共查询到20条相似文献，搜索用时 93 毫秒
1.
山羊痘病毒基因组DNA的提取及酶切分析 总被引：1，自引：0，他引：1
对山羊痘病毒贵州分离株（LD株和QL株）和参考株（Y株和B株）,采用Vero细胞增殖和差速离心浓缩后,以SDS-蛋白酶K法提取病毒基因组DNA,以3种核酸内切酶EcoRⅠ、HindⅢ和PstⅠ进行酶切图谱分析。接种山羊痘病毒48h～60h后,Vero细胞呈现典型的细胞病变;病毒基因组提取样本的纯度在1．8～1．9之间,经琼脂糖凝胶电泳均出现一条纯净的DNA条带;经3种内切酶酶切后,贵州分离株的酶切图谱与参考疫苗毒株Y株基本一致,比参考弱毒株B株少3条～4条酶切片段。这为山羊痘病毒毒力基因的进一步研究奠定了基础。 相似文献
2.
3.
为构建牛分支杆菌ag85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出ag85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒。将此重组质粒转化入大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定。酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同。结果表明,成功地克隆并构建了ag85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b。 相似文献
4.
为构建牛分支杆菌αg85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出αg85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒.将此重组质粒转化人大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定.酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同.结果表明,成功地克隆并构建了αg85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b. 相似文献
5.
桑树叶绿体基因组DNA的提取及部分序列分析 总被引：4，自引：1，他引：3
改进Milligan法 ,提取了桑树叶绿体基因组DNA(cpDNA)。利用特异性引物 ,从cpDNA基因组扩增出tRNL tRNF基因。再用随机引物对同一种桑基因组DNA及cpDNA进行RAPD分析 ,表明提取的DNA是具有相当纯度的cpDNA。进一步用XbaⅠ和HindⅢ进行了cpDNA的酶切和克隆。通过酶切鉴定 ,已克隆到 5个片段 ,对其中 1个片段的 70 0bp序列进行了分析 ,推测克隆的片段可能为trnK基因的内含子。 相似文献
6.
试验旨在对基因组DNA的制备进行研究,为细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)文库的构建奠定基础。以豁眼鹅全血为试验材料,提取高质量的基因组DNA,分别采用HindⅢ、EcoRⅠ和BamHⅠ3种限制性内切酶对所提基因组DNA进行部分酶切,并利用控制酶切时间、设置不同的HindⅢ酶切浓度梯度对基因组DNA进行部分酶切。结果表明,HindⅢ为最佳限制性内切酶,并得到了最佳酶切用量(40U/μL)。该方法所制备的基因组DNA质量较好,可用于BAC文库的构建。 相似文献
7.
伪狂犬病病毒Fa株gp63（gⅠ）基因转移载体质粒的构建 总被引：6，自引：2，他引：4
用限制性核酸内切酶Sall酶切已缺失gⅠ（gE）和部分gp63(gⅠ)的重组质粒PPB7－1DNA后。回收大小约6.0kb片段，经T4DNA连接酶接后转化入大肠杆菌DH5α株，得到含gp63片段的转移载体质粒PP63，再以SV40早期启动子控制的大肠杆菌β－半乳糖苷酶（LacZ）基因作为报告基因，将其手稿P63中gp63基因起始密码子ATG下游的StuⅠ位点，在选择培养基中筛选出表达β－半乳糖苷酶的转化子，构建了以gp63为同源序列含LacZ报告基因的转移载体质粒，命名为PP63LacZ。在该转移载体质粒中，LacZ基因的两端分别与0.3kb和0.5kb的PRV gp63同源序列相连，经酶切、核酸分子杂交技术鉴定，结果表明该转移载体质粒的构建是成功的。 相似文献
8.
以已克隆测序的家蚕微孢子虫 (镇江株 ,Nosemabombycis)的核糖体小亚单位RNA(SSUrRNA)编码基因(12 0 5bp)为模板 ,用随机引物合成法标记的探针 ,在与 9种微孢子虫及家蚕基因组DNA的 6种限制性内切酶的酶切产物的Southern杂交图谱中 ,9种微孢子虫基因组DNA酶切产物的杂交图谱极为相似 ,而与家蚕基因组DNA的任何一种酶的酶切产物均无杂交信号 ,表明微孢子虫和家蚕的SSUrRNA基因同源性很低或没有同源性。同时还证实了已克隆的SSUrRNA基因来源于微孢子虫基因组DNA ,不是从家蚕基因组DNA扩增而来。在酶解较为完全的酶切产物的杂交图谱中 ,微孢子虫基因组DNA中SSUrRNA基因的拷贝数至少在 15以上 相似文献
9.
为了全面了解家兔盲肠中的微生物信息,本文采用非培养技术,通过化学、物理裂解和酶解相结合,建立了直接从家兔盲肠内容物中提取总DNA的方法。结果从1g新鲜的盲肠内容物中提取出5.4μg总DNA;所得的DNA能被核酸限制性内切酶降解;经纯化后能用作模板进行PCR扩增。 相似文献
10.
禽类血液中的蛋白质含量较高,用传统方法提取其血液中的基因组DNA比较繁琐、纯度不高,而且提取的产物中有大量蛋白质残留。本研究采用改良的CTAB法从白羽王鸽全血中提取全基因组DNA,并以传统的酚-氯仿抽提的方法和TAKARA公司基因组提取试剂盒法作对照。结果表明：qCTAB法可以得到大量的、较完整的基因组DNA,并且纯度达到2．00,浓度达到了144．67ng/μL,完全可以满足PCR扩增限制酶切等实验的要求。 相似文献
11.
家兔盲肠微生物总DNA的提取 总被引：4，自引：0，他引：4
为了全面了解家兔盲肠中的微生物信息，本文采用非培养技术，通过化学、物理裂解和酶解相结合，建立了直接从家兔盲肠内容物中提取总DNA的方法。结果从1g新鲜的盲肠内容物中提取出5．4μg总DNA；所得的DNA能被核酸限制性内切酶降解；经纯化后能用作模板进行PCR扩增。 相似文献
12.
脱氧核糖核酸(DNA)作为大部分有机体和病毒的遗传物质,与生物的遗传与变异息息相关。很多研究都是基于核酸分析的基础开展的,对核酸的纯度要求很高。本研究采用4种常用方法提取小鼠基因组DNA,以探讨不同提取方法对DNA质量的影响。结果表明,酚/氯仿抽提法获得的DNA纯度较好,无RNA污染,但有少许蛋白质未剔除;试剂盒法提取到的DNA纯度高、核酸浓度大且无污染,但片段较小,可进行常规的PCR等核酸水平研究。 相似文献
13.
将含新城疫病毒 (NDV)四平株 F基因的重组质粒 (p KSF)经 Eco R 及 Xba 双酶切 ,回收 340 bp的 c DNA片段 ,制备了地高辛标记的 c DNA探针。特异性检测表明 ,该探针对含 NDV F基因的 p KSF呈现特异性 ,而对照载体质粒及鸡痘病毒 (FPV 2 82 E4 )的核酸均呈阴性 ;敏感性检测表明 ,该探针对同源 DNA的检出限量为 4 0 pg。应用该探针对含 NDV F基因的重组鸡痘病毒 v FV2 82进行杂交检测 ,结果呈阳性。以上结果表明 ,该探针可成功用于含 NDV F基因的重组鸡痘病毒的鉴定 相似文献
14.
提取鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的基因组DNA作为模板,用TD-PCR技术从其中分别扩增出了0.55kb的Ⅰ型菌毛结构基因(piliA).将扩增得到的piliA基因片段,用TA克隆的方法分别克隆进pGEM-T载体中,转化至受体菌JM109中,用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选法,得到含阳性重组子的菌株,提取质粒用PstI单酶切及NcoI和PstI双酶切鉴定,结果证实,所构建的克隆质粒中均含有相应piliA基因.经DNA序列分析,其结构基因阅读框架大小为549 bp,但其中O1菌株Ⅰ型菌毛基因在第72位发生突变,有6个碱基插入.经DNA Star核酸分析软件分析,此3菌株的Ⅰ型菌毛基因的同源性为89.9%～92%. 相似文献
15.
为了构建羊口疮病毒B2L和F1L基因融合真核表达质粒pVAX1-B2L-F1L,探讨制备安全可靠羊口疮病毒核酸双基因疫苗的可行性,试验通过Primer Premier 5.0软件设计B2L和F1L融合基因2对引物,应用SOE-PCR技术将B2L和F1L连接起来,用限制性内切酶消化后插入pVAX1真核表达载体中,构建B2L-F1L融合基因表达质粒,再转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中,对真核表达质粒进行PCR鉴定、双酶切鉴定及序列测定。结果表明:利用SOE-PCR技术成功扩增出B2L-F1L融合基因;对真核表达质粒pVAX1-B2L-F1L进行PCR鉴定和双酶切鉴定后,均可得到与预期大小一致的DNA片段;测序发现,真核表达质粒目的基因序列与预期设计一致。说明真核表达质粒pVAX1-B2L-F1L构建成功。 相似文献
16.
为了构建结核分支杆菌MTB41 DNA疫苗,同时将其克隆到原核表达载体中进行表达。用结核分支杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,用PCR法对基因MTB41进行扩增,克隆到真核表达载体pJW4303中,构建MTB41重组真核质粒(DNA疫苗),进行了酶切鉴定和序列分析;克隆到原核表达载体pET22b中,酶切和测序鉴定正确后转入E．coli BL21(DE3)PLysS宿主菌株内中,诱导表达,进行SDS-PAGE电泳分析。电泳发现转化了重组质粒的菌株有蛋白表达,所表达的蛋白质相对分子质量为41ku,MTB41 DNA疫苗酶切鉴定和序列分析完全正确,确定含有正确的读码框,疫苗制备成功。DNA疫苗的成功构建,重组蛋白MTB41的成功表达,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及抗原、抗体的大规模制备打下了基础。 相似文献
17.
根据Genebank中已登录的大肠杆菌O157:H7菌株EDL933基因序列中茵毛分子伴侣ycbR基因序列设计1对引物,并分别在其5'端分别加入Neo I、Xho I酶切位点,以大肠杆菌O157:H7国内分离株97094的DNA为模板,用聚合酶链反应(PCR)扩增出710 bp的DNA片段.回收并纯化该DNA片段,用限制性核酸内切酶Nco I、Xho I同时消化DNA片段和双酶切栽体质粒pET28a(+).将它们回收纯化并连接,然后转化到宿主菌大肠杆菌DH5a,从该菌中提取重组质粒,用PCR、限制性内切酶位点分析及核苷酸序列测定法对克隆的重组质粒进行鉴定,表明ycbR基因定向克隆到了载体质粒pET28a(+).再将重组质粒转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3),在含Kan抗生素LB培养基中经IPTG诱导12～16 h,做SDS-PAGE分析,表明ycbR基因在菌株中获得高效表达,表达蛋白相对分子质量大小约为30 000,与预期结果一致.为研究大肠杆菌ycbR基因产物的功能和致病作用奠定了基础. 相似文献
18.
利用PCR技术，从含有牛朊蛋白（Prion protein，PrP）基因Prnp的开放阅读框的克隆质粒BoPrnp—T中扩增出约420bp的目的基因（PrP猢基因）。将PrP^27-30基因和载体pPIC9K分别用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，T4DNA连接酶作用后，转化至E．coli JM109中，构建重组表达载体pPIC9K-boPrP^27-30。pPIC9K-boPrP^27-30经限制性核酸内切酶SalⅠ线性化后电转至毕赤酵母GS115中，经G418筛选后得到高拷贝的重组菌株GS115／pPIC9K-boPrP^27-30。GS115／pPIC9K-boPrP^27-30经1．0％甲醇诱导后，表达产物用SDS-PAGE和Western blot分析，结果表明牛PrP^27-30基因在毕赤酵母细胞中获得表达，表达产物的分子量约为27Ku，能够被单克隆抗体SAF-70识别。 相似文献
19.
Cpf1是2类V型CRISPR-Cas系统的单个RNA引导的核酸内切酶，具有切割DNA的核酸酶活性。该系统由Cpf1核酸酶和CRISPR RNA(crRNA)组成，对于如何提高CRISPR/Cpf1系统的基因编辑效率主要集中在增强crRNA的稳定性、设计对PAM要求更简单的Cpf1变体或者鉴定新型Cpf1核酸内切酶。然而，其是否适用于构建双切刻系统还有待验证。因此，本研究旨在设计3种AsCpf1突变体以及成对的crRNA，进行瞬时转染，利用双荧光素酶报告基因检测评估AsCpf1双切刻系统的编辑效率；同时探究人工改造的crRNA能否提高AsCpf1双切刻系统的编辑效率；以及设计6对具有拓展PAMs序列的crRNA靶向位点，评估HkCpf1双切刻系统在哺乳动物基因组中的编辑效率。结果显示：3种AsCpf1突变体均能不同程度地提高报告基因的相对活性，并具有切割DNA单链的能力。在AsCpf1 crRNA发生突变和延伸后，它们仍然具有引导AsCpf1双切刻系统切割DNA单链的能力。HkCpf1不仅可以用做构建双切刻系统还具有较高的切割活性，并且可以识别5’-YTN和5’-TYYN PAMs序列... 相似文献
20.
提取鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的基因组DNA作为模板,用TD-PCR技术从其中分别扩增出了0.55kb的I型菌毛结构基因(piliA)。将扩增得到的piliA基因片段,用TA克隆的方法分别克隆进pGEM-T载体中,转化至受体菌JM109中,用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选法,得到含阳性重组子的菌株,提取质粒用PstI单酶切及NcoI和PstI双酶切鉴定,结果证实,所构建的克隆质粒中均含有相应piliA基因。经DNA序列分析,其结构基因阅读框架大小为549bp,但其中O1菌株I型菌毛基因在第72位发生突变,有6个碱基插入。经DNAStar核酸分析软件分析,此3菌株的I型菌毛基因的同源性为89.9%~92%。 相似文献