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1.
试验旨在探究腺病毒感染水牛颗粒细胞和胚胎的最佳条件,以提高转基因水牛胚胎的生产效率。以水牛颗粒细胞和体外发育的胚胎为研究对象,分别用0、1×10~0、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5 GFU/mL腺病毒感染水牛颗粒细胞,获得最佳感染浓度后,在最佳浓度条件下分别感染24、48、72、96 h,摸索最佳感染时间,用倒置荧光显微镜观察试验结果。利用腺病毒感染水牛颗粒细胞的最佳浓度和时间分别感染2细胞和4细胞期胚胎,对胚胎的最佳感染条件进行摸索,分析胚胎分裂率、囊胚率和转染囊胚率。结果显示,1×10-2 GFU/mL浓度和48 h感染时间可获得水牛颗粒细胞的最佳腺病毒感染效率。腺病毒感染2细胞和4细胞期无透明带和非完整透明带胚胎后胚胎发绿光,而感染完整透明带胚胎后不发光,2细胞期胚胎感染后停止发育,4细胞期开始感染的非完整透明带胚胎可继续发育至囊胚。于4细胞期分别感染完整透明带组、非完整透明带组和无透明带组水牛胚胎,结果显示,非完整透明带转染组在囊胚率和囊胚转染效率上均优于其他组。综上,非完整透明带,1×10-2 GFU/mL和48 h为感染浓度和时间,4细胞期为感染起始期的腺病毒介导的水牛转基因胚胎生产方法能够实现目标基因在水牛胚胎中的高效表达,从而达到提高转基因水牛胚胎生产效率的目的。 相似文献
2.
本试验比较了水牛卵母细胞体外受精后注射外源DNA的时间(5~6、9~10、13~14、17~18、21~22 h)和外源DNA的浓度(10、50、100 μg/mL)对Fat-1转基因水牛胚胎的发育影响。结果显示,9~10 h组的胚胎表达率和囊胚表达率最高,其中胚胎表达率极显著高于5~6 h组,囊胚表达率极显著高于21~22 h组(P<0.01);在浓度试验中,50 μg/mL浓度组的胚胎表达率和囊胚表达率最高,且极显著高于100 μg/mL(P<0.01)。 相似文献
3.
为提高性控犏牛胚胎体外发育率,从性控精液的精子密度、受精时间、卵丘细胞的脱除程度、胚胎培养体系和胚胎培养环境各个环节进行优化。结果表明:(1)受精24h的卵裂率和囊胚率显著高于受精6h、18h(P0.05);(2)性控精液的精子密度0.4×10~6~0.6×10~6个/mL时的卵裂率显著低于4×10~6~6×10~6个/mL组(P0.05),但囊胚率差异不显著(P0.05),均显著高于性控精液0.04×10~6~0.06×10~6个/mL的卵裂率和囊胚率(P0.05);(3)卵丘细胞不脱除组的囊胚率(23.42%)显著高于半脱除组(13.77%)和完全脱除组的囊胚率(15.61%)(P0.05);(4)输卵管上皮细胞共培养的囊胚率(24.63%)和卵丘细胞共培养的囊胚率(23.42%)差异不显著(P0.05),但均显著高于FBS CR1aa培养液的囊胚率(P0.05);(5)性控犏牛早期胚胎在低氧培养环境下囊胚率(23.42%)显著高于高氧培养环境(11.83%)(P0.05),而孵化囊胚率差异不显著(P0.05)。结果说明,生产性控犏牛胚胎最佳的条件是性控精液的浓度0.4×10~6~0.6×10~6个/mL,受精时间为24h,采取卵丘细胞不脱除的方法,胚胎培养方式采用输卵管上皮细胞共培养的方式,胚胎培养环境采用低氧环境。 相似文献
4.
为了观察不同浓度的表皮生长因子对无透明带小鼠胚胎体外发育的影响,试验将小鼠原核期胚胎用链霉蛋白酶去除透明带后,分别置于含有不同浓度的表皮生长因子无血清胚胎体外培养液中培养,观察各期胚胎的发育情况.结果表明:除0.01 ng/mL表皮生长因子添加组胚胎的2细胞发育率和囊胚回收率与添加0.1 ng/mL表皮生长因子处理组差异不显著外(P>0.05),其体外胚胎各期的发育率、囊胚回收率和囊胚细胞数与其他处理组比较均差异显著(P<0.05).说明一定浓度的表皮生长因子可以提高无透明带小鼠胚胎体外培养各期的发育率,但是高浓度的表皮生长因子对无透明带小鼠胚胎的体外发育有一定的抑制作用. 相似文献
5.
通过聚合嵌合法初步建立一套黄牛和水牛种间嵌合的程序与方法。聚合嵌合法采用链酶蛋白酶消化透明带或用机械剥离法去除透明带，然后在含有100 μg/ml PHA的培养液中聚合形成嵌合胚。结果发现， 8-细胞黄牛胚胎聚合水牛桑椹胚与黄牛囊胚聚合水牛桑椹胚相比，聚合胚存活率和囊胚发育率均无显著差异（P>0.05）。采用显微手术法分离黄牛和水牛8-细胞胚胎卵裂球进行聚合，聚合率为92.3%，囊胚发育率为58.3%，与用0.25%链酶蛋白酶分离胚胎卵裂球进行胚胎聚合的聚合率（86.7%）和囊胚发育率（46.2%）均无显著差异（P>0.05）。以上结果表明：①水牛和黄牛胚胎通过卵裂球聚合获得的种间嵌合胚胎能继续发育；②胚胎聚合前的发育阶段对其聚合成功率和随后的胚胎发育无明显影响。③胚胎卵裂球的分离方法（显微手术法和酶消化法）对其聚合率和囊胚发育率无明显影响。 相似文献
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本研究检测人神经母细胞瘤细胞-水牛和人神经母细胞瘤细胞-猪重构胚胎的体外发育潜能,以期建立人神经细胞母细胞瘤细胞的异种治疗性克隆模型,为进一步研究人癌症发生过程中的表观遗传学修饰机制及分离得到正常的人类胚胎干细胞奠定基础。分别以水牛颗粒细胞和人神经母细胞瘤细胞为供体,水牛卵母细胞为受体构建克隆胚胎,然后检测这2种重构胚胎的体外发育效率;再以猪卵母细胞为胞质受体,同样以上述2种体细胞为供体细胞构建重构胚胎。结果显示,人神经母细胞瘤细胞-水牛重构胚胎囊胚发育率显著低于水牛同种克隆胚胎的（1.1%∶12.1%,P〈0.05）,而融合率（83.7%∶79.4%,P〉0.05）和卵裂率（55.8%∶58.2%,P〉0.05）无显著差异。但是,当以猪卵母细胞为受体胞质时,人-猪重构胚胎卵裂率显著低于水牛-猪重构胚胎（43.7%∶89.8%,P〈0.05）,但重构胚胎融合率和囊胚率差异不显著（85.8%∶82.5%,0∶1.4%,P〉0.05）。结果表明,人神经母细胞瘤细胞-水牛和人神经母细胞瘤细胞-猪异种重构胚胎可以在体外发育,尽管其囊胚发育率相对比较低。 相似文献
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牛体外受精胚胎衍生干细胞能力影响因素的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
以牛卵巢卵母细胞体外受精获取囊胚期胚胎，比较体外受精牛胚胎不同获取内细胞团的方法和不同培养液对体外培养胚胎干细胞能力的影响。结果表明，囊胚期胚胎不除去透明带而直接培养产生胚胎干细胞，初次克隆率为55％；胰酶法去透明带分离的内细胞团（ICM）培养产生胚胎干细胞，初次克隆率为90％。免疫外科法去透明带分离的ICM在4种不同的培养液中，初次克隆率分别为16．4％、11．5％、21．8％、18．2％，但是其分离的ICM经传代后形成的衍生细胞不易发生分化，经过4～6代的传代，仍然保持其完整的形态，说明免疫外科法是一种理想的牛ICM分离法，培养液为D20＋LIF（40ng／mL）可用于牛胚胎干细胞培养。 相似文献
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【目的】研究α-亚麻酸(ALA)对水牛卵巢颗粒细胞体外培养过程中细胞活力、细胞凋亡、细胞周期相关基因表达及激素分泌功能的影响。【方法】为了筛选体外培养水牛卵巢颗粒细胞ALA最适浓度,在96孔板中加入起始细胞数量为1×104/mL的水牛卵巢颗粒细胞,细胞贴壁12 h后更换含0(对照组)、10、50、100、200μmol/L ALA的培养液,在相同条件下处理24 h,用CCK-8进行细胞活力检测,筛选出最适处理浓度,并用于后续试验。后续试验分为对照组(0μmol/L)和处理组(50μmol/L)两组,用实时荧光定量PCR检测颗粒细胞中B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白1(p21)和增殖细胞核抗原(PCNA)基因的相对表达量,用免疫荧光对颗粒细胞中细胞凋亡相关蛋白Caspase-3和细胞周期相关蛋白p21进行荧光检测和定量分析,用ELISA法检测培养液中水牛颗粒细胞分泌的雌二醇(E2)和孕酮(P4)含量。【结果】与对照组相比,水牛卵巢颗粒细胞经ALA处理2... 相似文献
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小鼠去透明带裸卵的体外受精及其胚胎发育 总被引：1，自引：0，他引：1
为了建立提高小鼠弱精子体外受精率的新方法 ,将小鼠宰杀在 2 0℃下搁置 14 h,然后取出附睾尾精子进行冷冻保存。用解冻后活力明显下降的精子 ,与去透明带裸卵进行体外受精。结果显示 ,与带有颗粒细胞卵的体外受精率(0 % )和透明带切开卵的体外受精率 (4%～ 31% )相比 ,去透明带卵的体外受精率增至 39%～ 6 8% (P<0 .0 1) ;体外受精所获的 2细胞胚 ,经培养有 74 %～ 10 0 %的胚胎发育至扩张囊胚 ;来自 BDF1雄性小鼠精子的 2细胞期体外受精胚 ,经体外培养至囊胚期后再移植 ,获得了正常新生小鼠。以上结果表明 ,去透明带裸卵与小鼠弱精子体外受精 ,可提高小鼠弱精子的利用率 相似文献
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本试验以屠宰场获取的奶水牛卵巢为试验材料,收集卵母细胞进行体外成熟培养(IVM)、体外受精(IVF)及早期胚胎培养(IVC)。研究激素(FSH、LH、E2、P4)的不同浓度对奶水牛卵母细胞成熟和早期胚胎发育的影响,以期探讨奶水牛卵母细胞成熟和早期胚胎体外培养发育机制,优选不同激素的最佳浓度。结果表明:添加FSH试验组奶水牛颗粒细胞扩散率和卵裂率高于未添加试验组(P<0.05);添加LH试验组奶水牛颗粒细胞扩散率、卵裂率及8-细胞率与未添加试验组比较,差异不明显(P>0.05);17β-E2试验组(1.0μg/mL)的奶水牛颗粒细胞扩散率、卵裂率及8-细胞率高于未添加试验组(P<0.05);添加P4试验各组(0.9μg/mL、1.2μg/mL)的颗粒细胞扩散率明显低于未添加试验组(P<0.01)。 相似文献
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采用常规冷冻法冷冻保存圭山山羊桑椹胚、囊胚、扩张囊胚期胚胎,解冻后体外发育率分别为41.94%、67.50%、84.09%,桑椹胚与囊胚、扩张囊胚间差异显著(P<0.05),囊胚和扩张囊胚间虽无显著性差异(P>0.05),但扩张囊胚体外发育率高于囊胚.在胚胎的冷冻-解冻过程中,桑椹胚、囊胚、扩张囊胚的透明带受损伤率分别为6.45%、20.00%、31.82%,透明带受损的桑椹胚、囊胚、扩张囊胚体外发育率分别为0%、50.00%、78.57%.初步说明发育程度越高的胚胎,在冷冻-解冻过程中其透明带越易受到损伤,但随发育程度的加深,胚胎生长发育时对透明带的依赖程度也变得越来越弱,表明圭山山羊早期扩张囊胚最适宜进行冷冻保存. 相似文献
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转sMTPGH基因小鼠胚胎的体外培养 总被引：1，自引：0，他引：1
采用纯化的羊金属硫蛋白 (s MT)启动子指导的猪生长激素 (PGH )基因 (s MTPGH)为显微注射片段 ,将其导入小鼠受精卵原核 ,比较了几种不同培养液对导入外源基因的小鼠胚胎体外发育的影响。结果表明 ,改进的 M16培养液(用 m M16表示 )能有效克服 2 -细胞阻断现象 ,并使转基因胚胎发育到桑椹胚或囊胚阶段。在 m M16培养液的基础上 ,再加入表皮生长因子 (EGF) ,可使 1-细胞胚胎发育到囊胚的比率进一步提高。在 3种培养液 (M16、m M16、m M16 EGF)中 ,转基因胚胎突破 2 -细胞阻断期的比率分别为 12 %、6 8%、90 % ,发育到囊胚期的比率分别是 0 %、2 0 %、4 3%。采用 PCR方法检测 5 7枚经体外培养发育至囊胚的显微注射胚胎 ,4枚扩增出阳性条带 ,外源基因在囊胚期胚胎的滞留率为 7%。 相似文献
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为探讨体外受精早期胚胎的最佳体外培养体系,将从屠宰牛卵巢上获取的卵母细胞进行体外成熟培养、体外受精后获取的早期胚胎,分别用TCM199和mSOFaa与牛卵泡颗粒细胞和牛输卵管上皮细胞进行共培养。结果表明：TCM199和mSOFaa均能使体外受精胚胎突破8～16细胞期的发育阻断,但是囊胚发育率仅为14.3%和15.5%,差异不显著;胚胎与牛卵泡颗粒细胞和牛输卵管上皮细胞进行共培养能够使胚胎的囊胚发育率达到30.2%和33.5%,差异不显著。 相似文献
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《中国兽医学报》2015,(9):1529-1534
本试验旨在研究热休克蛋白70-9B(heat shock 70 000protein-9B,HSPA9B)在牦牛早期体外受精胚胎中的表达差异及其与体外受精胚胎发育的关系。在正常生理条件下,采集青海高原牦牛卵巢,捡取质量良好的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs),进行体外受精和体外培养,采取实时荧光定量(RT-qPCR)和间接免疫荧光技术,检测HSPA9B在不同时期体外受精胚胎中的表达差异及其蛋白分布。实时荧光定量结果表明,HSPA9B在2~4细胞期胚胎中的相对表达量,分别是在桑椹胚和囊胚中的6.693 4、5.227 4倍,HSPA9B在4~8细胞期胚胎中的相对表达量分别是在2~4细胞期胚胎、桑椹胚和囊胚中的1.136 8、9.089 7和5.937 2倍。间接免疫荧光染色结果表明,在2~4细胞期胚胎、4~8细胞期胚胎和桑椹胚中,胞核HSPA9B的相对表达量较胞质弱,在囊胚中胞核HSPA9B的相对表达量较胞质强。由此得出结论:通过基因水平研究,发现HSPA9B在牦牛早期各时期的体外受精胚胎中存在表达差异,HSPA9B在2~4、4~8细胞期胚胎中的相对表达量与其在桑椹胚和囊胚中的相对表达量差异性极显著(P0.01),提示:可能是HSPA9B在胚胎早期发育中发挥重要作用;通过蛋白水平研究,发现HSPA9B在2~4细胞期胚胎、4~8细胞期胚胎和桑椹胚中,胞核HSPA9B的表达量较胞质的表达弱,在囊胚中胞核HSPA9B的表达量较胞质的表达强,结果表明,在体外培养的环境应激条件下,牦牛体外受精胚胎发育至囊胚时,HSPA9B蛋白的分布可能发生了移位。 相似文献
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试验旨在比较腺病毒载体转染水牛乳腺上皮细胞、卵丘细胞、成纤维细胞的效率。将腺病毒质粒pBHGloxdelE13cre、pDC316-eGFP脂质体转染293细胞,收集病毒并测定病毒滴度。用腺病毒载体按不同的感染复数（MOI）感染水牛乳腺上皮细胞、卵丘细胞、成纤维细胞,72 h后倒置荧光显微镜下观察,统计感染效率。MOI为25、50、100、200、400时,成纤维细胞感染效率分别为0.7%、7.0%、9.0%、12.5%、34.0%,卵丘细胞感染效率分别为42.5%、55.3%、57.4%、76.0%、80.0%,乳腺上皮细胞感染效率分别为88.7%、100%、100%、100%、100%。结果表明,腺病毒转染乳腺上皮效率最佳,卵丘细胞次之,成纤维细胞效果较差。 相似文献
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为了系统研究颗粒细胞对水牛卵母细胞体外成熟的影响,使用颗粒细胞条件液处理或单层颗粒细胞和卵母细胞共培养的方法,探讨颗粒细胞共培养对水牛卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响。结果显示,添加颗粒细胞传代接种第2天收集的20%颗粒细胞条件液到水牛卵母细胞成熟液中能显著提高水牛卵母细胞体外成熟率和囊胚发育率(P<0.05);然而单层颗粒细胞却显著抑制水牛卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育(P<0.05)。结果表明,与单层颗粒细胞共培养相比,与颗粒细胞条件液共培养更有利于水牛卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育。本研究为水牛卵母细胞体外成熟培养体系的完善提供一定理论依据。 相似文献
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试验采用脂质体转染法与电穿孔法,以携带绿色荧光蛋白（GFP）-新霉抗性（neo-）双标记基因的pMSCV质粒转染胎牛耳成纤维细胞为供体与体外成熟的牛卵母细胞为受体构建克隆胚。研究了体外成熟培养液中添加EGF（表皮生长因子）对转基因胚的影响,不同转染方法构建供体细胞对重构胚发育的影响和在不同体外培养系统中的发育效果。结果显示,体外成熟培养液中添加EGF 30 ng/mL组的卵母细胞成熟率最高,但对后期转基因重构胚的囊胚发育率的影响,以添加EGF 20 ng/mL组的最高;以胎牛耳成纤维细胞为供体细胞,不同转染方法转染供体细胞构建重构胚,其囊胚发育率差异不显著（P>〖JP2〗0.05）;mSOFaa+颗粒细胞单层细胞共培养体系中的转基因囊胚发育率最好,该体系更适合体细胞核移植法生产转基因牛胚胎。 相似文献