增强型绿色荧光蛋白基因和同向Loxp（Locus of X-overP1）序列的表达盒构建穿梭质粒pTE—EGFP。利用pTE—EGFP和野生型天坛株痘苗病毒共转染仓鼠肾细胞（BHK-21）,通过对绿色荧光蚀斑的10次筛选,构建缺失E31．基因并含有EGFP基因的重组痘苗病毒rTTVV-TE-EGFP＋利用rTTVV—TE-EGFP＋和含有Cre（Cyclization recombination）重组酶基因的重组质粒pVAX1-Cre共转染BHK-21细胞,通过对无荧光蚀斑的10次筛选,构建无筛选标记的天坛株痘苗病毒减毒株rTTVV—TE一,并利用聚合酶链式反应（PCR）对其进行鉴定。鉴定结果显示,rTTVV-TE-中无ESI。基因转录和EGFP基因表达。以上结果说明,所构建的痘苗病毒减毒株rTTVV—TE--完全缺失了E3L基因和外源筛选标记EGFP基因,且具有良好的遗传稳定性。 相似文献
12.
为探明近年来河南省猪伪狂犬病病毒(PRV)的遗传变异情况,本研究于2017年采集河南漯河和中牟地区疑似伪狂犬病发病养殖场送检的脑组织病料,通过细胞盲传、噬斑纯化、间接免疫荧光试验、Western blotting和透射电镜技术进行病毒分离鉴定。TCID_(50)法测定分离毒株的病毒滴度、生长曲线,通过小鼠感染试验测定分离毒株对小鼠的致死性。对gB、gC和gE基因进行PCR扩增、测序,并与参考毒株序列进行比对分析。结果显示,对PCR鉴定阳性的病料在PK-15细胞盲传后,两份病料在6代内均出现细胞病变,通过间接免疫荧光试验、噬斑纯化和透射电镜技术,成功分离鉴定了两株PRV,分别命名为HeN-LH株及HeN-YM株。分离毒株在PK-15细胞上的生长曲线显示,HeN-LH和HeN-YM株在感染后36 h病毒滴度分别可达10~(8.35)和10~(6.63) TCID_(50)/mL。用不同浓度的病毒接种小鼠,结果显示,HeN-LH和HeN-YM株LD_(50)分别为10~(2.13)及10~(3.25) TCID_(50)。对gB、gC和gE基因全长扩增测序后构建遗传进化树,结果显示,两株PRV毒株与Bartha、Fa和Ea等经典株的亲缘关系相对较远,而与2011年以来国内不同省份分离的PRV变异株亲缘关系较近。氨基酸序列比对分析显示,与其他变异株相似,gB、gC和gE基因均发生了多个氨基酸的变异,且在特定的位点存在特征性的氨基酸插入和缺失。本研究成功分离鉴定了两株PRV变异株,分离株对小鼠均表现出一定的致病性,本试验结果可为河南省伪狂犬病的防控工作和疫苗株的选择提供科学依据。 相似文献
13.
为了研制出能够同时预防猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)感染的二联活疫苗,本研究将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和PEDV中国变异株的纤突蛋白免疫决定簇区域(S1)基因分别克隆至含有PRV胸苷激酶(TK)基因上、下游同源臂的穿梭载体pTK中,构建重组PRV转移质粒pTK-EGFP和pTK-S1。将重组质粒pTK-EGFP与PRV疫苗毒株Bartha-K61基因组DNA共转染Vero细胞,经绿色荧光蚀斑纯化得到重组病毒rPRV-EGFP。随后将重组质粒pTK-S1与rPRV-EGFP基因组DNA共转染Vero细胞,通过反向筛选EGFP阴性蚀斑,蚀斑纯化得到表达PEDV S蛋白的重组伪狂犬病病毒rPRV-S1。本研究将为更有效防控猪伪狂犬病和猪流行性腹泻提供辅助工具。 相似文献
14.
《中国兽医学报》2020,(4)
为了探索伪狂犬病病毒(PRV)流行株的基因变异及遗传演变规律,本试验对福建福州疑似发生猪伪狂犬病的猪场病料,首先选用PCR技术、小鼠接种试验、细胞接种试验及间接免疫荧光鉴定等方法分离鉴定病原,再对病原进行毒价测定、TK和gE基因克隆及序列比对分析。结果显示,病原为PRV野毒,命名为PRV-FJFZ株;PRV-FJFZ株TCID_(50)为10~(-7.2)/0.1 mL,LD_(50)为10~(-3.56)/0.1 mL,对比分析PRV-FJFZ与国外PRV参考毒株的TK和gE基因序列同源性发现,核苷酸的同源性分别为99.5%～100.0%和99.8%～99.9%。TK和gE基因遗传进化树表明,PRV-FJFZ株与当前国内流行的变异PRV毒株在同一分支上,PRV-FJFZ株与国外PRV参考毒株在不同的分支上。本研究结果可为我国PRV的防控净化工作和疫苗株的筛选提供理论依据。 相似文献
15.
为了构建伪狂犬病病毒(PRV)TK/gI/gE三基因缺失重组病毒,试验以PRV-JL14作为母本株,将其基因组与转移载体进行同源重组后,以增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为标记基因进行筛选,先后敲除gI、gE和TK基因大部分序列,获得重组病毒PRV-ΔgIgE/TK,并将重组病毒在BHK-21细胞中传代培养并绘制其一步生长曲线,同时以不同剂量对小鼠进行攻毒试验。结果表明:TK、gI和gE基因缺失后的重组病毒基因组稳定,在BHK-21细胞中传代培养20代未见突变;与母本株PRV-JL14相比,PRV-Δg IgE/TK在BHK-21细胞中的增殖能力没有降低,且对小鼠的致病力显著降低。说明试验构建的重组病毒PRV-ΔgIgE/TK可以作为猪伪狂犬病的候选疫苗株。 相似文献
16.
《中国畜牧兽医》2020,(3)
为筛选猪痘病毒(SWPV)复制非必需区并测定其缺失株的生物学特性,本研究根据同源重组原理分别针对SWPV的TK(ORF063)、ORF121和ORF143基因设计引物。应用重叠延伸PCR技术拼接同源重组左右臂及EGFP筛选标记表达盒,将拼接片段分别转染到感染SWPV的PK15细胞。利用荧光显微镜观察标记含EGFP的单个蚀斑,筛选获取重组毒株。应用PCR及Western blotting对重组毒株进行鉴定。分别测定各毒株感染PK15细胞的蚀斑大小和皮下接种保育猪致病性。PCR结果表明,目的基因成功整合到相应位点,成功获得重组毒株rSWPV-TK、rSWPV-121和rSWPV-143;Western blotting结果显示,连续传代的重组毒株在PK15细胞上稳定表达外源蛋白。重组毒株在PK15细胞上形成的痘斑均小于亲本毒株,其中ORF121缺失株差异极显著(P0.01)。各毒株均可导致保育猪痘斑形成,其中ORF121缺失株引起病变时间短,产生痘斑小,毒力较亲本下降。综上所述,本研究筛选到2个SWPV基因组中可供外源蛋白插入的复制非必需区ORF121和ORF143,为构建SWPV基因工程载体奠定了基础。 相似文献
17.
以构建的TK、gI、gE、US9、部分gN基因缺失的绿色荧光标记猪伪狂犬病毒rPRV-BE为亲本株,通过同源重组构建了表达猪瘟病毒(CSFV C株)主要免疫原性基因E2的重组伪狂犬病毒rPRV-CSFV PE2SC。经PCR、间接免疫荧光试验(IFA)鉴定证实构建正确,并能成功表达E2蛋白。同时,对重组病毒在PK15细胞中的遗传稳定性、增殖特性等进行了研究,结果显示第5、10、15、20代重组病毒经PCR均能扩增出与原代重组病毒相同大小的约为3469 bp含猪瘟病毒E2基因的重组片段;第20代重组病毒感染细胞孔中出现明显的针对E2蛋白的荧光,表明重组病毒在体外连续传20代后仍能稳定遗传。一步生长曲线测定结果表明,与野毒PRV(SX株)、亲本毒rPRV-BE相比,重组病毒rPRV-CSFV PE2SC前期增殖速度较快,病毒滴度到达峰值的时间早,峰值病毒滴度低于野毒,与亲本毒相当,最高病毒滴度依次为10~(6.7)TCID_(50)/mL、10~(8.0)TCID_(50)/mL、10~(7.0)TCID_(50)/mL。结果显示构建的重组病毒具有良好的遗传稳定性及体外复制能力,为进一步对其免疫效果的评价以及PRV基因缺失重组疫苗的研制奠定基础。 相似文献
18.
为了构建无报告基因的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE/TK双缺失株,以PRV-JSZ株为亲本毒株,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,先构建出带有loxP位点的rPRV-gE-/GFP,通过Cre重组酶处理后,获得剔除EGFP的gE单缺失株rPRV-gE ;再以rPRV-gE为母本,以相同方法构建gE/TK双缺失株rPRV-gE/TK.荧光检测和PCR结果显示成功构建了gE单缺失株和gE/TK双缺失株 ;病毒生长曲线测定可见rPRv-gE在PK15细胞上的增殖速度与野生株相似,而rPRV-gE/TK较为缓慢 ;rPRV-gE/TK对小鼠的半数致死量大于1×105 TCID50,显著高于rPRV-gE和野生株 ;缺失株免疫小鼠强毒攻击后能提供80％的保护.这些结果表明以Cre/loxP系统可重复使用构建伪狂犬病病毒多基因缺失株,为研制伪狂犬病病毒基因缺失苗和载体疫苗提供了快速筛选的技术平台. 相似文献
19.
为研究伪狂犬病毒缺失株体外重组情况,将伪狂犬病毒5基因缺失毒株PRV-gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株与野毒株等量混合,经PK15细胞连续传代至第10代,通过分析第10代培养物中毒株类型和比例了解缺失毒株体外同源重组的情况。结果发现,除PRV野毒株和PRV-gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株外,出现了5种新的基因组合类型,分别为PRV（gI-/gE-/US9-/TK-）、PRV（gI-/gE-/US9-/gN-）、PRV（gI-/gE-/US9-）、PRV（TK-）、PRV（gN-）,病毒重组百分率为72%。重组毒株中以gI/gE/US9三基因缺失型为主,占重组蚀斑数的41.7%,占挑选蚀斑数的30%,高于野毒株和5基因缺失毒株的比例（26%和2%）,成为主要的优势重组毒株。从各病毒类型比例上看,缺失株同时获得所有缺失基因的几率很小,且重组后的毒株趋向于稳定的自然缺失毒株（如gE自然缺失的Bartha株）。5种新的基因组合类型的毒株以103.0TCID50接种健康易感家兔,未出现伪狂犬病典型临床症状,安全性好。 相似文献
20.
为筛选猪痘病毒（SWPV）复制非必需区并测定其缺失株的生物学特性,本研究根据同源重组原理分别针对SWPV的TK（ORF063）、ORF121和ORF143基因设计引物。应用重叠延伸PCR技术拼接同源重组左右臂及EGFP筛选标记表达盒,将拼接片段分别转染到感染SWPV的PK15细胞。利用荧光显微镜观察标记含EGFP的单个蚀斑,筛选获取重组毒株。应用PCR及Western blotting对重组毒株进行鉴定。分别测定各毒株感染PK15细胞的蚀斑大小和皮下接种保育猪致病性。PCR结果表明,目的基因成功整合到相应位点,成功获得重组毒株rSWPV-TK、rSWPV-121和rSWPV-143;Western blotting结果显示,连续传代的重组毒株在PK15细胞上稳定表达外源蛋白。重组毒株在PK15细胞上形成的痘斑均小于亲本毒株,其中ORF121缺失株差异极显著（P<0.01）。各毒株均可导致保育猪痘斑形成,其中ORF121缺失株引起病变时间短,产生痘斑小,毒力较亲本下降。综上所述,本研究筛选到2个SWPV基因组中可供外源蛋白插入的复制非必需区ORF121和ORF143,为构建SWPV基因工程载体奠定了基础。 相似文献