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1.
采用RT—PCR方法对疑似PRRS阳性病料进行克隆和测序获得了0RF7基因片段。序列分析结果表明获得的0RF7基因序列不存在缺失现象。与美洲型代表毒株VR-2332的核苷酸序列的同源性为91．3％,氨基酸同源性为92．6％;与我国最早的PRRSV分离株CH—la相比,核苷酸同源性为93．5％,氨基酸同源性为92．6％;与我国高致病性PRRSV毒株SD—ZQ的核苷酸同源性最高为98．1％,氨基酸只有两个不同,同源性为98．3％;与本省的Hn-1／06毒株的核苷酸同源性为97．3％,氨基酸同源性为97．5％;与2004年分离的FJ-2株与ORF7基因的核苷酸差异稍大为85．4％,氨基酸同源性为88．6％;与欧洲型分离株LV株和N-34株0RF7基因的核苷酸差异很大,同源性仅为41．1％和40％,氨基酸同源性为47．1％和47．6％。表明所获得序列的流行毒株属于美洲型,但其毒力已发生了变异。 相似文献
2.
参考Genbank中的序列设计1对特异性引物对1株疫苗株和6株广西分离株的P32基因进行全基因序列测定和分析。结果显示,广西分离株间的核苷酸同源性为99．4％～100．0％,与疫苗株间的同源性为99．6％～99．9％,与Genbank中已发表山羊痘序列间的同源性为99．3％～99．8％;推导的氨基酸同源性为98．1％～100．0％、98．8％～99．7％、97．8％～99．4％;与国内疫苗毒株相比,广西分离株在100～105位缺失了6个碱基A,在651位所有广西分离株核苷酸的碱基全部由T变为C,647～652位核苷酸构成由TGTATA变异为TGTACA,多了1个限制性内切酶Bsp1407 I位点。研究结果为深入了解广西山羊痘分离株的分子特性以及山羊痘的诊断与防治奠定了基础。 相似文献
3.
参考相关资料,针对支气管败血波氏杆菌Bordetella bronchiseptica FlaA基因上游序列选择合成1对特异性引物,对贵州分离株（B8株和B27株）进行PCR扩增,将扩增产物连接在pMD18-T载体上,并转化到DI-L5a感受态细胞中,提取重组质粒进行PCR和双酶切鉴定后测序。结果获得分子长为237bp的特异性DNA片段;核苷酸同源性分析表明,贵州分离株间的同源性高达99．1％,与Bb参考株的同源性为97．8％～99．6％,与Bpp参考株的同源性为95．6％-97．4％;系统进化树分析表明,贵州分离株与Bb参考株亲缘关系较近,而与Bpp参考株亲缘关系远。 相似文献
4.
根据GenBank中牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis,M.bovis）的ESAT-6基因序列（No：BX248347）设计1对引物,PCR扩增获得2株牛分枝杆菌广西分离株（mt359、mt370）,纯化产物与pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α,对经双酶切和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序及同源性比较分析。结果表明,牛分枝杆菌广西分离株mt359、mt370与GenBank中已发表的6株毒株（5株结核分枝杆菌和1株牛分枝杆菌）的核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性均为100.0%,与牛分枝杆菌标准株C680001的核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性均为96.6%。说明致病性牛分枝杆菌的ESAT-6基因十分保守,不存在种间差异。 相似文献
5.
参照GenBank上猪圆环病毒1型（PCV1）全基因组序列设计1对引物,用PCR技术从北京一猪场的临床发病猪病变组织中扩增和克隆获得1株PCV1全基因组序列,并进行序列测定和分析。全基因组序列结果显示,该株PCV1基因组全长为1759bp,与国内外其他各株PCV1的核苷酸同源性为99．4％。主要开放阅读框（ORF）序列结果显示,该分离株与国内外其他PCV1毒株间的ORF1与ORF2的核苷酸同源性分别在97．5％～99．8％和92．7％～100％。虽然各个PCV1分离株之间的全基因组与主要ORF的核苷酸同源性均很高,但仍然呈现出一定的地域相关性。 相似文献
6.
高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TJ株的分离与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
从某猪场发生高热死亡的仔猪病料中分离到1株病毒,该病毒在Marc-145细胞上增殖致细胞病变。经RT—PCR检测证明该分离株为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）。该毒株回归易感动物可产生明显的临床症状,并引起死亡,将其命名为PRRSV TJ毒株。对其Nsp2序列进行扩增测序,结果表明：与美洲标准毒株VR-2332相比,TJ株Nsp2序列缺失第481位和第532～560位氨基酸,二者核苷酸同源性为83．7％,其编码的氨基酸同源性为77．9％。本试验结果表明,该分离株为发生了变异的PRILSV,对猪具有高致病性。 相似文献
7.
在辣椒上分离到一株黄瓜花叶病毒分离物CP310，对其进行14种寄主植物生物学反应测定，发现CP310在心叶烟、克里夫兰烟等植物上表现致死症状，在番茄、烟草表现为植株明显矮化。根据已报道的黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因序列合成引物，采用常规RT-PCR方法对其外壳蛋白基因进行扩增并克隆，序列分析结果显示：该分离物外壳蛋白基因全长657个核苷酸，编码218个氨基酸，其核苷酸和氨基酸序列与所比较的CMV亚组I的分离物有很高的同源性，分别为91．0％～94．7％和96．0％～98．2％．与CMV亚组Ⅱ的同源性分别仅为76．6％～78．0％和76．0％～78．9％。 相似文献
8.
新疆牛环形泰勒虫Tamsl基因的克隆与序列分析 总被引：4，自引：2，他引：2
采用PCR技术,从新疆焦虫病疫区感染牛的全血中扩增到Tamsl基因,该基因长度为846bp,编码281个氨基酸。同源性分析表明,该基因与其他9个国际流行虫株的核苷酸同源性为93．6％～99．8％,氨基酸同源性为88．6％～99．6％。系统发育进化树分析表明,新疆分离株同印度株、毛利塔尼亚株、土耳其株、北非共和国株进化途径一致,与苏丹株和巴林株进化途径相差较远。氨基酸抗原决定簇分析发现新疆分离株编码的氨基酸有13个抗原决定簇。 相似文献
9.
根据GenBank中发表的已知猪圆环病毒2型(Porcine Circovims-2,PCV-2)全基因序列,自行设计2对特异性引物,从2株接种疑似断乳仔猪多系统衰竭综合征(post-weaning muhisystemic wasting syndrome,PMWS)仔猪病料的PK-15细胞中提取基因组DNA,以此为模板,用PCR方法分2段扩增2个PCV-2广东株(GZ株和ZS株)的全基因序列．应用序列分析软件DNAstar,对所测2组PCV-2序列与GenBank中的国内外PCV-2毒株进行同源性比较,并绘制系统进化发生树,进行了序列分析．结果表明,2个PCV-2广东株全基因组皆为1767bp,2个毒株间全基因序列核苷酸同源性为77．0％,第一开放阅读框(ORF1)间的核苷酸同源性仅为57．7％,而第二开放阅读框(ORF2)间的核苷酸同源性却高达99．1％．ZS株和GenBank中国内外其他的PCV-2参考毒株序列的核苷酸同源性在95．7％-99．5％之间;而GZ株和其他PCV-2参考毒株序列的核苷酸同源性仅在74．2％-77．1％之间． 相似文献
10.
根据Genbank犬瘟热病毒(CDV)毒株序列分别设计融合蛋白F和附着蛋白H全基因的2对引物，以2个CDV扬州分离株(CDV-YZ0101、CDV-YZ0102)为模板RT-PCR扩增出H基因和F基因2个片段，将其克隆进pGEM-Teasy载体，并进行序列分析。结果表明：H基因的开放阅读框架(ORF)为1824bp，2种分离株间核苷酸和编码氨基酸同源性达98％左右，与中国长春分离株、美国、日本分离株的同源性分别为96％、93％～95％和9。％～91％。氨基酸分析显示扬州分离株与其他分离株的H蛋白有8～9个可能的天冬酰胺糖基化位点，而OP-CDV疫苗株只有4个类似位点。扬州分离株与长春分离株同属一个系，与美国、日本分离毒株以及疫苗株相比，均存在着明显的差异。F基因ORF为1989bp，不同毒株间的核苷酸及编码氨基酸差异主要表现在信号肽区域，而编码的F0前体蛋白表现出较高同源性(97％～99％)，且所有的13个半胱氨酸残基、4个可能的天冬氨酰糖基化位点和2个疏水区域均完全一致。因此CDV F与H蛋白基因相比有很高的同源性，证明中国分离株与国外参考株有差异。 相似文献
11.
为了解轮状病毒在腹泻奶牛中的流行情况,从2008年12月到2009年6月,我们在大庆某牛场共收集117份小于7日龄新生牛的腹泻标本,用A群轮状病毒抗原诊断试剂盒对腹泻标本进行检测;应用MA104细胞对阳性标本进行分离,扩增细胞分离株保护性抗原VP7基因,并对该基因进行序列分析。腹泻标本中有10份标本(8.5%)经A群轮状病毒抗原检测试剂盒确认为阳性,成功的分离出一株轮状病毒,命名为:DQ-75,分离株DQ-75VP7基因的基因型是G10,该分离株中VP7基因与现有G10型轮状病毒毒株的VP7编码区氨基酸的系统进化树分析提示其可能是随着奶牛的购入而进入我国。 相似文献
12.
以G6型牛轮状病毒总RNA为模板,应用RT-PCR技术扩增牛轮状病毒VP4开放性阅读框,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pEASy-T3载体中,成功构建出克隆质粒pEASY-T3-VP4.经双酶切后再将该基因重组于原核表达载体pET32a(+)中,构建出原核表达质粒pET32a-VP4.将pET32a-VP4转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约108 KD的融合蛋白带,成功构建了能够稳定表达VP4蛋白的基因工程菌株,为进一步研制牛轮状病毒基因工程疫苗奠定了基础. 相似文献
13.
[目的]克隆获得牛轮状病毒VP4全基因,并进行真核表达。[方法]采用RT-PCR技术,从牛轮状病毒总RNA中扩增出VP4基因,将其重组到含有Flag标签的pcDNA3.1(+)载体中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,通过Lipofect2000TM转染293T细胞,细胞增殖后经RT-PCR和Western Blot检测VP4基因的表达。[结果]获得了VP4基因的阳性重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-VP4;转染293T细胞后经RT-PCR和Western Blot检测表明,该基因的重组表达载体构建正确,可在293T细胞内瞬时表达。[结论]VP4基因的重组真核表达载体构建成功并可在真核表达细胞内表达,该研究为VP4基因的DNA疫苗的研发及应用奠定了基础。 相似文献
14.
PCR扩增轮状病毒VP4基因和大肠杆菌LTB基因编码区,将其克隆至pET32a载体上,构建pET32a-VP4-LTB质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),PCR、酶切鉴定后进一步测序,测序结果表明融合基因片段由2637 bp组成,为编码879个氨基酸残基的多肽。经IPTG诱导和SDS-PAGE检测发现表达产物分子量约为118.9 KD,以包涵体的形式存在。融合蛋白经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化后免疫小鼠,结果所产生的抗体效价高于单独VP4蛋白的免疫结果但差异不显著(P0.5),但与对照组相比差异显著。表明所表达的融合蛋白具有较好的免疫原性,为研制牛轮状病毒亚单位疫苗奠定了基础。 相似文献
15.
犊牛轮状病毒的分离鉴定 总被引：5，自引：0，他引：5
将犊牛腹泻粪便经轮状病毒酶标诊断试剂盒检测阳性者,应用Marc145细胞培养,从河北省奶牛场分离出1株牛轮状病毒。分离毒株在Marc145细胞上产生明显的细胞病变,测其TCID50=10-4.70/0.1mL;提取该分离毒株的RNA,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测其电泳型为4∶2∶3∶2型,属于A群轮状病毒;RT-PCR方法扩增出342bp的目的条带,特异性检测均未见目的条带,进一步证实为轮状病毒。 相似文献
16.
传染性法氏囊病病毒河北分离株(HB-bp)基因组A节段全长cDNA的克隆和序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
采用RT-PCR技术,以传染性法氏囊病病毒河北分离株(HB-bp)基因组RNA为模板,扩增并克隆了IBDVHB-bp株基因组A节段全长cDNA。结果表明:克隆的A节段全长共3142个核苷酸,包括5′、3′端非编码区(NCRs)和2个部分重叠的开放阅读框(ORF1和ORF2),与其它血清Ⅰ型毒株相比,HB-bp株在核苷酸水平上有32～146个核苷酸的差异,同源性为95 4%～98 8%;在氨基酸水平上有5～35个氨基酸的替代,同源性为96 9%～99 5%,与血清Ⅱ型毒株同源性为89 8%～90 8%。与其他超强毒株的同源性最高,具有超强毒株的特征性氨基酸,因此HB-bp株为中国的一个超强毒株。 相似文献
17.
以从黑龙江省腹泻犊牛粪便中分离的牛轮状病毒(bovine rotavirus)为抗原,免疫6～8周龄BALB/_c小鼠,取血清抗体阳性小鼠的脾细胞与SP_(2/0)骨髓瘤细胞融合。用ELISA间接法检测抗体,通过有限稀释法,克隆出一株分泌抗牛轮状病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经鉴定,此杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体为IgM,轻链为K链。通过连续传代证明,此杂交瘤细胞株具有稳定分泌单克隆抗体的性质。杂交瘤细胞诱生BALB/_c小鼠腹水的单克隆抗体滴度可达1:10000以上。 相似文献
18.
猪轮状病毒VP4蛋白基因在大肠杆菌中的表达 总被引：3，自引：0，他引：3
[目的]研究猪的轮状病毒VP4蛋白基因在BL21大肠杆菌中的表达。[方法]以猪肺脏组织中分离的总RNA为模板,采用反转录聚合酶链式反应（1it—PCR）技术扩增VP4蛋白的部分基因,将PCR产物克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒PGEX-4T-1-VP4并对重组质粒进行酶切和测序鉴定。将重组载体PGEx4T-1-VP4转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达和SDS—PAGE分析,并对重组大肠杆菌进行可溶性分析。[结果]对猪肺脏组织中分离的总RNA进行RT—PCR扩增,获得875bp的VP4部分基因,重组质粒PGEX-4T-1-VP4经BamHI和Xho Ⅰ双酶切和测序鉴定后,插入的猪轮状病毒VP4的eDNA编码区序列与已公布的猪GenBank核酸序列比对结果为99．5％;将重组质粒pGEX-4T-1-VP4-一转化至大肠杆菌B121（DE3）中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约58kDa融合蛋白带。[结论]该研究为进一步研究轮状病毒的疫苗研制奠定了基础。 相似文献
19.
利用RT-PCR技术,以传染性法氏囊病毒河南分离株(HN04)基因组RNA为模板,扩增并克隆IBDV HN04株基因组A片段cDNA。测序结果表明:克隆的A片段全长3260个核苷酸,包括2个部分重叠的开放阅读框(ORFl和ORF2)及两端的非编码区。ORFl和ORF2分别编码含有1012个氨基酸的结构蛋白(VP2-4-3)及含有145个氨基酸的VP5。IBDV HN04株基因组A片段核苷酸序列与来自GenBank IBDV血清Ⅰ型毒株核苷酸序列的同源性高达94.9%～99.4%,血清Ⅱ型毒株核苷酸序列同源性为83.8%。对IBDV HN04株的A片段核苷酸及其推导氨基酸进行序列分析,结果显示HN04株与国内外IBDV数株弱毒株的同源性在99.0%以上。 相似文献
20.
利用套叠PCR技术对轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因进行了定点突变,将改造后的基因插入pBI121构建植物表达载体。在设计PCR引物时,引入植物表达载体pBI121具有的克隆位点BamH I和Sac I,利用BamH I和Sac I切除pBI121上的GUS基因并使载体质粒线性化,用同样的2种酶消化pTVP4克隆载体获得VP4基因片段,使之形成与线性化pBI121质粒相同的粘性末端。在T4DNA连接酶的作用下,将线性化pBI121质粒和酶切后的VP4基因片段连接成新的重组质粒pBI121/VP4,通过直接转化法转化到根癌农杆菌(Agrobacteriumefaciens)EHA105菌株中,获得农杆菌工程菌株。采用叶盘转化法转化苎麻(Boehmeria.nivea L.Guad)栽培品种圆叶青,以卡那霉素抗性作为转化植株的筛选标记获得抗性植株。经PCR、PCR Southernblot分析表明,初步获得了轮状病毒外壳蛋白VP4的转基因苎麻植株。 相似文献