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1.
本研究旨在构建高甘氨酸－酪氨酸蛋白（HGTP）启动子荧光素酶报告基因载体并验证其活性,阐明HGTP基因在萨福克羊和中国美利奴羊皮肤毛囊组织中的表达差异与羊毛经济性状的关系。运用PCR方法扩增HGTP基因启动子序列片段,克隆至pGL3-Basic载体中构建重组质粒,并通过双酶切验证和测定核酸序列鉴定;转染皮肤成纤维细胞并检测报告基因的活性;测定羊毛的纤维直径、长度的数据,利用实时荧光定量PCR分析HGTP基因在不同品种绵羊的皮肤毛囊组织中的表达情况。结果显示,萨福克羊与中国美利奴羊的羊毛纤维直径及自然长度差异极显著（P<0.01）,HGTP基因表达水平与羊毛纤维直径存在极显著的高度正相关（P<0.01）,与羊毛自然长度呈现显著的中等负相关（P<0.05）,而羊毛直径与自然长度之间存在极显著的高度负相关（P<0.01）。HGTP基因在萨福克羊和中国美利奴羊皮肤组织中的表达水平差异极显著（P<0.01）。启动子活性荧光素酶检测结果显示,KAP6.1、KAP7和KAP8.1启动子元件在绵羊皮肤成纤维细胞和3T3细胞中均有表达,且在绵羊成纤维细胞中的活性极显著高于在3T3细胞中的活性（P<0.01）。HGTP基因可以作为研究羊毛纤维直径、自然长度的候选基因。构建不同长度的表达载体,转染皮肤成纤维细胞,获得的2个启动子元件都能驱动外源基因在体外细胞水平表达。绵羊HGTP基因启动子的功能研究为调控羊毛发育提供了理论依据。 相似文献
2.
旨在研究WNT4的一个可变剪接体（WNT4-β）对山羊卵泡颗粒细胞增殖的影响。本研究选取4~6月龄健康母羊20只,采集双侧卵巢,体外分离卵泡颗粒细胞进行培养。通过免疫荧光染色技术确定WNT4-β的表达位置;在山羊颗粒细胞中过表达或干扰WNT4-β后,利用RT-qPCR、Western blot检测WNT4-β和WNT信号通路中关键标记因子ROA1、RHOA及颗粒细胞增殖标记基因cyclin-D2、CDK4的表达变化;CCK-8技术检测颗粒细胞增殖情况;并通过ELISA分析颗粒细胞中生殖激素水平的变化。免疫荧光染色结果显示,WNT4-β只在山羊卵泡颗粒细胞中表达,在卵母细胞不表达;过表达WNT4-β后,WNT4-β和颗粒细胞增殖因子cyclin-D2、CDK4的mRNA相对表达量极显著增加（P<0.01）,蛋白表达水平显著增加（P<0.05）;WNT信号通路标记因子ROA1、RHOA mRNA表达水平显著增加（P<0.05）,β-catenin蛋白表达水平显著增加（P<0.05）;干扰WNT4-β后,WNT4-β、cyclin-D2、CDK4、ROA1和RHOA 的mRNA表达显著降低（P<0.05）,WNT4-β、cyclin-D2、CDK4及β-catenin蛋白表达显著降低（P<0.05）。CCK-8结果显示,过表达WNT4-β促进颗粒细胞增殖（P<0.05）;ELISA结果显示,过表达WNT4-β后,颗粒细胞中雌二醇（estradiol,E2）水平显著增加（P<0.05）,孕酮（progesterone,P4）水平升高但不显著（P>0.05）;干扰WNT4-β后则结果相反,颗粒细胞增殖受到抑制（P<0.05）,E2和P4的水平显著降低（P<0.05）。综上所述,WNT4可变剪接体WNT4-β通过调控WNT信号通路促进山羊卵泡颗粒细胞增殖及类固醇激素分泌,本研究为解析WNT4调控山羊颗粒细胞增殖的潜在分子机制提供理论基础。 相似文献
3.
《中国养兔杂志》2020,(3)
毛囊经历周期性生长期,受其基部的真皮乳头细胞调节。本研究用显微切割和二步酶消化相结合的方法处理家兔触须,分离、培养毛乳头细胞,并通过碱性磷酸酶活性检测和蛋白免疫印迹对分离的细胞进行鉴定。结果发现,分离的原代毛乳头细胞呈现向四周放射性贴壁生长,且以长梭形纤维样多极向排列;低代数的毛乳头细胞有明显的凝集性现象,随着代数的增加,凝集性现象越来越不显著,至第10代凝集现象消失,第15代左右细胞停止增殖;经检测,分离的毛乳头细胞有很高的碱性磷酸酶活性,能够表达毛乳头细胞标志性蛋白α-SMA和VIM,表明所分离细胞为家兔的毛乳头细胞,为后期开展毛囊发育的生物学研究提供体外模型。 相似文献
4.
旨在研究BMP4对睾丸支持细胞增殖的调控。本试验选取0、1、2和3月龄组的健康大足黑山羊公羊各3只,采集睾丸支持细胞,每次试验均设3个生物学重复和3次技术重复,通过体外培养、细胞免疫荧光、基因干扰、过表达、qPCR和Western blotting等技术对BMP4是否通过Id2对山羊睾丸支持细胞进行调控以及它们的调控关系进行验证。结果发现,BMP4在2月龄组大足黑山羊睾丸支持细胞中的表达量极显著高于0、1月龄组（P<0.01）;在一定范围内,随着BMP4浓度的增加睾丸支持细胞的增殖活性有所增强,BMP4浓度为200 ng·mL-1时其增殖能力最强（P<0.05）;干扰BMP4后,细胞增殖活力显著下降（P<0.05）,但在72 h后回到正常水平（P>0.05）,PCNA的表达极显著降低（P<0.01）,表明干扰BMP4后细胞的增殖能力受到限制,细胞增殖指数测定结果进一步说明,干扰BMP4后细胞的增殖能力受到限制;过表达BMP4后,Id2基因表达水平极显著增加（P<0.01）,表明BMP4对Id2具有正向调控作用;相对过表达BMP4再干扰Id2试验组,干扰Id2试验组的PCNA基因的表达水平显著降低（P<0.05）,这进一步证明BMP4可以调控该基因和蛋白表达。综上所述,山羊睾丸支持细胞的增殖活力在一定范围内与BMP4的浓度呈正相关;且BMP4能够正向调控Id2的表达,并通过促进Id2的表达进而促进支持细胞的增殖。本研究为阐明BMP4调控山羊睾丸支持细胞的分子机制和生理功能提供了基础。 相似文献
5.
旨在研究山羊β防御素124（goat beta-defensin 124,gBD124）沉默对p38MAPK/AP1通路及下游细胞趋化因子和细胞因子表达的影响。本研究将设计的3条gBD124-shRNAs载入LV10-U6/RFP&Puro质粒载体,与包装质粒共转染到293T细胞中,用梯度稀释法测定病毒原液的滴度;将构建的3个LV10-gBD124和LV10-gBD124-NC载体转染到山羊附睾头细胞中,筛选有效沉默载体;然后用有效沉默载体联合转染附睾头细胞,设置了空白细胞对照组、LV10-NC组、有效沉默载体组,用2 μg·mL-1嘌呤霉素筛选后分别收集细胞和培养液,采用qRT-PCR、Western blot和ELISA检测gBD124、MAPK信号通路关键蛋白、细胞因子及趋化因子基因及蛋白表达情况。本研究构建了gBD124沉默慢病毒载体,筛选出LV10-gBD124-51和LV10-gBD124-161两个有效载体,并成功构建了gBD124沉默稳定转染的附睾头细胞株。与NC对照组相比,gBD124沉默显著降低了山羊附睾头细胞MAPK通路中MAPK1以及AP1的两个亚型c-JUN和c-FOS基因表达（P<0.05）,显著增加了RASA1基因表达（P<0.05）;gBD124沉默显著降低了总p38MAPK、总c-JUN和总c-FOS蛋白表达,以及磷酸化p38MAPK和c-JUN蛋白表达（P<0.05）;gBD124沉默显著上调了MAPK通路下游IL-1β及其受体IL-1R2、IL-8和趋化因子CCL6和CCL21基因表达（P<0.05）,下调了CCL5和IL-1α基因表达（P<0.05）;gBD124沉默显著降低了细胞培养液中CCL5浓度（P<0.05）。与空白对照组相比,gBD124沉默显著增加了培养液中IL-1β和IL-8浓度,降低了IL-1α浓度（P<0.05）。gBD124基因沉默通过抑制p38MAPK/AP1信号通路调控附睾头细胞趋化因子和细胞因子的表达。 相似文献
6.
为了成功分离培养家兔毛乳头细胞(DPCs),为体外开展家兔毛囊发育的相关机制研究提供良好模型,本研究采用中性蛋白酶与胶原酶两步消化法,分离并纯化长毛兔DPCs,观察体外生长的DPCs细胞形态并绘制生长曲线。结果表明,长毛兔DPCs在第47天进入对数生长期;体外培养的DPCsα-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和波形蛋白(VIM)表达均呈阳性,证实分离培养的细胞确为毛囊真皮源性的毛乳头细胞。ECCK-8比较第3代和第9代DPCs的增殖特性,显示在120h和144h生长高峰时,第9代的细胞密度显著低于第3代的细胞密度(P0.05);细胞周期结果显示,在72h、96h、122h和144h时,第3代DPCs的G0/G1期比例显著低于第9代(P0.05),而G2/M期的细胞比例显著高于第9代(P0.05),表明传至9代以后DPCs不再适合体外培养。本研究成功建立了长毛兔毛乳头细胞体外培养条件,为体外研究家兔毛囊发育机制奠定良好的理论基础。 相似文献
7.
本研究旨在阐明荣昌猪BMP15基因在荣昌猪性成熟前不同发育期的表达特性及其与SMADs信号相关基因的表达关系。采集1月龄、3月龄及5月龄荣昌猪卵巢组织,利用qRT-PCR及石蜡切片免疫荧光染色法分析荣昌猪不同月龄卵巢组织内BMP15基因表达及细胞定位特征;利用5月龄卵巢活组织添加重组人BMP15蛋白及TGF-β受体抑制剂（LY215799和LY2109761）,应用qRT-PCR及Western blot方法分析BMP15及SMADs信号通路相关基因SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD7、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β RⅠ和TGF-β RⅡ表达特征及BMP15/SMADs信号通路。结果表明：从1月龄至5月龄,随着荣昌猪生长发育,卵巢组织内BMP15基因mRNA表达量呈上调表达（P<0.05）;石蜡切片免疫荧光试验表明,5月龄卵巢组织卵母细胞周围颗粒细胞内存在BMP15蛋白荧光信号;从3月龄至5月龄的卵巢组织内BMP15、SMAD4、TGF-β1及TGF-β RⅡ基因在mRNA水平呈上调表达（P<0.05）,而SMAD2、TGF-β2及TGF-β RⅠ呈下调表达（P<0.05）;通过5月龄卵巢活组织添加重组人BMP15蛋白、TGF-β RⅠ/Ⅱ及TGF-β RⅠ受体抑制剂培养,发现TGF-β RⅠ/Ⅱ抑制剂（LY2109761）明显抑制TGF-β RⅡ受体蛋白的表达,TGF-β RⅠ抑制剂（LY2157299）不能抑制TGF-β RⅡ受体蛋白的表达。上述结果表明,荣昌猪BMP15基因在荣昌猪性成熟前的卵巢组织内呈上调表达,SMAD4、TGF-β1及TGF-β RⅡ也呈上调表达。本试验研究表明BMP15基因通过TGF-β RⅡ介导SMAD4信号分子调控下游基因的表达,为进一步研究荣昌猪BMP15基因在卵泡发育中发挥的作用提供理论依据。 相似文献
8.
试验旨在探究猴头菇多糖（HEP）预处理RAW264.7细胞对番鸭呼肠孤病毒（MDRV）复制的影响及其机制,从Toll样受体3/β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TLR3/TRIF）信号通路解析HEP在调节MDRV所致的雏番鸭机体免疫抑制中的作用机制并提供体外试验参考。试验设空白对照组（BCG）、病毒感染对照组（VCG）、HEP对照组（HCG）和HEP预防病毒感染组（HPG）,RAW264.7细胞在MDRV感染12和24 h后,通过Western blotting检测各组细胞中TLR3、TRIF和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）的蛋白表达量;病毒感染24 h后,用ELISA法检测各组细胞培养液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-10（IL-10）、IL-6、IL-1β、干扰素-β（IFN-β）的含量。TCID50检测结果表明,MDRV病毒的TCID50为103.46。病毒感染后12 h,细胞未出现明显变化;病毒感染后24 h,细胞变圆;病毒感染后36 h,细胞大量死亡。MDRV在RAW264.7细胞中的复制结果显示,在感染病毒12~24 h内,σNS的表达量呈现上升趋势;在24~36 h,σNS的表达量维持在较高水平。Western blotting结果显示,与空白对照组相比,VCG组细胞TLR3、TRIF和TRAF6蛋白的表达量在感染后12和24 h均显著升高（P<0.05）,HCG组TRIF蛋白的表达量均显著升高（P<0.05）;与感染组相比,HPG组的σNS、TLR3、TRIF和TRAF6蛋白表达量在病毒感染12和24 h均显著降低（P<0.05）。ELISA检测结果显示,与空白对照组相比,VCG组细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-β的含量均显著升高（P<0.05）;与感染组相比,HPG组细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β含量均显著降低（P<0.05）,IFN-β的含量显著升高（P<0.05）。结果表明,HEP可调节MDRV感染诱导RAW264.7细胞TLR3信号转导通路活化,抑制TLR3信号转导通路下游产物TNF-α、IL-10、IL-6和IL-1β的过度表达,同时上调IFN-β的表达,从而抑制MDRV在RAW264.7细胞中的复制。 相似文献
9.
为了研究4F2hc在奶牛乳腺中的表达模式及调控方式，进一步明确氨基酸在奶牛乳腺上皮细胞中的跨膜转运过程，本研究采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测了4F2hc在泌乳期和干奶期奶牛乳腺组织中的表达变化；在体外培养的泌乳期奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸，采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测其对奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达的影响；采用雷帕霉素抑制剂抑制mTOR信号通路，使用Western blotting方法检测mTOR信号抑制后奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达以及乳蛋白合成的变化。结果显示，在泌乳期的奶牛乳腺组织中4F2hc的mRNA和蛋白表达水平均显著或极显著高于干奶期（P<0.05，P<0.01）；在体外培养的奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸可以极显著提高乳腺上皮细胞中4F2hc的mRNA和蛋白质表达水平（P<0.01）；亮氨酸刺激可以激活细胞内的mTOR信号通路（P<0.05），而雷帕霉素处理则可以显著抑制mTOR信号分子的磷酸化并极显著抑制亮氨酸诱导的4F2hc的表达（P<0.05，P<0.01），进而极显著抑制β-Casein的合成（P<0.01）。以上研究结果表明，4F2hc基因的表达与奶牛乳腺的泌乳活性之间呈正相关，亮氨酸可以通过激活mTOR信号通路来调节4F2hc基因的表达，进而影响乳蛋白的合成。 相似文献
10.
为研究转化生长因子-β（TGF-β）信号通路中的骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂（bone morphogenetic protein and activin membrane-bound inhibitor,BAMBI）基因对猪卵泡颗粒细胞的调控作用,本研究设计构建BAMBI干扰和过表达载体,并将构建好的干扰（pSIREN-BAMBI-sh1、pSIREN-BAMBI-sh2、pSIREN-BAMBI-sh3）和过表达（pcDNA3.1-BAMBI）重组质粒转染猪卵泡颗粒细胞,通过实时荧光定量PCR技术进行有效片段的筛选,并对TGF-β信号通路下游基因（TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5）和细胞凋亡基因（Bax、Bcl-2）mRNA的表达水平进行检测。最后,用MTT法和流式细胞术检测BAMBI干扰和过表达对卵泡颗粒细胞增殖及凋亡的影响。结果表明,BAMBI干扰和过表达载体成功构建,pSIREN-BAMBI-sh2抑制BAMBI表达的效果最好,干扰效率最高。干扰BAMBI时,TGF-βRⅡ表达量显著上升（P<0.05）,使得SMAD2、SMAD3的表达量显著上升（P<0.05）;过表达BAMBI时,TGF-βRⅡ表达显著下降（P<0.05）,使得SMAD2、SMAD3的表达量显著下降（P<0.05）;上调BAMBI可显著抑制猪卵泡颗粒细胞增殖,极显著促进猪卵泡颗粒细胞凋亡（P<0.01）。研究结果表明,BAMBI基因显著影响猪卵泡颗粒细胞的生长发育,可能通过调节TGF-β信号通路间接影响猪的繁殖性能。 相似文献
11.
本研究旨在探究促卵泡素（follicle stimulating hormone,FSH）处理对体外培养的牛有腔卵泡颗粒细胞和膜细胞类固醇激素合成相关基因表达的影响。采集牛卵巢表面直径9~11 mm的有腔卵泡,用含不同浓度FSH的DMEM/F12体外培养牛有腔卵泡24 h。提取卵泡颗粒细胞、膜细胞RNA并反转录成cDNA,利用实时荧光定量PCR检测卵泡颗粒细胞、膜细胞中类固醇激素合成酶基因（CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1、CYP19A1、17β-HSD）和促性腺激素受体基因（FSHR、LHR）的表达水平。结果显示,FSH处理上调了颗粒细胞中CYP11A1、3β-HSD和CYP19A1基因表达,其中,25 ng/mL FSH处理极显著上调了CYP11A1基因表达（P<0.01）,10 ng/mL FSH处理显著上调了3β-HSD基因表达（P<0.05）,50 ng/mL FSH处理显著上调了CYP19A1基因表达（P<0.05）;50 ng/mL FSH处理显著或极显著上调了膜细胞中CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1基因表达（P<0.05;P<0.01）,但在10和25 ng/mL FSH处理组中CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1基因表达显著或极显著下调（P<0.05;P<0.01）。对FSHR、LHR基因研究结果显示,不同浓度FSH处理对颗粒细胞中FSHR、LHR基因的表达均无显著影响（P>0.05）,只有25和50 ng/mL FSH处理显著或极显著上调了膜细胞中LHR基因表达水平（P<0.05;P<0.01）,且不同处理组之间膜细胞中CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1基因的表达变化与LHR基因表达变化趋势较一致。结果表明,FSH处理可提高牛有腔卵泡颗粒细胞中CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1基因的表达,膜细胞中CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1基因对LH的刺激更敏感,FSH可能通过影响LHR基因的表达来调节膜细胞中类固醇合成酶基因的表达。 相似文献
12.
旨在克隆山羊NR4A1基因的CDS区序列,明确其组织和细胞表达模式,以及探究过表达NR4A1基因对山羊皮下脂肪细胞分化的影响。本试验利用双酶切法构建山羊过表达载体pcDNA3.1-NR4A1。以1周岁简州大耳羊（n=5）为试验动物。利用RT-PCR方法和实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）技术克隆NR4A1基因编码区序列并明确其时空表达特性,再将山羊pcDNA3.1-NR4A1载体转染皮下脂肪细胞使NR4A1过表达,利用形态学方法检测过表达后脂滴聚集的变化,同时采用qPCR方法检测脂肪分化标志基因相对表达水平的变化。结果获得山羊NR4A1基因的编码区序列是1 797 bp,编码598个氨基酸;NR4A1在山羊各组织中广泛表达,且在山羊背最长肌中的相对表达水平最高（P<0.01）,在山羊皮下脂肪细胞分化60 h表达量最高（P<0.01）;过表达NR4A1基因显著促进山羊皮下脂肪细胞的脂滴积累,并且显著提高C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、LPL、SREBP1和AP2的相对表达水平（P<0.05）。NR4A1基因可能是山羊皮下脂肪细胞分化的正调控因子,且可能是协同脂肪分化标志基因的表达量来实现的。 相似文献
13.
旨在探究bta-miR-677调控Ⅰ型干扰素（IFN）表达的分子机制。将bta-miR-677转染MDBK细胞,检测Ⅰ型IFN和干扰素刺激基因（ISGs）的转录水平;随后通过TargetScan预测bta-miR-677的靶基因,双荧光素酶报告基因系统、qRT-PCR和Western blot验证bta-miR-677的靶基因;利用siRNA敲减验证靶基因对Ⅰ型IFN转录的影响。结果显示,过表达bta-miR-677组IFN-α/β的转录水平高于对照组2~4倍（P<0.001）,随后检测到6种ISGs（IFI6、OAS1Y、OAS1Z、RSAD2、MX1和MX2）转录量上调2~16倍（P<0.01或P<0.001）;反之,抑制表达bta-miR-677组IFN-α/β转录量下调（P<0.01或P<0.05）,同时IFI6、OAS1Y、OAS1Z、RSAD2、MX1和MX2转录量下调（P<0.05或P<0.01）。经TargetScan预测和双荧光素酶报告基因系统、qRT-PCR和Western blot检测显示,bta-miR-677可靶向结合线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）的3'-UTR,抑制MAVS蛋白的表达;MAVS基因敲减后发现,IFN-α、IFN-β和6种ISGs转录量上调。研究结果表明,bta-miR-677通过靶向MAVS上调IFN-α/β转录水平,进而提高ISGs的表达量,为基于bta-miR-677研制抗病毒药物提供了重要资料。 相似文献
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KLF2对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响 总被引：2，自引：1，他引：1
旨在克隆山羊KLF2基因的锌指结构域序列,明确其在组织及细胞表达模式,最终阐明其对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响及可能发挥作用的方式。本研究以5只1周岁左右的健康简州大耳羊为试验动物,利用RT-PCR、细胞培养、实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,qPCR）、RNA干扰等方法克隆KLF2基因锌指结构,明确KLF2基因的时空表达特性并阐明其对肌内前体脂肪细胞分化的影响。结果显示,本研究获得的山羊KLF2锌指结构域为454 bp（KU041748.1）,且该结构域与绵羊、牛、小鼠的同源性为100%。KLF2在山羊各组织中存在广泛表达,且在肺和腹间脂肪中存在较高水平表达（P<0.05）。KLF2在山羊肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达呈先下降又上升然后又下降趋势,且在成脂诱导分化12 h呈最低表达水平,显著低于在未分化的前体脂肪细胞中的表达水平（P<0.05）。油红O染色结果显示,干扰KLF2基因可明显促进山羊肌内脂肪细胞的脂滴积聚;并且PPARγ和C/EBPβ表达量伴随着这个过程分别极显著上调48.5%（P<0.01）和显著上调43.6%（P<0.05）;同时该家族中的KLF1、KLF13、KLF14、KLF15和KLF16表达水平极显著升高（P<0.01）,KLF4显著下降（P<0.05）,KLF3、KLF6、KLF8、KLF9及KLF11极显著下降（P<0.01）。山羊KLF2的锌指结构域与其他物种同源性高度保守,且其在山羊肺和腹间脂肪中表达量较高（P<0.05）。同时KLF2是山羊肌内脂肪细胞分化的负调控因子,并且可能通过PPARγ和C/EBPβ基因来发挥作用,且与其他KLFs基因存在等级调控现象。 相似文献
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旨在克隆山羊Smad3的基础上，明确其组织和细胞表达谱，最终阐明干扰Smad3基因对山羊肌内和皮下脂肪细胞分化的影响。本研究选用5只体况良好的1周龄简州大耳羊，空腹24 h后屠宰并采集相应组织和细胞进行试验。利用RT-PCR技术克隆山羊Smad3基因cDNA区序列并进行生物信息学分析，利用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）技术检测Smad3基因的组织和细胞时序表达水平；并且合成靶向Smad3的siRNA，采用油红O染色从形态学上明确干扰Smad3对山羊前体脂肪细胞成脂分化的影响，利用qPCR检测干扰Smad3对脂肪细胞分化标志基因C/EBPα、C/EBPβ、LPL、SREBP1、AP2、PPARγ、Pref-1、KLF3、KLF4、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10和KLF15以及Smads相关基因Smad2、Smad4、Smad7和TGF-β1基因mRNA表达水平的影响，探讨可能的作用机制。结果，获得山羊Smad3基因1 449 bp，其中CDS区序列为1 278 bp，编码425个氨基酸；Smad3在山羊各组织中具有广泛表达特性，且在肾脏中的表达水平最高（P<0.01）；Smad3均在山羊肌内和皮下两种脂肪细胞诱导分化的36 h表达量最低，极显著低于在未分化前体脂肪细胞中的表达丰度（P<0.01）；干扰Smad3后发现显著促进了山羊肌内和皮下脂肪细胞中脂滴的聚集，且脂肪细胞分化标志基因、KLF3、KLF4、KLF8、KLF9、KLF10和KLF15的表达水平显著上升（P<0.05），Pref-1的相对表达水平极显著下降（P<0.01），同时干扰Smad3基因下调了Smad2、Smad4和Smad7基因的相对表达水平（P<0.05）。研究结果指出，干扰Smad3促进山羊脂肪细胞分化，且可能通过调控脂肪细胞分化标志基因C/EBPα、C/EBPβ、LPL、SREBP1、AP2、Pref-1、KLF3、KLF4、KLF8、KLF9、KLF10和KLF15等及协同Smad2、Smad4和Smad7的表达来实现的。 相似文献
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为了深入探究HSP27基因在藏羊卵泡发育过程中的作用,本研究选择健康的（3~4岁）经产藏母羊6只,屠宰获得卵巢组织进行藏羊HSP27基因克隆,利用生物信息学方法分析HSP27基因CDS区序列,构建HSP27基因过表达及沉默载体,分离培养藏羊卵巢颗粒细胞,将构建的载体按不同分组进行细胞转染试验即空白组、过表达载体组、沉默载体组、阴性对照组,每组设3个复孔。显微镜观察各转染组培养0、24、48、72 h的细胞形态变化及细胞计数,RT-PCR检测各转染组HSP27、GDF9、BMPR-1B、Erβ基因mRNA表达量。结果,试验成功克隆藏羊HSP27基因,其CDS序列长度为618 bp,编码203个氨基酸。试验成功构建藏羊HSP27基因过表达及沉默载体;将构建的载体转染至卵巢颗粒细胞,随着培养时间的递增各转染组间细胞形态发生改变,过表达载体组细胞由长梭状逐渐变为不规则多边形,细胞核变形分解,沉默载体组细胞周边伪足伸出减少,细胞皱缩大量凋亡;细胞计数结果显示,转染后培养72 h时,沉默载体组细胞数量极显著低于其他3组（P<0.01）,过表达载体组细胞数量显著低于空白组和阴性对照组（P<0.05）。RT-PCR结果显示,过表达载体组细胞HSP27基因mRNA表达量极显著高于空白组（P<0.01）,沉默载体组细胞HSP27基因mRNA表达量极显著低于阴性对照组（P<0.01）,过表达载体组细胞的GDF9、BMPR-1B、Erβ基因mRNA表达量均极显著高于空白组（P<0.01）,沉默载体组细胞Erβ基因mRNA表达量极显著低于阴性对照组（P<0.01）。由此可初步推测,当HSP27基因过表达时能够促进颗粒细胞增殖分化,当沉默HSP27基因时可能会触发颗粒细胞凋亡进而影响卵泡发育,以上研究成果可为HSP27基因在藏羊卵泡发育过程中的功能研究奠定试验基础。 相似文献
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旨在克隆山羊DGAT1基因序列,明确DGAT1基因在山羊不同组织中的表达模式,并进一步揭示过表达DGAT1基因对山羊肌内前体脂肪细胞脂质代谢的影响。本试验以10月龄健康简州大耳公羊（n=7）为试验动物。采用RT-PCR法克隆山羊DGAT1基因序列,并对序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR （real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测DGAT1在山羊不同组织中的相对表达水平;采用双酶切法构建pcDNA3.1-DGAT1真核表达载体并转染至山羊肌内前体脂肪细胞;使用RT-qPCR检测DGAT1过表达效率及脂质代谢相关基因的表达情况;通过油红O染色法观察过表达DGAT1对脂滴形成的影响,利用GPO-Trinder酶学反应检测甘油三酯含量。结果显示,获得山羊DGAT1基因序列全长1 651 bp （GenBank登录号：MT221183）,包含5'UTR 125 bp,CDS 1 470 bp,3'UTR 56 bp,编码489个氨基酸残基;山羊DGAT1基因在小肠中的表达量最高,在脾中表达量最低;RT-qPCR检测结果显示,DGAT1在细胞中过表达极显著（P<0.01）,GPAM基因的相对表达水平显著上调（P<0.05）,ADRP和ACOX1基因极显著上调（P<0.01）,而AGPAT6基因相对表达水平显著下调（P<0.05）,MLYCD和HSL基因极显著下调（P<0.01）;油红O染色结果显示,过表达DGAT1后脂滴聚积相较于对照组极显著增多（P<0.01）,甘油三酯测定结果显示,过表达DGAT1基因可极显著增加山羊肌内脂肪细胞甘油三酯含量（P<0.01）。本研究成功获得山羊DGAT1基因CDS区序列并构建了pcDNA3.1-DGAT1真核表达载体,过表达DGAT1可显著促进山羊肌内前体脂肪细胞脂质沉积,并显著影响脂质代谢相关基因的表达,这些结果为进一步阐明DGAT1对调控山羊肌内脂肪代谢的作用机制提供了重要数据。 相似文献
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旨在研究鸡转化生长因子-β1（transfer growth factor-β1,TGF-β1）对大肠杆菌和鸡白痢沙门菌黏附DF1细胞的影响。通过ELISA方法检测鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）感染DF1细胞后鸡TGF-β1表达量的变化,参考GenBank中鸡TGF-β1序列构建鸡TGF-β1的过表达和干扰表达载体,将构建成功的TGF-β1重组表达载体转染DF1细胞后48 h在荧光显微镜下观察其转染效率,荧光定量PCR检测鸡TGF-β1 mRNA水平表达量的变化,ELISA方法检测鸡TGF-β1胞外蛋白表达量的变化,通过黏附试验检测鸡TGF-β1对致病性大肠杆菌和鸡白痢沙门菌黏附DF1细胞的影响。结果显示,NDV感染DF1细胞后,鸡TGF-β1胞外表达量显著高于未感染细胞的表达量（P<0.05）,经酶切测序鉴定TGF-β1干扰表达和过表达重组载体构建成功。转染鸡TGF-β1重组过表达载体细胞的TGF-β1 mRNA和胞外蛋白表达量均显著高于未转染细胞（P<0.01）,致病性大肠杆菌和鸡白痢沙门菌对细胞的黏附率均显著高于未转染细胞（P<0.01）,转染鸡TGF-β1重组干扰表达载体细胞的mRNA和胞外蛋白表达量均显著低于未转染细胞（P<0.01）,致病性大肠杆菌和鸡白痢沙门菌对细胞的黏附率均显著低于未转染细胞（P<0.01）。综上,NDV感染DF1细胞后,鸡TGF-β1的表达量增加,鸡TGF-β1可促进致病性大肠杆菌和鸡白痢沙门菌黏附DF1细胞,这为进一步研究鸡TGF-β1在家禽病毒感染继发细菌性疾病中的作用提供试验基础。 相似文献
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试验旨在从新吉细毛羊皮肤组织表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)中筛选与毛囊发育相关基因并探讨其表达模式与羊毛细度的相关性。利用组装、比对软件Trinity与Blat对新吉细毛羊皮肤组织ESTs组装、注释进而筛选与毛囊发育相关基因,并通过实时荧光定量PCR相对定量方法以2-△△Ct值检测相关基因在不同绵羊个体中的表达规律。结果显示,从474条ESTs中筛选注释获得了4个与毛囊发育相关的角蛋白基因KRT27、KAP3.2、KAP11.1和KAP8.1;4个角蛋白基因在超细型细毛羊皮肤组织表达量极显著高于细型细毛羊的表达量(P<0.01);4个角蛋白基因表达量:KRT27 >KAP3.2 >KAP11.1 >KAP8.1。该研究为角蛋白基因在细毛羊转录水平上的研究提供了一定数据。 相似文献
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【目的】 试验旨在研究多形性腺瘤基因1（plemorphic adenoma gene 1,PLAG1）基因序列特征、多态性以及对山羊出生体重、体尺的影响。【方法】 以波尔山羊为研究对象,克隆PLAG1基因序列并测序,采用实时荧光定量PCR鉴定其在不同年龄和体重波尔山羊组织中的表达模式,采用Western blotting方法检测PLAG1在不同体重羔羊腿肌中的表达水平,进一步筛选PLAG1基因CDS和3'-UTR区SNP,并分析各位点不同基因型与波尔山羊出生体重、体尺的相关性。【结果】 波尔山羊PLAG1基因CDS全长1 500 bp,编码499个氨基酸,PLAG1蛋白相对保守。组织表达谱显示,PLAG1基因在出生体重较大的羔羊心脏、小肠和腿肌中表达水平显著或极显著高于出生体重较小的羔羊,在胎羊各组织中mRNA表达水平均显著或极显著高于成年母羊（P<0.05;P<0.01）;PLAG1蛋白在出生体重较大的羔羊腿肌中表达量极显著高于出生体重较小的羔羊（P<0.01）。在波尔山羊PLAG1基因3'-UTR区共筛选到6个SNPs位点,分别为：2664 A>G、2712 A>G、2721 T>C、2879 T>A、2990 A>T和3270 A>G。关联分析发现,2664 A>G位点AG基因型个体出生管围显著大于GG基因型（P<0.05）;2721 T>C位点TT基因型个体出生体长显著大于TC基因型（P<0.05）;2879 T>A位点TA基因型个体出生管围显著大于AA基因型（P<0.05）;2990 A>T位点AA基因型个体出生体重显著高于AT基因型（P<0.05）;3270 A>G位点GG基因型个体出生体长显著大于AA基因型,AG基因型个体出生胸围显著大于AA基因型（P<0.05）。【结论】 PLAG1基因在波尔山羊胎羊各组织中表达水平均高于成年母羊,发育早期的表达水平与出生羔羊体重相关。PLAG1基因可作为分子标记用于波尔山羊早期生长选育。 相似文献