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鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4基因的克隆、表达与免疫学检测方法 总被引：1，自引：0，他引：1
根据鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,Cy HV-2)ORF 4基因序列(Gen Bank:JQ815364.1)设计特异性引物,PCR扩增得到ORF 4基因编码框全长序列1 041 bp,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-ORF 4。将p ET-32a-ORF 4重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到融合表达的重组蛋白,融合表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,其分子质量约为57 ku,与预期大小一致。将纯化的重组蛋白免疫日本大耳兔,制备了多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000,Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接免疫荧光检测结果表明:该多克隆抗体可与由Cy HV-2感染引起细胞病变的异育银鲫脑组织细胞(GICB)发生特异性的结合。 相似文献
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为探究本实验室分离的传染性皮下及造血组织坏死病毒NJ株(IHHNV-NJ)ORF3基因编码蛋白的结构特征,本实验根据ORF3基因序列设计引物,利用PCR方法克隆ORF3基因序列,并构建至原核表达载体p ET-32a(+)中。对成功构建的p ET32a-ORF3重组表达载体进行原核表达,获得49 ku的融合蛋白,符合预期大小。通过生物信息学软件对ORF3基因编码蛋白序列进行分析,结果显示,ORF3基因序列长度为990 bp,编码329个氨基酸;ORF3基因编码蛋白理论分子质量为37 385.2 u,等电点为7.22,为亲水性蛋白;该编码蛋白序列不存在跨膜区、信号肽切割位点;二级结构含有55.9%的α-螺旋、52.0%的β-折叠以及13.4%的β-转角;抗原表位分布较广泛,抗原性强;该编码蛋白序列不存在潜在的N-糖基化位点,存在13个潜在的O-糖基化位点和17个潜在的磷酸化位点。进化树结果表明,NJ株的ORF3基因编码蛋白序列与6株IHHNV序列同源性均高于96%,与厄瓜多尔株同源性最高,为99.7%。研究表明,ORF3基因编码IHHNV衣壳蛋白;O-糖基化位点可参与衣壳蛋白的组装过程及细胞侵染过程,磷酸化位点可参与病毒在对虾细胞内的增殖过程;ORF3编码蛋白序列保守性强,不影响病毒毒力和个体间感染能力。 相似文献
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为了研究生殖调控分子VASA在河南华溪蟹性腺发育过程中的表达模式和功能,本研究制备了VASA蛋白特异的多克隆抗体。选取河南华溪蟹vasa基因813 bp的特异区段,克隆到p ET32a载体,构建了原核表达载体p ET32a-Shvasa,转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达和SDS-PAGE检测。结果显示,47 ku的VASA融合蛋白在菌液上清液中大量存在。VASA融合蛋白经Ni-NTA His-Bind亲和层析柱分离纯化后,免疫新西兰大白兔,制备了河南华溪蟹VASA蛋白的多克隆抗体。ELISA检测显示,VASA蛋白多克隆抗体的效价高达1.0×105。进一步通过免疫吸附实验和Western blot方法鉴定抗体特异性,研究表明,获得的多克隆抗体不仅能识别VASA融合蛋白,而且能特异识别河南华溪蟹卵巢中的天然VASA蛋白。研究为鉴定河南华溪蟹及其他蟹类生殖细胞提供了有效手段,为进一步解析十足目动物VASA蛋白的功能提供了分子基础。 相似文献
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为了对鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)ORF136基因编码蛋白进行功能研究和血清学诊断,本实验通过对ORF136基因推导的第31~157位氨基酸序列进行PCR扩增,并与原核载体pET-32a(+)连接,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态后进行IPTG诱导表达,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus)以制备ORF136多克隆抗体,运用Western blot和间接免疫荧光技术对抗体进行鉴定。结果表明,重组融合表达蛋白大小与预期一致,约为35 kD,且主要分布在包涵体中。Western blot分析显示,免疫兔后获得的纯化ORF136多克隆抗体能特异性识别纯化的CyHV-3和感染CyHV-3的KS细胞;间接免疫荧光分析进一步表明ORF136多抗能识别感染CyHV-3的KS细胞。ORF136多克隆抗体的制备为ORF136蛋白功能研究和CyHV-3血清学诊断方法的建立提供了重要基础。 相似文献
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锦鲤疱疹病毒ORF72基因克隆及结构功能分析 总被引：1，自引：0，他引：1
于辽宁丹东采集感染锦鲤疱疹病毒的活鲤Cyprinus carpio样品,经DNA提取、PCR扩增、重组质粒构建步骤成功克隆锦鲤疱疹病毒ORF72基因,并利用生物信息学软件分析ORF72蛋白结构与功能,构建系统进化树。结果显示:ORF72基因开放阅读框共1113bp,编码蛋白由370个氨基酸组成,理论相对分子质量为40.5KD;ORF72蛋白主要由α螺旋、β折叠、无规则卷曲3种二级结构组成;N端35个氨基酸序列为信号肽序列。跨膜结构分析表明:ORF72蛋白无跨膜区,保守结构域预测表明ORF72含有一个保守结构域,抗原表位分析表明,抗原性较好。结构预测显示:ORF72氨基酸序列存在2个潜在的N-糖基化位点、1个潜在的O-糖基化位点、19个潜在的磷酸化位点。系统进化树分析发现,其与锦鲤疱疹病毒美国株、以色列株属同一分支。 相似文献
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鳜传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidhey necrosis virus,ISKNV)全基因组序列于2001年完成测定,全基因组为111 362 bp,含有124个推测的开放阅读框(ORF).21307年,Eaton等对12株已完成序列测定的虹彩病毒代表株进行分析比较,除了已经推测的ORF外,认为ISKNV基因组中还存在一个的核心基因(core gene)ORF90.5L.本研究以ISKNV的cDNA为模板,根据Eaton等报道中推测的上下游位点设计引物扩增出一段963 bp的PCR产物.该序列编码一个320个氨基酸的蛋白质,推测分子量为35 kD,含有预测的跨膜区,与虹彩病毒属(Iridovirus)其他成员编码的肉豆蔻基膜蛋白有较高的同源性.将该片段克隆到原核表达载体pET32a(+)中,纯化表达的重组蛋白pET90.5L免疫昆明鼠获得高效价多克隆抗体.利用抗pET90.5L抗体与纯化病毒进行免疫印迹,结果表明,抗pET90.5L的多抗可以特异性识别病毒粒子中大小约为35 kD的蛋白条带,ORF90.5L编码的蛋白应为病毒的结构蛋白.本研究旨在为ISKNV基因工程疫苗的研发和病源侵染机制研究提供基础参考. 相似文献
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锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF81基因的克隆及生物信息学分析 总被引：2，自引：1，他引：1
为了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ) ORF81蛋白的结构特征和进化关系,用框镜鲤尾鳍原代细胞增殖KHV-CJ,提取其DNA,经PCR扩增,获得ORF81基因,将其克隆到pMD18-T载体中,构建重组质粒.应用生物信息学方法初步分析KHV-CJ ORF81基因的结构和功能,并与GenBank上已公布的3株KHV构建系统进化树.结果显示,获得了长771 bp的ORF81基因,编码256个氨基酸;预测ORF81基因的理论分子量为28 246.50 u,等电点为8.404;疏水性大于亲水性;信号肽切割部位最可能位于29位的S(丝氨酸);有4个跨膜区;抗原表位预测显示抗原性良好;结构预测显示,不存在N-糖基化位点、存在6个O-糖基化位点和11个磷酸化位点;系统进化树分析显示,与锦鲤疱疹病毒以色列株属同一分支. 相似文献
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为实现黄鳝血清转铁蛋白基因的原核表达并制备其多克隆抗体,利用基因特异性引物从黄鳝肝脏cDNA中扩增黄鳝转铁蛋白的C端序列,亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建pET/Tf-C重组表达载体;转化大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导。利用Ni离子亲和层析技术纯化Tf-C蛋白,并免疫新西兰兔制备多克隆抗体;通过间接ELISA技术和组织蛋白印迹对制备的多克隆抗体进行检测。试验结果表明,成功构建pET/Tf-C原核表达载体,并实现了蛋白的表达和纯化;制备的多克隆抗体效价大于1∶25 600,并能特异性地识别来源于黄鳝不同组织的血清转铁蛋白。研究结果对黄鳝血清转铁蛋白功能的研究奠定了基础。 相似文献
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抗冻蛋白AFPⅢ的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备 总被引：1，自引：0，他引：1
采用基因重组技术将AFPⅢ基因与原核表达载体pET32a(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),通过PCR、单双酶切及测序鉴定构建结果.用IPTG诱导蛋白表达,将融合蛋白纯化后,免疫6-7周龄的小白鼠,制备AFPⅢ多克隆抗体,采用Western印迹法检验抗体特异性.通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定多克隆抗体滴度.成功地构建了AFPⅢ的原核表达载体,经在大肠杆菌中诱导表达、镍柱亲和层析纯化,得到较纯的相对分子质量约26 000 Da的融合蛋白,免疫小白鼠后得到多抗血清,Western印迹结果显示此多克隆抗体与AFPⅢ蛋白特异性结合.该试验为进一步研究AFPⅢ在转基因鱼中的定点表达以及作用机制奠定了基础. 相似文献
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为获得尼罗罗非鱼Siglecs like融合蛋白,开展相关Siglecs like蛋白的功能研究,深入了解罗非鱼与无乳链球菌相互作用机制。本研究利用前期构建的3个含Siglecs like ORF的克隆质粒,PCR扩增获得Siglec-1、Siglec-4b和Siglec-14 like的膜外段序列,插入真核表达载体pc DNA3.1(+)h Ig G1 Fc中,双酶切、测序鉴定后转染COS-7细胞。q PCR、Western-blot对目的蛋白的表达进行检测;亲和层析法纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳检测纯化效率。ELISA检测融合蛋白与GBS的结合活性。测序结果显示,成功构建3个融合蛋白真核表达载体pc DNA3.1(+)h Ig G1 Fc-Siglecs like/Ex。检测结果显示,转染细胞中3个Siglecs/Ex-Fc融合蛋白在mRNA和蛋白水平都有高效表达,且过柱后的融合蛋白具有较高纯度;3个融合蛋白与罗非鱼源GBS的结合活性较对照组均有显著差异。研究表明,利用真核表达系统成功制备了具有较高纯度的尼罗罗非鱼3种Siglecs融合蛋白,且均有与GBS的结合活性。 相似文献
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淇河鲫IL-8原核表达系统的构建及多克隆抗体的制备与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为揭示淇河鲫(Carassius auratus var.Qihe)白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)的功能,本研究构建了原核表达系统,并制备了兔抗鲫IL-8多克隆抗体。首先采用RT-PCR法扩增淇河鲫IL-8基因编码序列中不含信号肽的基因片段,克隆到pET-32a(+)载体后转化入Rosetta菌株构建原核表达系统。经IPTG诱导表达出相对分子质量约27.8 kD的目标融合蛋白。将纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,效价达1︰10~5。经免疫亲和层析纯化的抗体能特异性识别重组和天然的淇河鲫IL-8蛋白。比较不同组织的免疫组化和荧光定量PCR结果,IL-8蛋白量和mRNA的表达量在不同组织间变化趋势一致,在肌肉、脾和头肾均检测到较高的表达量,肠道的表达量较低。本研究为进一步探讨淇河鲫IL-8的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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选用对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)囊膜蛋白VP37的功能区段,利用大肠杆菌密码子偏爱性,在氨基酸不变的情况下将VP37中的密码子通过人工合成改为大肠杆菌偏爱型密码子,并克隆至表达载体pBAD/gIIIA中,构成重组载体pBAD/gIIIA-VP37p′.将重组载体转化入大肠杆菌Top10中,在相同条件下用L-阿拉伯糖与未优化的重组菌株Top10-pBAD/gIIIA-VP37p一同诱导.结果显示,与野生型基因VP37p相比,经密码子优化的VP37p′基因表达目的蛋白量占总蛋白的40.5%,明显高于野生型6.5%的目的蛋白表达量. 相似文献
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为了对鱼类病毒性出血性败血症病毒(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)基质蛋白(matrix protein, M)进行功能研究,本实验通过PCR扩增了M基因全长序列,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用间接ELISA检测抗体效价,并运用Westernblot和间接免疫荧光检测抗体特异性。结果显示,M基因全长为606bp,IPTG诱导得到的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,大小约为36 kD,比预计略小。间接ELISA检测抗体效价大于1:102400,Westernblot检测显示该抗体可以特异性识别纯化的融合蛋白和VHSV感染的鲤上皮瘤(epithelioma papulosum cyprini, EPC)细胞中的M蛋白。间接免疫荧光结果显示M蛋白多抗能识别感染VHSV的EPC细胞中的M蛋白,且M蛋白主要定位于细胞质和细胞膜。本研究中M蛋白多克隆抗体的制备将有助于开展M蛋白的功能研究及疾病的免疫学诊断。 相似文献
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为了研究罗非鱼罗湖病毒(tilapia lake virus, TiLV) ORF10 蛋白的功能, 从染病莫桑比克罗非鱼(Oreochromis niloticus)脾脏和肝脏组织中克隆获得 TiLV ORF10 基因编码序列, 并成功构建了荧光定位载体 pEGFP-ORF10 和重组表达载体 pET32a-ORF10。将荧光定位载体 pEGFP-ORF10 转染鲤(Cyprinus carpio)上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprinid, EPC), 经荧光显微镜观察, 在 EPC 的细胞核中观察到绿色荧光信号, 表明该蛋白定位于细胞核中。将重组载体 pET32a-ORF10 转化大肠杆菌 BL21(DE3)进行目的融合蛋白表达, 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表明, His-TiLV ORF10 融合蛋白成功表达并主要存在于上清液中。随后, 采用 Ni-NTA 亲和层析的方法纯化融合蛋白 His-TiLV ORF10, 以其为抗原多次免疫 Balb/C 小鼠, 制备多克隆抗体。蛋白印迹法(WB)分析显示, 制备的抗体可以特异性识别 His-TiLV ORF10。利用蛋白印迹法进一步对感染 TiLV 莫桑比克罗非鱼的不同来源组织进行检测, 结果显示, TiLV ORF10 蛋白在染病莫桑比克罗非鱼肌肉、脾脏、肝脏和肾脏中的表达存在较大差异, 其中以肝脏和肾脏组织表达量为最高, 脾脏次之, 肌肉中表达量最低。本研究为深入了解 TiLV ORF10 蛋白的功能和病毒侵染与致病等机理提供了重要基础。 相似文献
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草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体制备及其特异性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为了制备高效的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体并对其特异性进行鉴定,实验以草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型HZ08株为模板,采用PCR方法扩增S9基因,将该S9基因与p ET-32a(+)载体连接构建p ET-32a-S9原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)后用IPTG诱导表达;纯化后的重组VP6蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,使用间接ELISA方法测定抗体效价,Western blot和IFA试验鉴定抗VP6蛋白多克隆抗体特异性。结果显示草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的S9基因在原核表达载体中能够正确地表达VP6蛋白,纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备的抗VP6多克隆抗体,经间接ELISA方法测定其效价约为1∶105,Western blot和IFA试验结果显示制备的多克隆抗体能特异性识别GCRVⅡ型毒株,而不能识别GCRV I型、Ⅲ型以及其它病毒,表明该多克隆抗体具有较高的特异性。研究表明制备的抗VP6蛋白多克隆抗体能够特异性识别GCRVⅡ型病毒,为GCRVⅡ型病原学研究及草鱼出血病临床诊断奠定基础。 相似文献
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锦鲤疱疹病毒囊膜蛋白ORF59的克隆、分析及其主要B细胞表位区的原核表达 总被引：5，自引：0，他引：5
从感染锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus,KHV）的锦鲤（Cyprinus carpiokoi）肾脏组织中提取DNA,通过PCR扩增了KHVORF59基因。该基因全长411bp,所编码的蛋白包含136个氨基酸,分子量14.3kDa,等电点（PI）6.91,有12个潜在的O糖基化位点。此研究克隆的KHVORF59基因第130位碱基由G突变为A,使其编码的第44位氨基酸由Ala突变为Thr。采用DNAStar程序,在综合分析二级结构柔性区、蛋白的亲水性、表面可能性和抗原性指数的基础上,预测了KHVORF59蛋白主要B细胞表位,并将其区段的编码序列与KHVORF59完整编码序列分别克隆入原核表达载体pET-32a（＋）,构建重组质粒pET32a-ORF59S和pET32a-ORF59C,转入大肠杆菌Rosetta菌株,IPTG诱导表达。SDS-PAGE及WesternBlot分析显示,pET32a-ORF59S可以高效表达,表达的截短KHVORF59蛋白主要以可溶性形式存在,采用HisBindResin填料,层析纯化了该截短蛋白。 相似文献
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为研究锦鲤疱疹病毒3型(KHV-3)ORF126基因编码蛋白的功能,我们对该蛋白的结构特征进行研究分析。本实验采用PCR扩增技术获得KHV ORF126基因的完整序列,构建pMD19-T-ORF 126重组质粒,应用生物信息学方法分析ORF126基因编码蛋白的理化特征。结果显示:KHV ORF126基因翻译合成273个氨基酸;ExPasy预测该蛋白的理论分子量为29.9kDa,等电点为5.11;信号肽的切割部位最可能位于第19~20位氨基酸之间;跨膜区位于第145~168位氨基酸;抗原表位预测显示抗原性良好;编码蛋白不含N-糖基化位点,含有4个O-糖基化位点和17个磷酸化位点。 相似文献
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一种基于Ⅱ型鲤疱疹病毒衣壳蛋白72的免疫学检测方法 总被引：4，自引：1，他引：3
Ⅱ型鲤疱疹病毒(cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)是引起养殖异育银鲫(Carassius auratus gibelio)造血器官坏死症的致病病原。在临床筛查中基于病毒核酸的PCR和real time PCR技术已经建立,但是稳定性更强的免疫学诊断技术国内外尚无报道。本研究目的是利用Cy HV-2编码的ORF72基因(Gen Bank登录号:AFJ20502.1)所编码的衣壳蛋白作为捕获抗原,通过识别感染病毒的鱼体中的相应抗体,从而对样本进行临床免疫学检测。首先采用PCR方法从纯化的Cy HV-2基因组中扩增ORF72基因,并把该基因克隆至原核表达载体PGEX-4T-3,并转化到大肠杆菌中诱导表达,诱导表达的产物通过SDS-PAGE进行鉴定,对表达的重组蛋白进行纯化。用已纯化的72重组蛋白对小鼠进行免疫,制得72重组蛋白的抗体。Western blot检测表明所制备的多克隆抗体既能识别原核表达的重组蛋白,也可以识别Cy HV-2病毒粒子上的衣壳蛋白72。在上述基础上建立了基于Western blot技术的Cy HV-2抗体检测技术:用纯化的72重组蛋白作为检测抗原,鲫鱼血清用作一抗,兔抗鲫Ig M多克隆抗体作为二抗,酶标羊抗兔作为三抗鉴定鲫鱼是否存在Cy HV-2特异性抗体。在对急性感染期的临床样本检测中,本方法能在所有样本中检测出ORF72特异性抗体存在,表明72重组蛋白作为相应抗体捕获原可以用于确诊鲫鱼是否感染Cy HV-2。本研究建立的实验室免疫学检测方法为商品化免疫学检测技术的开发奠定了基础,对Cy HV-2的检验检疫具有一定的临床应用价值。 相似文献
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为深入研究鱼类干细胞多能性转录因子Nanog的功能,本实验进行了团头鲂Nanog基因的原核表达和多克隆抗体的制备。首先,从团头鲂卵巢克隆出Nanog基因的编码区,将其连接到p ET32a载体上构建原核表达载体。接着将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得预期大小的Nanog重组蛋白,并获得大量蛋白以制备抗体。最后通过ELISA检测抗体的效价和采用Western blot技术检测Nanog抗体的特异性。结果显示,在37°C,0.5 mmol/L IPTG诱导4 h可获得Nanog重组蛋白的高效表达;制备的多克隆抗体能够有效识别原核表达的Nanog蛋白及团头鲂肝脏和精巢的内源Nanog蛋白;该抗体也可应用于检测HepG2细胞中过表达的团头鲂Nanog蛋白。本研究为蛋白的原核表达和特异性抗体的制备及验证提供了研究思路,也为研究鱼类Nanog基因功能提供了特异性抗体。 相似文献