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1.
为构建表达新孢子虫重组蛋白SRS2原核表达系统,本研究以新孢子虫基因组为模板PCR扩增SRS2蛋白部分基因,获得大小约为998bp的目的片段,并克隆到大肠杆菌PET-32a载体中,IPTG诱导重组大肠杆菌,通过SDS—PAGE和免疫印迹分析表达产物并鉴定其生物学活性。经SDS—PAGE分析,表达的重组SRS2蛋白分子量约为54kD,免疫印迹结果表明,表达的重组蛋白与牛抗新孢子虫阳性血清反应形成一条特异性蛋白条带。本实验为进一步研究诊断和治疗新孢子虫病奠定了基础。 相似文献
2.
新孢子虫NcSRS2基因的亚克隆和表达 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究根据NcSRS2基因序列设计合成一对引物,将上、下游引物分别引入EcoRI,XhoI酶切位点,用PCR技术从pGEX-NcSRS2重组质粒扩增截去N端疏水氨基酸序列NcSRS2的基因片段（以下称dNcSRS2）,插入到pGEX-6p-1质粒的多克隆位点,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,于氨苄阳性LB培养平板上筛选阳性克隆,酶切及PCR鉴定;经IPTG诱导在E.coli中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并纯化.结果表明,新孢子虫dNcSRS2基因体外扩增产物与预期值相符,约1041bp;所构建pGEX-dNcSRS2重组质粒经双酶切与PCR鉴定,与预期结果一致;SDS-PAGE和免疫印迹显示,表达融合蛋白的分子量约为62.6 kD,表达效率为32.3%,该蛋白具有特异的免疫反应性,为新孢子虫病诊断试剂盒的研制和疫苗的研制奠定了基础. 相似文献
3.
为构建表达牛分枝杆菌(M.bovis)PE_PGRS62蛋白的重组耻垢分枝杆菌,本研究以M.bovis基因组DNA为模板PCR扩增PE_PGRS62基因,获得大小约为1 515 bp的目的片段,并克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV261中,将重组pMV-PE_PGRS62穿梭表达载体电转化到耻垢分枝杆菌内,42℃热诱导重组耻垢分枝杆菌,通过SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并鉴定其生物学活性。经SDS-PAGE分析,表达的PE_PGRS62蛋白分子量约为60 ku,免疫印迹结果表明,表达的PE_PGRS62蛋白与兔抗M.bovis阳性血清反应形成一条特异性蛋白条带。本实验为进一步研究M.bovis致病机理奠定了基础。 相似文献
4.
安氏隐孢子虫囊壁蛋白编码基因的克隆及原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
为克隆和原核表达安氏隐孢子虫囊壁蛋白(COWP)的部分编码基因(AB),本研究根据COWP基因序列设计引物,RT-PCR扩增目的基因AB,从而构建重组原核表达质粒pET-AB。将重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE以及western blot鉴定。回收并纯化重组蛋白,免疫BALB/c小鼠,检测细胞免疫和体液免疫水平。SDS-PAGE和western blot分析显示,重组蛋白约为16 ku,可以被HRP标记的抗组氨酸抗体和安氏隐孢子虫免疫的小鼠血清识别。经重组蛋白免疫的BALB/c小鼠抗体水平以及CD4+和CD8+的值均差异显著(p0.05),表明获得的重组蛋白具有一定的免疫原性。 相似文献
5.
为构建新孢子虫致密颗粒截短型NcGRA7t基因的原核表达质粒,研究其在体外细胞中的表达情况和免疫活性,运用PCR方法和基因克隆技术,构建了pGEX-4T3-NcGRA7t重组质粒,并在大肠杆菌中进行诱导蛋白表达,用SDS-PAGE和Western blot检测重组蛋白在体外的表达情况和免疫活性。结果显示:以新孢子虫的cDNA为模板,从新孢子虫Nc-1株扩增出了NcGRA7t基因,并克隆到了表达载体上。本试验成功构建了重组表达质粒pGEX-4T3-NcGRA7t,表达出的NcGRA7t重组蛋白具有免疫活性,为新孢子虫病的流行病学调查和亚单位疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
6.
《中国动物传染病学报》2020,(4)
为表达弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列(surface antigen glycoprotein 1-related sequences,SRS47D)并确定其在弓形虫中的定位,本研究将SRS47D基因序列插入原核表达载体pColdⅠ,构建原核表达质粒pColdⅠ-SRS47D,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况,Western blot分析重组蛋白的反应原性;利用His柱纯化重组蛋白,免疫新西兰兔,制备抗血清,通过间接ELISA检测血清效价;利用免疫荧光法检测蛋白在弓形虫速殖子中的定位。结果显示:成功构建了原核表达质粒pColdⅠ-SRS47D,在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,表达产物约为55 kDa;重组蛋白能与感染弓形虫的小鼠血清发生特异性反应,免疫兔血清效价达到1∶51 200;免疫荧光检测结果显示,SRS47D蛋白分布在弓形虫速殖子表面,尤其前部和后部表膜。上述结果为进一步深入研究弓形虫SRS47D的特性和功能奠定了基础。 相似文献
7.
为了确定牛源犬新孢子虫NcGRA9基因的功能及表达蛋白的免疫原性，本试验PCR扩增牛源犬新孢子虫NcGRA9基因，构建克隆质粒pMD18-T-NcGRA9和原核表达质粒pGEX-4T-NcGRA9,转化大肠杆菌BL21感受态细胞中IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达重组蛋白的反应原性，应用重组蛋白与弗氏佐剂混合接种BALB/c小鼠，ELISA检测小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a抗体水平以及IFN-γ、IL-4细胞因子水平。结果显示，经PCR扩增获得522 bp的NcGRA9片段，表达蛋白纯化后相对分子质量约为45 kDa,具有良好的反应原性；重组蛋白接种BALB/c小鼠后，免疫组小鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体水平以及IFN-γ、IL-4细胞因子水平均极显著高于PBS对照组(P<0.01),说明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。本试验表达的NcGRA9重组蛋白具有良好的抗原性，为新孢子虫病的防控奠定了基础。 相似文献
8.
《中国动物传染病学报》2017,(2)
将泰泽隐孢子虫(Cryptosporidium tyzzeri)CP15基因从pMD18-T-CP15重组质粒中切下,连接至pET-28a(+)原核表达载体,经酶切和测序鉴定正确后,转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析,并将纯化的重组蛋白免疫ICR小鼠制备多克隆抗体。结果显示,重组表达载体pET-28a-CP15在大肠杆菌中以可溶形式表达,表达蛋白分子量约为17 kDa。Western blot显示重组蛋白能被泰泽隐孢子虫感染小鼠血清所识别。ELISA结果显示重组蛋白免疫小鼠血清能和泰泽隐孢子虫卵囊可溶性抗原特异性反应,表明获得的重组蛋白具有较好的抗原性。 相似文献
9.
为了解新孢子虫NcSRS9基因的生物信息学特性,本试验对牛源犬新孢子虫吉林株NcSRS9基因进行分子克隆,利用生物信息学软件对该基因进行编码蛋白等电点、信号肽、跨膜区、糖基化位点及疏水性分析,并将该基因片段亚克隆至原核表达载体pET-28α,构建了重组表达质粒pET-28α-NcSRS9,转化至大肠杆菌BL21中并诱导表达。结果显示,克隆的NcSRS9基因片段长969bp,与GenBank（EF440644.1）上发表的基因序列同源性100%。NcSRS9基因编码蛋白等电点为5.12,在其N末端存在一个跨膜区。SDS-PAGE和Western-blotting分析显示,NcSRS9基因在大肠杆菌内得到高效表达,表达的NcSRS9重组蛋白相对分子质量约为43 000（His约为7 000,NcSRS9约为36 000）,可被牛抗新孢子虫阳性血清识别,说明表达的蛋白具有一定的反应原性。 相似文献
10.
巨型住肉孢子虫(Sarcocystis gigantea)是羊体内一种常见寄生虫,多寄生于羊横纹肌内形成包囊,导致羊肉大量废弃,给畜牧业带来巨大经济损失。本研究尝试筛选能有效诊断住肉孢子虫感染的抗原。通过免疫印迹及质谱分析筛选到巨型住肉孢子虫候选诊断抗原烯醇酶,利用染色体步移技术扩增两侧翼未知序列并表达重组蛋白。应用生物信息学分析和免疫印迹对该蛋白诊断价值进行评价。结果筛选到的候选蛋白为巨型住肉孢子虫烯醇酶(SgENO),克隆得到1 181 bp的基因并获得重组蛋白rSgENO。对rSgENO应用进行初步评价,发现其与其他顶复亚门原虫的烯醇酶氨基酸相似性均较高(71%～92.1%),且能被弓形虫和新孢子虫阳性血清所识别,具有交叉反应性。本研究克隆并表达了巨型住肉孢子虫烯醇酶,后期评价发现该重组蛋白与新孢子虫和弓形虫有较强的交叉反应性,不能用于羊住肉孢子虫的血清学诊断,但有成为疫苗候选分子的潜力。 相似文献