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根据无乳链球菌的cfb基因和海豚链球菌16SrRNA基因序列,设计、合成2对引物,优化扩增条件,建立了快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌的双重PCR方法.用该方法扩增无乳链球菌和海豚链球菌,可分别获得474、296bp的特异性片段,扩增嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌等其他常见鱼病原菌无特异性片段.该方法可实现对无乳链球菌和海豚链球菌的快速鉴别,具较高的灵敏度,可检测到基因组含量分别为3.2×10-3ng/μL的无乳链球菌和3.0×10-2ng/μL的海豚链球菌.对采集自广东与海南两省养殖罗非鱼病鱼的11份病原样品进行检测,均可获得474bp片段,测序与BLAST分析结果表明,扩增到的序列均为无乳链球菌cfb基因序列,可从分子水平上确定这些样品为无乳链球菌,与生化鉴定结果一致. 相似文献
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从患病草鱼C tenopharyngodon idella体表病灶上分离到一株优势菌,经分离纯化培养制成细菌悬液,分别以腹腔注射和浸泡两种方式感染草鱼。结果表明：该菌株能感染草鱼,且具较强毒力,腹腔注射0.2mL该菌液（3×109cfu/mL）,可导致受试草鱼100%死亡;创伤浸泡感染（3×108cfu/mL）,死亡率也达100%,受感染鱼出现与自然感染相似的类似赤皮病症状。对该病菌进行形态特征观察和主要理化特性分析,初步鉴定为铜绿假单胞菌Pseudom onas aeruginosa。进一步对该菌进行分子鉴定,共选用16S rRNA、RNA聚合酶β亚单位（rpoB）和促旋酶亚单位蛋白（gyrB）3个基因进行鉴定分析。序列克隆与BLAST分析结果显示,这3个基因均与GenBank上登录的铜绿假单胞菌的相应序列具有很高的同源性,16S rRNA、rpoB和gyrB基因与已知铜绿假单胞菌相应序列的同源性分别在99%、98%和93%以上。综合生理生化与分子鉴定结果,可判定所分离的菌株为铜绿假单胞菌。药敏试验结果显示：该菌对阿米卡星、菌必治、氟哌酸和妥布霉素等11种药物高度敏感,对链霉素和庆大霉素中度敏感,对罗红霉素、红霉素、四环素、苯唑青霉素、新霉素和头孢氨苄等16种药物具有耐药性。 相似文献
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草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株VP5蛋白的原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
根据草鱼呼肠孤病毒广东株GCRV-GD108编码VP5的M5基因的cDNA序列,分别设计合成带特定酶切位点的特异引物,进行PCR扩增;通过酶切与连接,构建2种重组表达载体pET30c-M5和pColdⅡ-M5,分别转化于大肠杆菌并进行诱导表达;对培养基、诱导时间、诱导剂浓度和温度等条件进行优化,确定最适表达体系.通过SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定.结果显示,所构建的2种VP5蛋白原核表达载体,均在大肠杆菌中成功表达了分子质量大小(约80 ku)与预期相符的重组蛋白,表达产物主要存在于包涵体中.诱导表达后的菌体经离心、洗涤与超声破碎,离心收集包涵体.包涵体通过变性、透析与复性,获得纯化的重组蛋白,其中pET30c-M5/BL21 (DE3) 工程菌的目的蛋白占全菌蛋白的22.5％,纯化后获得了高纯度的重组蛋白(＞95％).比较2种表达载体的表达结果,pET30c-M5具有诱导表达耗时少、获得重组蛋白量大的优势,可为下一步的研究提供足量的蛋白. 相似文献
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为明确山东省胶东地区葡萄白腐病菌Coniella diplodiella对抑霉唑的敏感性及抑霉唑与常规杀菌剂之间的交互抗性,采用菌丝生长速率法测定葡萄白腐病菌对抑霉唑等杀菌剂的敏感性,并通过分析抑霉唑与戊唑醇、吡唑醚菌酯、福美双、多菌灵、代森锰锌毒力的相关性,判断抑霉唑与各药剂之间是否存在交互抗性。结果表明,供试69株葡萄白腐病菌菌株对抑霉唑的EC50在0.13~55.53 μg/mL之间,最高值与最低值相差427.15倍;其频数分布图呈多峰曲线,第一主峰内EC50平均值为6.34 μg/mL,可作为胶东地区葡萄白腐病菌对抑霉唑的敏感基线。与敏感基线相比,田间已出现抑霉唑低抗菌株,占检测总株数的8.70%,未检测到中、高抗菌株。选择3个抗性菌株连续继代培养10代后,其对抑霉唑的敏感性明显提高,说明其抗药性不能稳定遗传。抑霉唑EC50对数值与戊唑醇、吡唑醚菌酯、福美双、多菌灵、代森锰锌的EC50对数值之间的相关系数分别为0.799、-0.143、-0.089、-0.268和0.159,说明抑霉唑与戊唑醇存在一定的交互抗性,但与其他4种药剂之间不存在交互抗性。表明抑霉唑可用于胶东地区田间葡萄白腐病的有效防控。 相似文献
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肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MYH)是骨骼肌粗肌丝的重要组成单位,其表达量高低影响肌纤维的组成和肌肉生长.为了解其在翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)早期生长过程中的作用,本研究从前期生长差异显著的2组(快长组和慢长组)翘嘴鳜幼鱼转录组差异表达Unigene中筛选出2个MYH基因,RACE (Rapid amplification of cDNA ends)克隆到其全长cDNA(MYH-7a,MYH-7b).MYH-7a全长为6071bp,开放阅读框为5820 bp;MYH-7b全长为5896 bp,开放阅读框为5745 bp.序列分析显示,2个MYH均有Loopl、Loop2环、ATP结合位点等关键结构域;进化树聚类分析显示,MYH-7a与MYH-7b均属于慢肌球蛋白.实时荧光定量PCR验证发现,其在快长组样本中表达量显著高于慢长组,与转录组测序结果一致;检测其在翘嘴鳜心肌、红白肌和皮肤等14种组织的表达水平,结果显示,MYH-7a主要在心肌中表达,而MYH-7b主要在红肌中表达;在胚胎发育不同阶段,二者随着胚胎发育的进行,表达量不断增加;在幼鱼早期生长过程(孵化出膜后15 dph、30 dph和60 dph)的翘嘴鳜白肌中,在15 dph和30 dph快长组的表达量显著高于慢长组,而到60 dph时快长组的表达量均显著低于慢长组.翘嘴鳜MYH-7a、MYH-7b在快长组与慢长组鱼中的差异表达提示它们在翘嘴鳜胚胎及其早期生长发育过程中发挥重要作用. 相似文献
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奥利亚罗非鱼3种C型溶菌酶基因的克隆及其序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究结合RT-PCR和RACE法获得了奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)三种C型溶菌酶基因C-1,-2和C-3的全长cDNA.3个基因的cDNA分别为581 bp、662 bp和695 bp,各编码143、156和143个氨基酸(GenBank accession No:EU913095,EU913094和EU836689),相互间氨基酸序列的同源性在63.9%~67.8%之间.3个基因均具有与其它物种C型溶菌酶相同的8个保守半胱氨酸残基和2个活性位点Glu~(35)和Asp~(52),可认为它们均为C型溶菌酶基因.在系统进化树中这3个基因首先与同属高等真骨鱼类的聚类,最后再与低等真骨鱼类的聚类,系统进化关系与传统鱼类分类地位相吻合,显示真骨鱼类C型溶菌酶的进化速度与物种的进化速度基本一致.蛋白分析软件分析显示这3个基因均具有C型溶菌酶的典型结构、相似的蛋白二、三级结构,推测应具有与C型溶菌酶相似的生理功能.但3个基因氨基酸序列间存在一定差异,其中C-1的等电点较低且碱性氨基酸较少,因此3种溶菌酶可能具有生理功能上的差异与分工. 相似文献
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采用菌丝生长速率法测定了山东省胶东地区52株葡萄白腐病菌Coniella diplodiella对吡唑醚菌酯的敏感性，检测了水杨肟酸 (SHAM) 对葡萄白腐病菌菌丝生长及其对吡唑醚菌酯敏感性的影响，并通过室内毒力测定及田间防效试验比较了吡唑醚菌酯与其他4种不同作用机制药剂的毒力。结果显示:添加SHAM (20 μg/mL) 能够显著提高葡萄白腐病菌对吡唑醚菌酯的敏感性 (F = 5.5017，P = 0.0388)，与吡唑醚菌酯单独作用相比，添加SHAM后吡唑醚菌酯对葡萄白腐病菌的毒力提高了1.17倍。供试葡萄白腐病菌对吡唑醚菌酯整体仍表现为敏感，EC50值在0.176~6.012 μg/mL之间，平均值为 (2.826 ± 1.670) μg/mL，其敏感性频率分布呈连续单峰曲线，且符合正态分布，因此可将该EC50平均值 (2.826 ± 1.670) μg/mL作为山东省胶东地区葡萄白腐病菌对吡唑醚菌酯的相对敏感基线。戊唑醇、福美双、代森锰锌及多菌灵对葡萄白腐病菌的EC50值分别在0.364~16.873、5.236~25.562、15.912~84.778和1.819~568.690 μg/mL之间，葡萄白腐病菌对吡唑醚菌酯的敏感性与对戊唑醇的相当，显著高于对福美双、代森锰锌和多菌灵的敏感性。研究结果可为田间防控葡萄白腐病的药剂选择及合理轮换使用提供理论依据。 相似文献
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以乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）为材料,采用复乳溶剂挥发法制备无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）全菌及超声破碎后的上清微球疫苗。显微镜观察显示随着 PLGA 质量浓度、PVA（聚乙烯醇）质量浓度和外水相体积的增加,上清微球平均粒径均随之增大。最终确定上清微球制备条件为 PLGA 质量浓度25 mg·mL -1、PVA 质量浓度1 mg·mL -1、外水相体积20 mL。全菌微球制备条件与上述的相比,仅 PVA 质量浓度调整为2 mg·mL -1。扫描电镜观察显示全菌和上清微球平均粒径分别为9.4μm 和3.9μm,微球均呈球形。BCA（二喹啉甲酸）法分析显示包封率分别为68.07％和63.49％;载药量分别为5.49＆#215;108个·mg -1和3.58％;28 d 体外累积释放量分别为64.2％和82.8％。 相似文献