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1.
鸡传染性支气管炎病毒多表位核酸疫苗的构建和表达 总被引：1，自引：0，他引：1
通过文献报道和计算机软件分析筛选出鸡传染性支气管炎病毒(IBV)结构蛋白基因S1、S2、N基因的T、B细胞的优势抗原表位共7段,采用人工合成及PCR方法将各抗原表位以柔性氨基酸(GP/GA)作为接头串联成一条全新的多表位嵌合基因F,并定向克隆入真核表达质粒pVAX1,采用酶切分析与序列测定方法筛选鉴定阳性重组质粒.阳性质粒pVAX-F通过脂质体转染COS-7细胞进行表达研究.提取转染细胞总RNA,RT-PCR方法检测到目的基因的转录;间接免疫荧光试验(IFA)检测到特异性荧光存在.表明表达产物能与相应抗体特异性结合,证明了具有一定的生物学活性和抗原性,有望成为抗IBV的核酸疫苗. 相似文献
2.
稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞系的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
为建立能稳定表达T7RNA聚合酶(T7RNAP)的BHK-21细胞系以研究RNA重组疫苗,本研究从BL21(DE3)大肠杆菌中扩增T7 RNAP基因,定向克隆于质粒pcDNA3.1(+)中,经双酶切及测序鉴定,获得阳性重组质粒pcDNA3.1-T7 RNAP。用该质粒转染BHK-21细胞,经G418筛选14d后获得阳性细胞株。RT-PCR和western blot检测结果表明,建立了稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞系,并且在不同代次的阳性细胞中能稳定表达目的基因和蛋白,该研究为RNA病毒感染性质粒在细胞内转录及病毒拯救技术平台的建立奠定了基础。 相似文献
3.
为鉴定BHK-21细胞中稳定表达猪白细胞介素-2(PoIL-2)的活性,本研究利用RT-PCR技术从猪的淋巴细胞中克隆PoIL-2基因,将其连接于pcDNA3.1载体中,并转染BHK-21细胞.经过G418筛选及RT-PCR鉴定,获得稳定表达PoIL-2基因的BHK-21细胞系.采用实时定量PCR及ELISA测定PoIL-2在BHK-21细胞内的表达,同时以淋巴细胞增殖试验(MTT)检测PoIL-2蛋白活性.试验结果表明稳定整合PoIL-2基因的BHK-21细胞系其PoIL-2 mRNA的转录效率是阴性对照组1.43倍,蛋白表达量是阴性对照组1.29倍.MTT试验表明真核表达的PoIL-2促淋巴细胞增殖活性与阴性对照组相比差异极显著(p＜0.01),表明BHK-21细胞表达的PoIL-2具有良好的生物学活性.本研究为开发新型基因工程疫苗佐剂和抗病毒制剂奠定了基础. 相似文献
4.
为了研究虎源犬瘟热病毒(CDV)主要保护性抗原基因(H基因和F基因)的免疫原性,参照GenBank上发表的CDV基因全长序列(KP793921)设计了两对引物,特异性扩增CDV的F和H基因,利用pcDNA3. 1(+)真核表达载体构建了CDV核酸疫苗(质粒pcDNA3. 1-F和pcDNA3. 1-H),通过脂质体介导法将这两种真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,通过RT-PCR、间接免疫荧光和Western-blot检测重组质粒在体外细胞的表达情况;通过肌肉免疫Balb/c小鼠,检测重组质粒在体内的表达情况。结果表明:真核表达载体pcDNA3. 1-F和pcDNA3. 1-H被成功构建,F、H蛋白均具有免疫原性,但诱导抗体效价不高,有待进一步研究改善。说明pcDNA3. 1-F和pcDNA3. 1-H重组疫苗可以诱导产生抗CDV的中和抗体,但是抗体效价较低,需要进一步试验分析解决。 相似文献
5.
将重组质粒pGEM-T-SOD中的副结核分枝杆菌SOD基因亚克隆至真核表达载体pVAX1中,构建真核表达重组质粒pVAX1-SOD,以脂质体介导法转染至BHK-21细胞中,并采用RT-PCR和间接免疫荧光技术检测SOD基因在BHK-21细胞中的表达。结果显示,成功地构建了副结核分枝杆菌SOD基因的真核表达载体,且SOD基因在哺乳动物细胞中获得了表达。为研究副结核分枝杆菌SOD基因的免疫效果及作为牛副结核病DNA疫苗奠定基础。 相似文献
6.
为了解日本乙型脑炎病毒(JEV)强、弱毒株非结构蛋白的免疫效果,笔者分析了JEV强、弱毒株非结构蛋白NS1、NS2A和NS1-2A真核表达的差异。通过观察JE减毒活疫苗(SA14-14-2株)和JEV贵州分离株(GZ株)分别在BHK-21细胞上出现的CPE,并收集强、弱毒株的细胞悬液,提取总RNA,分别设计6对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增非结构蛋白NS1、NS2A和NS1-2A的编码基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-NS1r、pcDNA3.1(+)-NS2Ar、pcDNA3.1(+)-NS1-2Ar、pcDNA3.1(+)-NS1q、pcDNA3.1(+)-NS2Aq和pcDNA3.1(+)-NS1-2Aq,将构建成功的6种真核表达质粒免疫健康小鼠,最后采集小鼠的血液和组织分别进行JEV抗体检测和细胞免疫水平检测。研究结果显示:JEV GZ强毒株与JEV SA14-14-2弱毒株能在BHK21细胞上增殖并产生CPE现象;构建的6种真核表达质粒免疫小鼠后经血常规和T淋巴亚群检测可以极显著或显著增加CD4+和CD8+细胞的含量。表明JEV强毒株非结构蛋白所诱导的细胞免疫略优于弱毒株非结构蛋白诱导的细胞免疫,但差异不明显。本研究结果可为日本乙型脑炎病毒的病原基础研究提供参考。 相似文献
7.
《中国畜牧兽医》2020,(7)
为深入研究乙型脑炎病毒(JEV)NS1和NS1-2A蛋白的表达和免疫效果差异,本试验构建并扩增C-端含Flag标签的NS1和NS1-2A基因,利用T4 DNA连接酶分别连接到质粒pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag。将这两种真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,利用RT-PCR、IFA和Western blotting检测NS1和NS1-2A蛋白在体外的表达情况,用pcDNA3.1-NS1-Flag、pcDNA3.1-NS1-2A-Flag和pcDNA3.1(+)免疫BALB/c小鼠,检测这两种蛋白在体内的表达差异。结果显示,试验成功构建了NS1和NS1-2A基因的真核表达载体pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag,IFA和Western blotting鉴定NS1和NS1-2A蛋白成功表达,重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠后可诱发机体产生特异性体液免疫,pcDNA3.1-NS1-2A-Flag联合免疫组小鼠血清抗体效价和INF-γ细胞因子分泌水平比pcDNA3.1-NS1-Flag免疫组高,且与pcDNA3.1(+)空载体免疫组差异极显著(P0.01);pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫组小鼠体内的INF-γ分泌量会增多,免疫第4周达到最高后逐渐降低。pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠能够刺激JEV特异性抗体的分泌和增强机体的细胞免疫功能,且NS1-2A联合基因的免疫效果优于NS1单一基因,为进一步研究JEV的非结构蛋白功能、研发NS1和NS1-2A基因疫苗奠定基础。 相似文献
8.
根据牛副流感病毒3型(BPIV-3)内蒙09株(NM09)全基因组序列(GenBank登录号:JQ063064)设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增出牛副流感病毒3型分离株的核衣壳蛋白(N)基因,通过NheI和NotI限制性内切酶位点亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+),获得真核重组质粒pcDNA3.1-N。采用Superfect转染试剂将重组质粒转染至BSR细胞中,转染后的BSR细胞经间接免疫荧光试验和RT-PCR方法检测,重组质粒pcDNA3.1-N在BSR细胞中能正确表达N蛋白。本研究结果为BPIV-3新型疫苗的研制奠定基础。 相似文献
9.
为了构建pcDNA.3.1(+)-血管紧张素转化酶2(ACE2)真核表达质粒并检测在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达,从羊肾脏中提取总RNA,经RT-PCR扩增出ACE2基因,后将其与pcDNA3.1载体进行连接重组,构建pcDNA3.1(+)-ACE2真核表达质粒,经HindⅢ、XhoⅠ限制性内切酶双酶切及DNA序列测序分析等方法验证后,通过Lipofectamine 3000脂质体介导转染至CHO细胞,Western blot法检验ACE2基因在蛋白质水平上的表达。结果显示:RT-PCR扩增出大小约为2 200 bp特异ACE2基因片段,连接获得的pcDNA3.1(+)-ACE2重组体经HindⅢ、XhoⅠ酶切后分别出现约2 200 bp和5 000 bp片段,测序分析与Gen Bank上公布的结果完全一致,表明成功克隆了重组pcDNA3.1(+)-ACE2真核表达质粒,Western blot检测显示该pcDNA3.1(+)-ACE2能在CHO细胞中表达。本研究成功构建了pcDNA3.1(+)-ACE2真核表达质粒,并证实其能在CHO中表达,为后续探究ACE2蛋白活性及其作用的研究奠定了基础。 相似文献
10.
用RT PCR 方法扩增口蹄疫病毒VP1基因,并克隆到pgem t easy 载体中,通过酶切、PCR和测序验证克隆正确,再亚克隆到真核表达载体pcDNA 3.1( )上,得到重组质粒pcDNA VP1。根据获得的口蹄疫病毒VP1基因的序列,结合相关的文献资料,设计合成免疫串联片段F,F含有VP1 基因的主要抗原位点141 位~160 位及200 位~213位的氨基酸序列,将F 片段克隆到真核表达载体pcDNA 3.1( )中,得到重组质粒pcDNA F。在脂质体介导下,重组质粒pcD NA VP1和pcDNA F转染Vero细胞。间接免疫荧光分析表明VP1 基因和F 基因均在Vero细胞中成功进行了瞬时表达,为进一步研制FMD基因疫苗奠定了基础。 相似文献
11.
猪伪狂犬病毒PCR检测方法的建立及应用 总被引：2，自引：0，他引：2
根据猪伪狂犬病毒（PRV）gE基因序列保守区段,设计一对特异性引物,通过优化反应条件,建立了可区分猪伪狂犬病毒野毒株与基因缺失疫苗株的PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了验证。结果显示,该PCR方法可扩增出388 bp的目的片段;对模板的最低检测量为1.1 pg;与猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪支原体、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒无交叉反应,具有高特异性。采用建立的PCR方法对2014年以来全国不同地区81个猪场421份疑似病料进行检测,发现PRV猪场平均阳性率为35.80%,样品平均阳性率为 25.42%。该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于PRV的临床诊断和流行病学调查。 相似文献
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表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒疫苗免疫持续期试验 总被引：5，自引：0，他引：5
用表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒（rFPV～gB—F）制备的疫苗免疫4周龄SPF鸡，免疫后的7、14、21、30、60、90、120、150、180d分别采血，分离血清，检测抗FPV和gB的抗体。结果表明重组疫苗免疫后14d，免疫鸡血清抗体已经全部阳转，免疫后的21d血清抗FPV的抗体出现峰值；此后便开始回落，到免疫后的6个月抗体水平已经接近阴性对照的水平。抗gB的抗体在免疫后的第二周达到阳性，之后的六个月都为阳性。在免疫后的每个月将免疫鸡取20只再分成两组。分别用新城疫强毒与传染性喉气管炎强毒的攻击。在免疫后的第一个月对新城疫的保护率为8／10，第2个月对新城疫的保护为7／10，第3个月为2／10，因此对新城疫的免疫保护期为2个月。在免疫后的5个月内可以使免疫鸡对传染性喉气管炎强毒攻击的保护率达到8／10以上，免疫后的6个月对ILT为8／13．因此rF—PV-gB—F对传染性喉气管炎的免疫保护期为5个月。 相似文献
13.
研究了由南京地区分离的鸭源流感病毒A/duck/Nanjing/21/95（H9N2？）感染商品来航鸡后，各组织脏器中病毒分离情况和病毒抗原分布。结果表明，禽流感病毒（AIV）可以从肾脏、肺脏、脾脏和心脏中分离出来，接种后3d(PI3），病毒在组织中的分离率最高，且又以肾脏的分离率最高。病毒抗原主要分布在肾小管上皮细胞、呼吸系统单核细胞和少量上皮细胞的胞核内，PI3时病毒抗原的检出率最高。这些结果表明，肾脏是该毒株复制的主要部位，肾脏的病变是病毒直接损伤的结果，而且该株AIV具备在呼吸系统内复制的潜力。 相似文献
14.
桑树病毒与病毒病的研究进展(Ⅰ) 总被引：3，自引：1，他引：2
桑树病毒病是危害桑树的一类重要病害。简要介绍已发现的10种桑树病毒病的病原分类、分布及部分病毒病危害桑树的典型病征,重点总结了桑坏死病毒病、桑潜隐病毒病、桑环斑病毒病、桑大斑块花叶病毒病等在病原物分离提取和病毒的基本性状、基因组等基础研究,以及病毒的寄主范围、侵染特征和病害诊断与防治方面的研究进展,为桑树病毒病的综合防治提供指导。 相似文献
15.
表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗免疫持续期试验 总被引：2，自引：0，他引：2
将200003批疫苗免疫4周龄SPF鸡,免疫后的7、14、21、30、60、90、120、150、180和225 d分别采血,分离血清,采用ELISA方法检测血清抗FPV抗体,结果表明重组疫苗免疫后14 d,免疫鸡血清抗体已经全部阳转,免疫后的21 d血清抗FPV的抗体出现峰值,此后便开始下降,到免疫后的6个月抗体水平已经接近阴性对照的水平.用ILTV WG株和FPV 102株强毒进行的攻毒保护试验与血清检测的结果基本一致,在免疫后的5个月内可以使免疫鸡获得100%(10/10)保护,免疫后的6个月对ILT和FP的免疫保护分别为1/7和2/10,此时需要对鸡群实施二次免疫.其他5批疫苗(200001、200002、200101、200102和200103)免疫SPF鸡后5个月用ILTV WG株和FPV 102株攻击也获得了完全保护. 相似文献
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为了建立鉴别绵羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)和羊口疮病毒(ORFV)的多重PCR检测方法,针对GenBank中3种病毒的基因组序列,合成了3对引物,通过优化多重PCR反应条件,建立了鉴别检测3种病毒的多重PCR方法。特异性试验表明,应用该方法可分别扩增出3种病毒对应的目的片段,对大肠埃希菌、沙门菌、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、Vero细胞、正常羊组织的DNA和灭菌双蒸水均无扩增;敏感性试验表明,该方法最低检测量分别为30.46pg/μL的绵羊痘病毒、28.9pg/μL的山羊痘病毒和26.94pg/μL的羊口疮病毒基因组DNA;应用本方法对85份临床病料进行检测,结果与其他已建立的单项PCR检测方法结果一致,说明该方法可以用于临床上SPPV、GTPV和ORFV的鉴别诊断。 相似文献
17.
将8日龄SPF鸡随机分组.分别接种rFPVHN、rFPVF、rFPVNHF重组禽痘病毒,接种量为每只鸡105PFU,另一组群用La Sota活苗经点眼、滴鼻接种10<'6>EID<,50>.于免疫后6d、12d和18d测定HI和微量中和抗体.结果发现,3种重组病毒均能刺激鸡群产生抗新城疫病毒特异抗体,但抗体产生时间比La Sota活苗缓慢,且抗体滴度亦低.然而共表达HN和F的rFPVNHF免疫鸡群的中和抗体水平明显比rFPVHN和rFPVF组群高.表明rFPVNHF的保护性免疫更优于HN或F单基因重组禽痘病毒. 相似文献
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5种脑炎人兽共患病病毒多重RT-PCR检测方法的建立 总被引：3，自引：0，他引：3
为建立同时检测流行性乙型脑炎病毒(JEV)、森林脑炎病毒(TBEV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)和基孔肯雅病毒(CHIKV)5种人兽共患脑炎病病毒的多重RT-PCR方法,本研究根据GenBank登录的相关病毒基因序列设计特异引物,通过优化引物组合及PCR反应条件,建立可同时检测5种病毒的方法,扩增片段长度分别为411 bp(JEV)、945 bp(TBEV)、193 bp(EEEV)、545 bp(WEEV)和769 bp(CHIKV);该方法具有良好的特异性,对病毒核酸最低检测拷贝数分别为7.1×103、3.6×103、2.2×103、5.6×103和5.1×103.该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点,为以上5种人兽共患脑炎病病毒提供快速检测手段. 相似文献
20.
鸡痘母源抗体对重组鸡痘疫苗免疫效果的影响 总被引：2，自引：1，他引：1
为了检测抗鸡痘病毒母源抗体对喉气管炎重组鸡痘疫苗的影响,孵化一批来自禽痘病毒高免母鸡的雏鸡,采用ELISA方法检测鸡痘疫苗免疫鸡后代的血清抗体。检测结果表明,雏鸡自孵出2d开始,血清鸡痘病毒抗体水平就开始缓慢下降,到15日龄时下降至临界值,已有部分鸡开始出现抗体阴性反应;到21日龄时,全部被检血清抗体水平均转为阴性。分别于不同日龄对试验雏鸡免疫接种重组鸡痘疫苗,结果只有当鸡体内的鸡痘病毒母源抗体全部为阴性(21日龄)后免疫时才能产生可靠的保护作用,保护率达到80％以上。这说明鸡痘病毒母源抗体对重组鸡痘疫苗的效果有一定的影响,因此重组疫苗合理的首免时间应选择在3周龄以后。 相似文献