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1.
《江苏农业学报》2016,(5)
本研究旨在构建含家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25的家蚕卵巢细胞(BmN)表达质粒,检测该基因在宿主细胞中的表达,为在细胞水平筛选与家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25相互作用的宿主蛋白奠定基础。利用家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac表达系统,将家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25和报告基因EGFP克隆到杆状病毒转移载体pFast Bac1中,转化BmDH10Bac感受态细胞并筛选阳性重组质粒用于转染BmN细胞。经PCR技术鉴定,成功获得重组杆状病毒质粒v BmEGFP-SWP25。在转染成功的细胞中可观测到绿色荧光信号。使用Western blot方法在感染重组病毒的家蚕BmN细胞中检测到大小约55 000的重组蛋白条带,与理论值一致,表明家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25在BmN中成功表达。 相似文献
2.
为了在Sf9昆虫细胞中表达猪尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT) 1A1蛋白并对其进行功能鉴定。首先,合成密码子优化的UGT 1A1基因,克隆到载体pFastBacⅠ中,构建杆状病毒重组转移载体,然后导入DH10Bac中,获得重组的穿梭质粒,再转染Sf9细胞得到重组杆状病毒,采用Western blotting方法鉴定重组后UGT 1A1蛋白的表达;对镍柱亲和层析纯化获得目的蛋白酶的动力学参数及其对呕吐毒素(DON)的代谢进行检测。结果表明：pFastBac-UGT 1A1质粒被成功构建,导入感受态细胞DH10Bac中获得重组穿梭质粒Bacmid-UGT 1A1,再转染昆虫细胞Sf9获得重组Bacmid-UGT 1A1蛋白,能够与多组氨酸标签单抗发生特异性反应。优化目的蛋白表达,并对其体外代谢DON进行了酶学性质和动力学参数的研究。本研究通过基因克隆、表达和代谢产物的分析等技术手段获得具有较好的生物活性且纯化的Bacmid-UGT 1A1蛋白,为揭示DON在肝脏中的代谢途径、代谢产物和关键调控因子提供参考。 相似文献
3.
【目的】在昆虫细胞中表达猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S1-NTD蛋白,研究其免疫原性,为基于PEDV S蛋白的基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础。【方法】PCR扩增PEDV S1-NTD基因,构建其重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD和重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD。将Ac-PEDV S1-NTD转染sf9昆虫细胞,利用昆虫杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD。将P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,Western blot鉴定重组蛋白的表达,空斑试验测定重组杆状病毒的滴度。在此基础上,分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.1,1和3的P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,并在感染后1,2,3,4和5 d收集细胞,通过Western blot和空斑试验分别检测目的蛋白的表达量和重组杆状病毒的增殖情况。将MOI为0.1的P3代重组杆状病毒皮下注射免疫BALB/c小鼠,每隔2周免疫1次,共免疫3次,以注射PBS、空载体Bacmid和PEDV商业疫苗为对照组,于首免后不同时间采集血液分离其血清,ELISA法检测血清中PEDV特异性抗体的水平;于首免后35 d剖取小鼠脾脏,分离其淋巴细胞;PEDV刺激后,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖情况。【结果】PCR扩增获得了约738 bp的PEDV S1-NTD基因;成功构建了重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD、重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD和重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD。利用杆状病毒表达系统在sf9细胞内成功表达了重组PEDV S1-NTD蛋白,且杆状病毒以MOI为1感染sf 9细胞后在第3天蛋白表达量达到最高。在首免后35 d,重组杆状病毒免疫组小鼠血清效价达到最高值,为1∶5 000,与商业疫苗组效价一致;淋巴细胞增殖试验表明,重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD免疫组小鼠脾淋巴细胞对PEDV的刺激也发生了显著增殖(P0.05),而PBS和空载体Bacmid对照组淋巴细胞未发生明显增殖(P0.05)。【结论】成功构建了重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD,在昆虫细胞中成功表达了PEDV S1-NTD蛋白,且具有较好的免疫原性。 相似文献
4.
《扬州大学学报(农业与生命科学版)》2015,(4)
采用PCR技术扩增出结核分枝杆菌ppe27基因,并克隆至穿梭质粒pMV261中,将重组pMV261-ppe27-flag穿梭表达载体电转化到耻垢分枝杆菌内,诱导重组耻垢分枝杆菌,通过免疫印迹分析表达产物。结果表明:成功构建表达结核分枝杆菌基因ppe27的重组耻垢分枝杆菌,Western blotting结果显示,表达的重组融合蛋白PPE27-FLAG能与抗FLAG多抗以及兔抗PPE27-HIS蛋白多抗发生特异反应,在37.9ku处有明显特异性条带。表达ppe27基因的重组耻垢分枝杆菌构建成功,为下一步研究结核分枝杆菌致病机制奠定基础。 相似文献
5.
为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-Ⅰ)的主要结构蛋白VP1,根据GenBank已发表的DHAV-ⅠSH株VP1基因序列,设计1对特异性引物,通过RT-PCR扩增VP1基因,将其克隆至杆状病毒转移载体pFastBac1,获得重组杆状病毒转移载体p FB-VP1,将其转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经抗性、蓝白斑筛选及PCR鉴定后,构建重组穿梭质粒rBacmid-VP1。在脂质体介导下将重组质粒rBacmid-VP1转染昆虫细胞Sf 9,制备含有DHAV-ⅠVP1基因的重组杆状病毒rBac-VP1。Western blot结果显示,表达的重组蛋白VP1大小约27 ku,能与DHAV-ⅠVP1多克隆抗体发生特异性反应;间接免疫荧光检测结果显示,重组蛋白VP1能与DHAV-Ⅰ全病毒阳性血清发生特异性反应,细胞内出现较强的荧光。以上结果表明,在昆虫细胞中成功表达了具有免疫原性的DHAV-Ⅰ主要结构蛋白VP1。 相似文献
6.
利用杆状病毒表达系统对呼肠孤病毒3型S1在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究Reo-3σ1蛋白功能及建立呼肠孤病毒3型血清学诊断方法奠定基础。采用PCR方法扩增全长为1 416bp的Reo-3S1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFastBacHTA-S1再转化到DH10Bac感受态细胞中,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-S1,用脂质体介导法转染昆虫细胞获得重组病毒rBS。免疫荧光法（IFA）和western-blotting检测结果表明,S1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约为50 kD的重组蛋白,且具有免疫原性。这是国内首次通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达出了具有免疫原性的Reo-3σ1蛋白,为进一步研究单克隆抗体的制备和血清学抗体水平检测研究奠定了基础。 相似文献
7.
研究了口蹄疫病毒(FMDV)VP31基因在昆虫细胞中的表达.结果表明:利用重组杆状病毒在昆虫细胞中成功表达了AsiaⅠ型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP31基因,目的基因经亚克隆插入到含有一段蜂毒溶血肽序列的转移载体pMelBac B中,构建出穿梭质粒pMel-VP31.将含有目的基因的穿梭载体与线性化的杆状病毒骨架共转染昆虫Sf9细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.重组病毒经扩增后感染Sf9细胞,用Western-blot和间接夹心ELISA检测,证实VP31蛋白获得了表达. 相似文献
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9.
利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)Erns和E2基因,用于CSFV新型疫苗以及建立相关的血清学诊断方法等研究.从猪瘟病毒石门株血液样品中提取总RNA,对Erns及E2基因进行扩增,将产物回收后分别连接于T载体,酶切及测序分析后,将其亚克隆至真核表达转移载体pFastBac HT经重组筛选后获得杆状病毒重组质粒,重组质粒转染昆虫细胞sf9后连续传3~4代,分别收获细胞上清液及沉淀,用于SDS-PAGE及Western-blotting试验,检测重组Erns,E2基因表达蛋白.用抗组氨酸(His)单克隆抗体在表达细胞中检测到Erns重组的His标签蛋白;应用抗E2蛋白单克隆抗体在表达细胞及培养上清液中检测到E2基因表达蛋白.结果表明在杆状病毒系统中成功表达了CSFV Erns和E2蛋白. 相似文献
10.
首先将鸡白细胞介素18成熟蛋白(mature chicken interleukin-18,mChIL-18)基因亚克隆至杆状病毒转移载体pFastBac HTb上,然后转化至含穿梭载体Bacmid的受体菌E.coli DH10BacTM中,构建重组Bacmid(rBacmid)。通过脂质体介导法将纯化的rBacmid转染sf9细胞,获得完整重组杆状病毒,将达到一定滴度的重组杆状病毒感染sf9,收获感染后不同时间段的培养上清和细胞,经SDS-PAGE分析、Western-blotting和间接免疫荧光(IFA)检测,结果表明,分子量约为23KDa的重组蛋白在昆虫细胞中获得了表达;鸡淋巴细胞转化试验和水疱性口炎病毒(VSV)抑制试验表明,表达产物具有良好的生物学活性。结论:在杆状病毒表达系统中成功表达了有活性的mChIL-18蛋白。 相似文献
11.
猪场空气细菌数量与猪高热综合征的相关性研究 总被引：5，自引：0，他引：5
自2001年入夏以来,浙江、上海等许多地区的猪群中流行以持续高热、气喘、皮肤发红为主要特征的猪"高热综合征",给养猪业带来了巨大的损失.但到目前为止,其主要病原依然未被确定.为了研究空气中细菌含量与该病的发生和严重程度之间的关系,我们对浙江省几个不同规模、不同发病情况的猪场的空气细菌含量进行了测试.结果发现:该病的发生及严重程度与猪舍内空气的细菌含量存在着明显的正相关性. 相似文献
12.
树冠圆满度对树木生长的影响及作用研究 总被引：4，自引：0，他引：4
树冠是树木的重要组成部分,其数量指标———树冠圆满度不仅客观地反映了树木占有生长空间的状况及竞争能力,而且对树木的生长过程和树木的形状都有着非常重要的影响。研究结果表明:在树木直径、树高较小(或年龄小)时,其树干材积也较小,而树冠圆满度较大,随着直径、树高的增加,其树干材积随之增加,但树冠圆满度逐渐变小。所以,树冠圆满度与直径、树高及树干材积之间存在着紧密的相关关系,其相关指数(R)基本上在0 80以上,而形数与树冠圆满度之间呈正相关。 相似文献
13.
吉林省通榆县向海水库为通榆县水利事业发展做出了突出贡献。分析向海水库发展的现状,认为要加强对向海水库的管理,因地制宜,通过向海这一品牌发展旅游经济。 相似文献
14.
从经济学角度而言,完备的合同必须具备四方面条件:完全竞争的市场;完全的理性;无外部负效应;零交易成本。但这些条件均不具有现实性。合同法的功能就是纠正合同的非完备性,使之趋于完备。在此分析基础上,对我国《合同法》的立法目的进行了审视。 相似文献
15.
徐道南 《信阳农业高等专科学校学报》1991,(2)
本文对影响锤片式粉碎机生产率和能量消耗的诸多因子,如粉碎机的结构优化设计;相关工作参数的合理选择与组合;合理的使用操作技术等方面做了定性分析和综合论述。同时还扼要介绍了“双转子”、“无筛”粉碎机新机型的粉碎机理,和配合饲料加工粉碎新工艺。 相似文献
16.
尤金亮 《安徽农业大学学报》2008,(3):54-58
从犯的原因力是指成立从犯所必需的因行为人的行为与其他人的犯罪行为之间产生的内在的必然联系。从犯是否成立,要经过一般性判断、具体性判断和排除性判断三个环节。一般性判断主要考虑是否具有成立从犯所要求的主观要件和客观要件,具体性判断涉及事前判断与事后判断、主观判断和客观判断、应然判断与实然判断,排除性判断主要考虑刑法分则的特殊规定和刑法总则中的但书。 相似文献
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本文就当前大学生存在的心理问题、形成原因以及如何应对这些问题做了个阐述，希望能够对广大教育工作者有所启发。 相似文献
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液体表面张力系数与温度和浓度的关系 总被引：6，自引：0，他引：6
为了进一步探讨影响液体表面张力系数的主要因素,通过微观分析,从热力学的角度讨论了液体表面张力系数与温度和浓度的关系,并通过试验进行了论证,得出了水及常用表面活性物质肥皂水的表面张力系数随着温度和浓度的增加是递减的,并和温度呈近似线性关系． 相似文献
20.
周彦每 《信阳农业高等专科学校学报》2007,17(2):76-78
弗吉尼亚.伍尔夫是英国著名的“意识流”派作家,《飞蛾之死》是其代表作。在《飞蛾之死》中,作者通过对一只飞蛾的生死瞬间的描述,以一种极度浓缩的意象视觉效果,娴熟的意识流手法,独特的叙述视角展现了一个小生命的脆弱与坚强,令人回味无穷。 相似文献