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将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的M基因和N基因从重组质粒pMD18-T—M—N中亚克隆至pBV220原核表达栽体上,成功构建了重组表达质粒pBVM—N。将pBVM—N转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞.重组菌经温度敏感诱导表达,其细菌裂解物经SDS—PAGE可检测到分子质量约为19ku的目的蛋白,与M基因表达产物一致;经蛋白质分析软件Bandscan分析,其表达量可达19.1%;Western-blotting分析表明,该重组蛋白可被兔抗PRRSV血清所识别,与预期的M基因表达产物相一致,而N基因未获表达。 相似文献
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随着蛋白质研究技术的不断发展,数以百种的蛋白质三维结构已研究的较为清楚,但对于这些蛋白质折叠成天然构象的途径和机制尚知之甚少。通常认为蛋白质的1级结构决定了蛋白质的3级和4级结构,但近年来研究表明,在很多蛋白质的折叠与装配过程中,有其他蛋白质或酶的参与,其中分子伴侣就是目前研究得最多也是研究最热的一种。病毒是细胞内寄生物,分子伴侣与病毒的增殖过程密切相关,从病毒复制的起始、转录的进行、翻译的完成到病毒粒子的装配成熟,甚至病毒在宿主体内的转运都有分子伴侣的参与。随着病毒与分子伴侣相互关系研究的深入,产生了抗病毒的又一可能新途径。 相似文献
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伪狂犬病病毒(PRV)是严重影响养猪业发展的重要病毒,病毒粒子具有较强的抵抗力。SYBRGreen是结合于双链DNA的荧光染料,可在定量PCR反应时与双链PCR产物结合放出荧光信号,被仪器系统实时监控并检测。目前SYBRGreen荧光定量PCR方法在遗传性疾病的诊断等方面有重要的应用价值。本研究根据编码PRV最保守的基因之一的gB基因和PRV的主要毒力基因,即标志性疫苗缺失的gE基因核酸序列设计引物,以含有gE基因的重组质粒ppgE作外部参照,建立了gB和gESYBR Green PCR方法,研究了该方法的灵敏度、特异性以及重复性,现将结果报告如下。 相似文献
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本实验通过设计针对伪狂犬病病毒gE基因的引物和MGB(Minor groove binder oligodeoxynucleotide conjugate,MGB-ODN)TaqMan探针,结合ABI PE7700荧光定量PCR仪器系统,建立了一种能区别伪狂犬病病毒野毒株和gE-疫苗株的快速检测方法gE-MGB-TaqMan PCR。实验表明,该方法可检测出最低43拷贝的gE基因和10~4倍稀释的伪狂犬病病毒Fa株DNA,与微量血清中和结合MTT比色法相比,灵敏度和特异性一致,检测时间仅为后者的1/10,操作比后者更为简单。特异性和重复性试验表明:gE-MGB-TaqMan PCR特异性和重复性好。该方法以闭管的模式操作,减少了各步骤污染的可能性,整个检测少于3 h。 相似文献
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应用RT-PCR技术从ConA诱导培养的大熊猫外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到大熊猫IL-4基因,并将其克隆到PGEM-T载体中。经菌落PCR鉴定、序列测定及序列分析,结果表明,克隆得到的IL-4基因开放阅读框由396个核苷酸组成,编码一个由132个氨基酸组成的多肽,包括编码24个氨基酸的信号肽和108个氨基酸的成熟肽。与GenBank中已登录的大熊猫IL-4(DQ166512)的核苷酸序列同源性分别为99.5%和100%;与其他哺乳动物如犬、猫、人、猪、牛、羊、马、兔、鼠等的IL-4核苷酸同源性为50.7%(鼠)~87.7%(犬);IL-4编码氨基酸同源性在35.7%(鼠)~78.8%(犬);进化树构建结果表明,大熊猫与犬、猫遗传距离最近。 相似文献
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为了解2012-2013年四川省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异背景和分子流行病学情况,对PRRSV阳性病料中的Nsp2、ORF5基因进行RT-PCR扩增和序列测定,所获得的序列分别与美洲型代表株(VR2332)、欧洲型代表株(LV)、标准毒株和变异毒株进行相似性分析。结果本研究成功获得8条Nsp2基因序列和17条ORF5基因序列,序列分析表明所有PRRSV流行毒株均属于美洲型,其中8株Nsp2基因序列与标准毒株和变异毒株的核苷酸相似性分别为75.2%~88.6%和94.8%~97.1%,推导的氨基酸相似性分别为58.7%~79.2%和92.8%~94.8%;17株ORF5基因序列与标准毒株和变异毒株的核苷酸相似性分别为90.1%~96.6%和95.6%~99.4%,推导的氨基酸相似性为77.2%~93.0%和88.0%~96.8%;与标准毒株相比,8株Nsp2基因有30个不连续氨基酸缺失,17株ORF5基因序列有点突变。从遗传进化分析看,所有流行毒株均属于PRRSV亚群Ⅲ。 相似文献
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为了解猪轮状病毒(PoRV)在MARC-145细胞系上的培养特性及增殖规律,本试验利用MARC-145细胞,从四川仔猪腹泻样品中分离到1株PoRV,并通过PCR检测、病毒理化实验与微量中和实验证实,命名为SC-R株。用含不同浓度胰酶营养液培养SC-R株48h后,分别收集病毒液进行定量分析;同时,以SC-R分离株感染MARC-145细胞,在感染后不同时间分别收集感染病毒液,利用PoRV荧光定量检测方法对不同样品中病毒RNA进行定量分析,绘制PoRV生长曲线。结果表明,用含3%胰酶营养液培养的细胞液中PoRV的RNA含量明显高于其他组;-步生长曲线显示细胞外病毒RNA含量呈“s型”曲线增长,感染后0~8h为潜伏期,病毒RNA含量维持在较低水平;8~36h为突破期,病毒RNA含量呈对数增长;感染48h增长速度减缓,维持在较高水平,逐步进入稳定期。胰酶可增加PoRV对细胞的感染性,3%是本试验最为适用的胰酶浓度;PoRV感染MARC-145后在细胞内增殖并逐步释到细胞外。 相似文献
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猪细小病毒VLPs供外源蛋白插入的候选位点发现及其重组PCV2-ORF2的病毒样颗粒构建 总被引:2,自引:0,他引:2
先将猪细小病毒(PPV)SC-1株VP2基因扩增产物克隆到pMD18-T载体构建质粒pMD-VP2;设计两对引物(分别引入Hind Ⅲ和Sac Ⅰ两个酶切位点)扩增猪圆环病毒二型(PCV2)SC株ORF2基因,构建了pMD-ORF2.A和pMD-ORF2.B两质粒;经相应内切酶酶切后回收目的片段,插入PPV SC-1株VP2基因的Hind Ⅲ和Sac Ⅰ两个特异限制酶切位点处(分别对应于PPV VP2蛋白N端和C端1/3处),得到重组质粒pPVP2-ORF2.A和pPVP2-ORF2.B.经鉴定后的质粒pPVP2-ORF2.A和pPVP2-ORF2.B用Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ和ApaL Ⅰ三酶切,回收含VP2和ORF2基因的目的片段克隆至真核表达载体(pEGFP-C1),得到重组质粒pEGFP.VO.A和pEGFP.VO.B.脂质体法转染重组质粒于Cos7细胞后,采用荧光显微镜和电镜观察基因表达情况,结果仅在转染pEGFP.VO.A的样品中观察到了病毒样颗粒(VLPs).纯化VLPs免疫小鼠,结果显不能产生较好的细胞免疫和针对PPV和PCV2的特异性体液免疫,该结果表明研究中获得了PCV VP1-PCV2ORF2重组VLPs,同时也揭示PPV VPLs的N端1/3适于外源蛋白插入构建重组VLPs 相似文献
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本文报道应用ABC-ELISA和SPA-ELISA检测狂犬病疫苗免疫犬后血清中抗体的效价,比较研究了两种方法的特异性,敏感性和重复性,结果显示两种方法均适用于检测狂犬病血清抗体水平。ABC-ELISA较SPA-ELISA敏感性高4倍,前者的阳性检出率(100%)高于后者(92.8%)。 相似文献