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1.
家蚕脂肪酶-1(Bmlipase-1)在蚕体中肠组织中特异性表达,具有抵抗家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)侵染的活性。用PCR方法扩增了Bmlipase-1启动子的8个不同区域片段,以绿色荧光蛋白基因(EGFP)为报告基因,分别构建重组家蚕杆状病毒并注射感染家蚕幼虫后,通过荧光观察、荧光定量PCR和ELISA方法,检测报告基因在家蚕中肠中的表达量,以明确对Bmlipase-1具有转录调控活性的启动子片段。结果表明:Bmlipase-1启动子-1 453~192 bp区域的活性最强;在-1 453~-679 bp区域有与Bmlipase-1在中肠组织特异性表达相关的启动子保守序列及1个CAAT box和大量的GATA序列等正调控元件,推测该区域可能与Bmlipase-1的组织特异性表达有关;-81~493 bp区域涵盖核心启动子区、第1外显子区和第1内含子区,含有大量Pbx-1转录因子结合位点、OTC序列和GATA序列,推测该区域发挥对Bmlipase-1转录的基础调控作用;-1 980~-1 452 bp区域存在负调控元件。研究结果有助于进一步揭示Bmlipase-1的转录调控机制。 相似文献
2.
乳糖酶-根皮苷水解酶(lactase-phlorizin hydrolase,LPH)是肠组织上皮细胞微绒膜上的一种糖蛋白,对乳糖和根皮苷有水解活性。鉴定了家蚕基因组中的一个LPH基因,命名为BmLPH014192。该基因CDS长1 305 bp,编码434个氨基酸,预测蛋白质分子质量为50.8 kD,等电点(pI)为5.35。将该基因的cDNA与家蚕基因组序列比对,显示其具有7个外显子,外显子/内含子边界处均符合GT-AG规则。将BmLPH014192与哺乳动物人、褐鼠、家兔和昆虫黑腹果蝇、冈比亚按蚊、二化螟、佛罗里达弓背蚁、大红斑蝶等的LPH进行氨基酸序列比对,相似度都在60%左右;聚类分析中BmLPH014192与昆虫类LPH聚在一起。芯片数据分析结果表明BmLPH014192在家蚕5龄第3天幼虫的9个组织中,只在中肠中有表达,并且表达量很高。在绿茧品种大造和白茧品种19-710幼虫的中肠中扩增到的特异性条带其长度分别为1 000 bp和750 bp,存在序列选择性剪接;在其它白茧品种的中肠中没有扩增出特异性条带。推测BmLPH014192的特殊表达方式可能与其在不同家蚕品种中肠组织中的特异性功能有关。 相似文献
3.
中国野桑蚕抗病毒蛋白基因(Lipase)的克隆与活性鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
从中国野桑蚕幼虫中肠细胞克隆获得了抗家蚕核型多角体病毒BmNPV的脂肪酶基因(Lipase)cDNA(GenBank:AY945212)。该基因cDNA大小906 bp,编码301个氨基酸,蛋白质分子质量约为28.9 kD。进一步克隆了其全长基因组,结果表明该基因由2 147 bp组成,包含4个外显子和3个内含子。该基因在野桑蚕体内的表达具有组织特异性,仅限于野桑蚕中肠组织表达,且在幼虫龄中表达水平较高,而在幼虫眠期和熟蚕期几乎没有表达。通过基因体外表达获得的重组蛋白Lipase,能够有效抑制BmNPV病毒对家蚕的感染,说明该蛋白具有较强的抗BmNPV的生物学活性。 相似文献
4.
家蚕丝氨酸蛋白酶BmHP14基因的克隆与表达模式分析 总被引：1，自引：0，他引：1
家蚕受到外源微生物侵染或损伤时,前酚氧化酶原级联反应中的起始丝氨酸蛋白酶会激活下游信号通路,最终产生黑色素。采用RACE技术,获得了家蚕前酚氧化酶原级联反应起始丝氨酸蛋白酶——血淋巴蛋白酶编码基因的全长cDNA序列,命名为BmHP14(GenBank登录号:JQ954757)。BmHP14 cDNA全长2 508 bp,开放阅读框为2 013 bp,编码670个氨基酸,预测蛋白质分子质量71 kD,等电点5.09,N端17个氨基酸预测为信号肽序列。多重序列比对显示BmHP14与烟草天蛾HP14的相似度很高,达到57%;分子进化树中二者也聚为一支。RT-PCR分析表明,BmHP14在家蚕5龄第3天幼虫脂肪体、马氏管、精巢、卵巢、表皮、血细胞、头部均有表达,其中以脂肪体中的表达水平最高。以黑胸败血芽孢杆菌、大肠杆菌、球孢白僵菌注射侵染家蚕5龄第3天幼虫,Real-time PCR检测显示在受到病菌侵染后,幼虫脂肪体中的BmHP14表达上调。Westernblotting检测结果显示,BmHP14在家蚕体液中以前体和成熟体的形式共同存在。研究结果提示,BmHP14是家蚕前酚氧化酶原级联反应信号通路中的关键酶。 相似文献
5.
在感染家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrovirus,BmCPV)的家蚕中肠组织中发现一个表达量明显下调的未知蛋白LOC101742613,与棉铃虫(Helicoverpa armigera)的未知蛋白LOC110378285的序列一致性为51%。利用PCR技术克隆获得了编码该蛋白质的cDNA,其序列全长为1 114 bp,最大开放阅读框(ORF)为993 bp,编码的蛋白质由330个氨基酸残基组成,预测蛋白质分子质量为36.6 kD,等电点为4.31。实时荧光定量PCR分析发现目的基因主要在家蚕的脂肪体、精巢、卵巢和头部组织中表达,且家蚕中肠感染BmCPV后48 h和72 h其mRNA的表达量显著下调,分别为对照组的7.3%和2.1%。通过构建重组表达载体pET28a/BGIBMGA014203对去掉信号肽的目的蛋白进行原核表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现重组蛋白主要在包涵体中,分子质量约为37 kD。研究结果为进一步阐明目的基因的生物学功能奠定了基础。 相似文献
6.
vasa是决定生殖系发育的重要调控蛋白因子之一,具有广泛的保守性。利用家蚕基因组和EST库的数据资源,分析了家蚕vasa基因的结构,并与已有报道的18个物种的VASA蛋白质的结构域序列进行了比对分析,同时对家蚕vasa基因在家蚕胚胎发育11个时期的表达型及幼虫期8个不同组织的表达特异性进行了验证。结果表明,家蚕vasa基因包含有13个外显子,比果蝇vasa基因的外显子数量(7个)增加了6个,在第3内含子有1个转座子插入;家蚕vasa基因在未受精卵和胚胎发育的各个时期均有表达,但只在幼虫生殖腺中有表达。将家蚕vasa基因的一条cDNA片段用地高辛标记作为探针,对家蚕幼虫的生殖腺及胚胎进行全胚原位杂交,结果进一步表明家蚕vasa基因在幼虫期只在精原细胞、精囊、卵巢管等生殖系相关的细胞和组织中表达,在发育5d胚胎的生殖腺部位也有明显表达。 相似文献
7.
淀粉酶在生物体内的碳水化合物代谢中起重要作用。根据预测的基因序列设计引物,克隆了一个家蚕淀粉酶基因(Bmamy2),获得完整的编码区序列(全长1 752 bp,编码583个aa)。用推导的氨基酸序列与其它物种的淀粉酶基因作相似性比较和系统发育分析,发现所克隆的Bmamy2基因是一个起源很早的拷贝,在细菌、果蝇、非洲蟾蜍、人和鸡等多种生物中存在与之同源的基因。该基因编码蛋白的功能结构域预测有2个起催化作用的关键氨基酸发生突变,推测该基因可能失去了催化水解碳水化合物的功能。RT-PCR和基因芯片检测结果表明,该基因在家蚕5龄第3天幼虫的中肠和脂肪体中表达,且在中肠中的表达丰度较高。 相似文献
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丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)对昆虫的免疫反应起重要调节作用。根据家蚕基因组数据库序列设计引物,从家蚕幼虫血细胞中克隆了Bmserpin6的编码基因,并构建重组表达载体,在大肠杆菌中成功表达了重组Bmserpin6蛋白。将纯化的重组Bmserpin6注射家蚕5龄幼虫后6 h提取家蚕血液制备血清,检测血清样品中的酚氧化酶原活性显著下降(P0.05)。体腔注射重组Bmserpin6后的家蚕5龄幼虫再通过微球菌诱导蚕体内抗菌肽gloverin2基因的表达,结果显示幼虫脂肪体和血细胞中的gloverin2基因表达显著下调(P0.05)。依据上述结果推测:体外表达的重组Bmserpin6可以调节蚕体内2个重要的免疫途径,即抑制蚕体酚氧化酶原的激活和外源细菌诱导的蚕体抗菌肽的产生。 相似文献
9.
家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂(chymotrypsin inhibitor,CI)的多个编码基因位于多个染色体位点上,是家蚕CI具有丰富多态性的原因之一。根据Gene Bank中登录的家蚕CI基因Sci-sb的mRNA,设计引物克隆了一个家蚕kunitz类型的CI基因,命名为CI-fb。CI-fb基因有3个外显子,开放阅读框长度为255 bp,编码85个氨基酸残基,具有一个典型的kunitz结构域。CI-fb基因与其他已知的kunitz类型的CI基因相比,在基因序列和结构、蛋白序列和结构上高度相似,但在已知的CI基因家族中序列最短。RT-PCR分析表明,CI-fb基因在家蚕的脂肪体、精巢、卵巢、马氏管、气管和中肠6个组织中表达,而在丝腺、血细胞和体壁中没有表达,是一个组织特异性表达的基因。研究结果为进一步研究家蚕CI的多态性和功能提供了新的线索。 相似文献
10.
Hemolin是昆虫的一种重要先天性免疫蛋白,属于免疫球蛋白超家族。克隆了家蚕hemolin基因,其序列全长5 100bp,含有5个外显子和4个内含子,基因cDNA编码含410个氨基酸的蛋白质,预测蛋白的分子质量约44.79 kD,pI 5.12。对该基因表达规律和生物学活性的结果研究表明:该基因只在家蚕蛹期脂肪体内特异性转录和表达,并能够被细菌和病毒诱导在幼虫期表达;该基因体外表达获得的重组蛋白具有抗菌生物学活性,能够有效抑制苏云金芽孢杆菌等的生长,由此暗示家蚕Hemolin蛋白可能在蚕体抵御病毒与细菌的感染过程中发挥重要作用。 相似文献
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从家蚕蛹cDNA文库中获得一条cDNA序列,经生物信息学分析显示该cDNA序列全长1 011 bp,包括5′-UTR 200 bp和3-′UTR 136 bp,编码224个氨基酸,其编码蛋白质的N-端富含半胱氨酸,将该基因命名为BmCRP(基因登录号:DN985186.1)。该基因编码蛋白主要有α螺旋、β-折叠、无规则卷曲3种二级结构,具有cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点等5种功能位点。构建重组表达载体pET-28 a(+)-BmCRP并转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后获得融合蛋白,用纯化后的目的蛋白免疫新西兰大白兔制备的多克隆抗体与BmCRP有较好的特异性。W estern b lotting检测结果:BmCRP蛋白在家蚕卵、幼虫、蛹、蛾4个发育时期均有表达,蛹期表达量最高;在5龄幼虫的表皮、头部、卵巢、睾丸、马氏管中均有表达。荧光定量RT-PCR检测结果:BmCRPmRNA在家蚕卵、幼虫、蛹、蛾的整个生命周期中,其转录水平呈增加趋势;在5龄幼虫不同组织中的转录水平从高到低依次为表皮、头部、生殖腺、中肠、马氏管、气管、丝腺和脂肪体。细胞定位实验结果显示BmCRP蛋白在Bm5细胞的细胞核和细胞质中均存在,细胞核中的荧光信号比细胞质中的信号强。研究结果有助于进一步探明家蚕BmCRP蛋白的结构和功能。 相似文献
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在感染家蚕质型多角体病毒(BmCPV)的家蚕中肠组织中发现一个差异表达的假定蛋白基因。利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了该假定蛋白基因的全长cDNA。用生物信息学方法进行基因序列与结构分析表明:该基因全长cDNA序列为486bp,包含108bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)和153bp的3′端非翻译区序列(3′-UTR),开放阅读框(ORF)为225bp,编码74个氨基酸,蛋白分子质量为6.888kD,等电点为5.27;该基因由3个外显子和2个内含子组成,ORF位于第2外显子内,编码蛋白含二次跨膜结构,多肽链表现为疏水性,在多肽链上的第15～16氨基酸残基可能是信号肽的切割位点。RT-PCR结果显示该基因在家蚕5龄幼虫的丝腺、血液、脂肪体、生殖腺及中肠组织中均有表达;荧光定量PCR结果表明该基因在感染Bm-CPV的家蚕中肠组织中的表达水平为正常家蚕中肠组织的6.28倍。研究结果为进一步解析该基因的功能奠定了基础。 相似文献
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葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶(glucose-methanol-choline oxidoreductases,GMC)家族是昆虫体内一大类以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的氧化还原酶类,家蚕基因组中含有43个GMC家族基因。以家蚕5龄幼虫cDNA为模板克隆到一个家蚕GMC家族基因,命名为BmGMCβ2(GenBank登录号:JQ965926)。该基因cDNA全长1 875 bp,编码624个氨基酸,预测蛋白质分子质量为69.3 kD,pI为6.21,定位于家蚕16号染色体的nscaf3058上,编码蛋白质含GMC家族共有的ADP-bindingβ-α-β折叠结构域。系统发育分析表明该基因是家蚕GMC家族β亚家族基因成员。RT-PCR检测家蚕不同发育时期和5龄第3天幼虫不同组织中BmGMCβ2基因mRNA转录水平,以5龄盛食期最高,并且主要在表皮、脂肪体和气管中转录表达;Westernblotting分析BmGMCβ2蛋白主要在5龄第3天幼虫的脂肪体中表达。将BmGMCβ2克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,转化E.coli BL21表达菌株,IPTG诱导表达BmGMCβ2融合蛋白,通过His-亲和层析得到纯化的融合蛋白并制备多克隆抗体,为后续研究该蛋白在家蚕生长发育过程中的功能奠定了基础。 相似文献
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昆虫体内的谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)主要行使对异生或内源有毒物质进行代谢解毒的功能。选择家蚕谷胱甘肽-S-转移酶E4的编码基因Bmgste4为靶标,研究其组织表达谱、序列结构特征及原核表达重组蛋白的酶活性。RT-PCR检测不同组织表达特征的结果显示,Bmgste4基因在家蚕5龄第3天幼虫的头部、触角、下颚须、表皮、脂肪体、丝腺以及雄性个体的马氏管和雌性个体的卵巢中均有表达,而在血细胞、中肠以及雄性个体的精巢和雌性个体的马氏管中不表达。多序列比对结果显示BmGSTE4具有完整和保守的GST二级结构特征,N端氨基酸残基保守,特别是谷胱甘肽结合位点。构建插入Bmgste4基因开放阅读框片段的重组表达质粒p28-Bmgste4,并转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞进行原核表达后,利用分光光度法测定重组蛋白对通用底物1-氯-2,4-二硝基苯的酶活参数:Km=0.58 mmol/L,Vmax=24.55μmol/(mg.min)。这些结果为进一步研究家蚕体内解毒和抗药性机制以及开发鳞翅目害虫新型生物防治药剂提供了基础信息。 相似文献
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家蚕浓核病毒(BmDNV)是危害家蚕的主要病毒之一。为鉴定与家蚕抗病毒相关的蛋白质,以对BmDNV完全不感染的家蚕品种兰10(L10)为供体亲本,将其抗性基因导入家蚕敏感品种菁松(JS)中,构建抗性近等基因系NIL(BC6F2)。对JS及其近等基因系NIL分别用家蚕浓核病毒镇江株(BmDNV-Z)添毒,二者分别表现为高度敏感和完全不感染。对JS和NIL在病毒感染前后中肠组织蛋白双向电泳(2D-PAGE)图谱中的差异蛋白点进行串联质谱(MALDI-TOF-TOF)分析,共鉴定了41个差异表达的蛋白点,其中有35个蛋白点可能与病毒的诱导相关,有6个蛋白点可能与家蚕的组成抗性相关。鉴定的差异表达蛋白包括糖酵解酶类、能量代谢酶类、参与基因表达的蛋白质以及参与其它细胞功能的蛋白质等。选取10个差异表达蛋白点进行基因表达定量PCR分析,进一步确证了这些蛋白质在JS及其近等基因系NIL之间以及在病毒诱导前后的差异表达。例如:精氨酸激酶在NIL和JS中均可被诱导表达;V-ATP合成酶及热激蛋白HSP70只在NIL中被特异性诱导表达;烯醇化酶在NIL中的表达水平显著高于JS,且不能被病毒感染所诱导,是一个典型的组成抗性相关蛋白。鉴定出的41个差异表达蛋白点有可能参与了家蚕对BmDNV-Z的抗性。 相似文献
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家蚕中肠cDNA T7噬菌体展示文库的构建和免疫相关基因的淘选 总被引：1，自引：0，他引：1
中肠是昆虫重要的免疫防御器官之一。为探究家蚕中肠的分子免疫机制,尤其是针对不同病原体的模式识别分子或结合蛋白,以家蚕5龄第3天幼虫中肠为材料,构建家蚕中肠cDNA T7噬菌体展示文库,并分别以几丁质和脂多糖为配体,通过不同方法进行文库的生物淘选。结果共获得10个基因片段,其中在以脂多糖为配体的淘选中获得了β-1,3葡聚糖识别蛋白4,该分子是已知的模式识别受体。另外还获得了多个免疫相关候选基因,如分别编码几丁质结合蛋白、翻译控制的肿瘤蛋白、氨肽酶N、脂肪酰辅酶A结合蛋白等的几个基因。研究结果为深入开展家蚕中肠免疫功能的研究提供了重要线索。 相似文献