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1.
Harpinxoo多克隆抗体制备、鉴定与应用 总被引：2，自引：0，他引：2
以纯化harpin蛋白为抗原免疫新西兰白兔，制备兔抗Harpin蛋白的多克隆抗体，经ELISA法测定抗体效价为1：2000，经亲和层析纯化，Western blot分析制备抗体与原核细胞体外表达的harpin蛋白可以特异性结合，表明该抗体的特异性良好。应用该抗体验证harpin编码基因在转基因水稻中在翻译水平的正常表达。因此，兔抗harpin抗体的成功制备，为进一步深入研究harpin的生物学功能、细胞定位以及在其他植物中的表达等奠定基础。 相似文献
2.
根据血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)SH株3D基因序列设计并合成1对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增3D基因,将其克隆入原核表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导培养下重组蛋白获得了成功表达。SDS-PAGE显示重组蛋白的分子量约为68 k D,Western blot分析显示该重组蛋白能与多聚组氨酸标签单抗发生特异性反应。将切胶后纯化的目的蛋白免疫ICR小鼠,制备针对重组蛋白的多抗血清,Western blot结果显示制备的抗血清能够与DHAV-1感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,3D基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于3D蛋白的检测,为3D蛋白的功能研究奠定了基础。 相似文献
3.
【目的】构建兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】以保存的VP60基因的质粒(pTeasy-VP60)为模版,用PCR方法获得VP60基因,并将其克隆到pET28a(+)载体上,构建重组表达载体pET28a(+)-VP60,酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,优化诱导表达时间和IPTG浓度;利用镍离子螯合层析纯化重组蛋白,并制备了高效价的抗VP60多克隆抗体。【结果】成功构建了兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达质粒pET28a(+)-VP60,其在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,重组蛋白分子质量为60 ku,制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性。【结论】成功实现了VP60基因的原核表达,制备了重组蛋白VP60的多克隆抗体,为进一步的VP60转基因研究奠定了基础。 相似文献
4.
克隆小麦(Triticum aestivum L.)品种‘洛夫林10’(L10)中的ATG6(动物同源物为Beclin1)基因,并构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,经纯化后制备其兔抗血清。结果表明:从小麦品种L10中克隆获得1个ATG6的片段,长为1326 bp,利用所构建的大肠杆菌表达载体,经IPTG诱导,实现了对ATG6片段在原核系统的特异性表达。经蛋白纯化后,制备了其兔抗血清并通过Western blot鉴定了其特异性。ATG6抗体制备的成功,为小麦中ATG6基因和自噬功能的研究提供了研究基础。 相似文献
5.
从苹果寄主上分离得到了苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)中国株系。经基因克隆,测序后发现苹果茎沟病毒中国株系外壳蛋白基因(coat protein,CP)含有714个核苷酸,编码表达由237氨基酸残基组成的27 ku蛋白。通过构建含有ASGV-CP基因的重组表达载体pECASGV-CP,在大肠杆菌BL21 (DE3)中成功表达ASGV-CP蛋白。SDS-PAGE显示其分子质量与预计大小一致。利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体。该抗体可用于Western blot和DAS-ELISA检测技术。基于血清学检测,发现陕西苹果主产区ASGV发生普遍。 相似文献
6.
7.
[目的]克隆大肠杆菌NrfA基因,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体,制备相应的多克隆抗体并对其进行鉴定。[方法]以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到NrfA基因编码区,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;再免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,Western Blotting检测抗体的特异性。[结果]构建的表达载体pET-28a(+)-NrfA在大肠杆菌中诱导后可高效表达NrfA蛋白;免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测,其效价为1∶204 900;经Western Blotting分析,抗体的特异性较好。[结论]成功克隆大肠杆菌的NrfA基因,并构建了其表达载体,制备的NrfA多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性,为研究细菌有关NrfA奠定了基础。 相似文献
8.
【目的】通过筛选灰飞虱cDNA酵母表达文库发现原肌球蛋白（tropomyosin,Tm）能与水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）P10蛋白发生互作。研究旨在克隆灰飞虱原肌球蛋白基因（Tm）,将其在原核细胞中进行表达,纯化Tm蛋白,免疫大白兔并制备其多克隆抗体,为进一步分析Tm在灰飞虱与RBSDV互作过程中的作用提供抗体条件。【方法】根据与之高度同源的Tm基因信息确定灰飞虱Tm的开放阅读框（open reading frame,ORF）。提取灰飞虱总RNA,采用RT-PCR方法从灰飞虱中克隆Tm的ORF,连接至pMD-18T载体后进行测序分析,利用DNAstar软件分析该基因序列及其编码的蛋白特性。将测序验证正确的Tm通过EcoR V和BamH I限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pET-32a (+)。重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),经终浓度为0.4 mmol?L-1的IPTG诱导表达4 h后检测Tm融合蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达。利用Ni-NTA Agarose纯化上清中的可溶性融合蛋白,经100 mmol?L-1咪唑洗脱和0.01 mol?L-1 PBST溶液透析后获取纯化的Tm融合蛋白,免疫大白兔,制备多克隆抗血清,并采用间接ELISA法检测抗血清效价。纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白经SDS-PAGE分离后,用制备的Tm多克隆抗体进行Western blotting检测,分析抗体的特异性。【结果】序列分析显示,灰飞虱Tm的ORF大小为852 bp。采用RT-PCR克隆获得此ORF并进行测序分析,结果表明扩增所得灰飞虱Tm的ORF长为852 bp,编码283个氨基酸,理论分子量大小为32.6 kD。序列比对结果发现所编码蛋白在不同物种间保守。将Tm ORF克隆入pET-32a (+)表达载体后在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析显示,融合蛋白大小约为55 kD,主要以可溶性蛋白形式表达,在包涵体中也有少量表达。纯化上清中的可溶性Tm融合蛋白,免疫大白兔,制备了多克隆抗体。抗体效价测定结果显示该抗体具有较好的灵敏度,效价大于1﹕409 600。采用制备的Tm多克隆抗体检测纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白,分别检测到1条约55 kD和约37 kD的特异性条带,表明该抗体有较强的特异性。【结论】克隆获得了灰飞虱Tm的ORF,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行了诱导表达,纯化获得了Tm融合蛋白,制备了高效价的Tm多克隆抗体。 相似文献
9.
甜菜夜蛾卵黄原蛋白多克隆抗体制备及其在不同发育时期蛋白表达 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】制备甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)多克隆抗体,并检测甜菜夜蛾不同发育时期血淋巴中的Vg蛋白表达量变化,为进一步研究Vg转运与利用机制以及生物学功能打下基础。【方法】以羽化24 h的甜菜夜蛾雌成虫c DNA为模板,通过PCR扩增得到甜菜夜蛾Vg基因片段,其包含vitellogenin-N结构功能区。将Vg目的片段连入pMD-19T载体后进行测序,利用DNAMAN软件分析该基因序列的准确性及编码蛋白的特性。将测序正确的Vg基因片段通过Nde Ⅰ和Xba Ⅰ限制性内切酶连接到原核表达载体pCzn1。将重组表达载体pCzn1-Vg转入大肠杆菌Arctic Express,离心收集诱导表达的菌液,超声波破碎菌体沉淀,取上清液与沉淀进行SDS-PAGE检测,分析Vg重组蛋白的可溶性。在不同温度、不同浓度IPTG条件下诱导表达Vg重组蛋白,筛选最优表达条件。经Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化得到了Vg重组蛋白,将该蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗Vg血清抗体。采用间接ELISA方法检测血清抗体的效价,并通过Western blot法检测甜菜夜蛾雌虫不同发育阶段血淋巴中Vg蛋白的表达差异。【结果】扩增所得Vg基因片段为2 091 bp,编码697个氨基酸,预测蛋白分子量为80.88 k D。通过大肠杆菌表达出的Vg重组蛋白相对分子量为80 k D,其大小与预期的Vg重组蛋白带大小相符合。其主要以包涵体形式表达,而在上清中表达量不明显。不同温度、不同浓度IPTG条件下诱导表达Vg重组蛋白的结果显示温度为25℃,IPTG浓度为0.6 mmol·L~(-1)时,Vg重组蛋白表达量最高。继续提高温度和IPTG浓度,对提高Vg重组蛋白的表达量无明显作用,且杂蛋白增多。新西兰白兔经4次免疫后,间接ELISA法检测表明,制备的兔抗Vg抗体具有较好的灵敏度,效价达到1﹕512 000。Western blot检测Vg蛋白在甜菜夜蛾不同发育阶段血淋巴中的表达,其杂交出的单一条带在180 k D左右。Vg蛋白在甜菜夜蛾雌蛹末期开始微弱表达。雌成虫羽化后血淋巴中Vg蛋白表达量先升高后降低,呈动态变化,到羽化48 h表达量最高,随后降低。【结论】纯化获得了Vg重组蛋白,并明确了最优表达条件(温度为25℃,IPTG浓度为0.6 mmol·L~(-1));制备了高效价的甜菜夜蛾Vg多克隆抗体,明确了甜菜夜蛾Vg蛋白的表达规律。 相似文献
10.
为了探明鱼类恒定链类似蛋白(Iclp)能否作为免疫载体,提高基因疫苗的免疫效果,以拟态弧菌OmpU蛋白的黏附功能域(OmpU_(AP))为疫苗靶点,构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-OmpU_(AP)和基于草鱼Iclp的pcDNA3.1-Iclp-OmpU_(AP)。用2种真核表达重组质粒分别免疫草金鱼,同时设置空质粒pcDNA3.1(+)对照组与PBS对照组。于免疫后不同时间(7、14、21、28和35 d)采用PCR和RT-PCR方法检测重组质粒在鱼体不同组织中的分布与转录水平的表达情况,使用双抗体夹心ELISA检测血清抗体水平,并于免疫后第35天进行攻毒保护性实验,检测其免疫保护率。结果显示,免疫后第7天在肌肉、鳃、头肾、肝脏和脾脏中均有重组质粒分布,并在35 d内持续表达。pcDNA-OmpU_(AP)免疫组草金鱼的血清抗体水平缓慢上升,除第21天外,其余检测时间点的抗体水平与空质粒对照组无显著差异。pcDNA3.1-Iclp-OmpU_(AP)免疫组草金鱼在免疫后7 d即有血清抗体产生,随着免疫时间延长,抗体水平不断上升,至28 d达到峰值,随后抗体水平开始下降;除第7天外,其余各检测时间点的血清抗体水平均显著或极显著高于pcDNA3.1-OmpU_(AP)免疫组与空质粒对照组。攻毒后pcDNA3.1-Iclp-OmpU_(AP)和pcDNA-OmpU_(AP)免疫组草金鱼的相对免疫保护率为别为46.7%和20%,而空质粒对照组和PBS对照组的实验鱼全部发生死亡。表明Iclp可以作为免疫载体,提高鱼类基因疫苗的免疫效果。 相似文献
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12.
为分离纯化纳豆激酶,使用纳豆激酶粗制液经硫酸铵分级盐析、Sephodex G100和CM-Sephrose-6B FF层析等步骤纯化,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。以纯化的纳豆激酶作为抗原,结合福氏佐剂,采用多次多点肌肉注射法对兔进行免疫,以琼脂免疫双向扩散法检测效价。试验结果表明,纳豆激酶粗制液经纯化后,得纯酶样品,酶被纯化了28.4倍,比活力为608.6 Uku.mg-1蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一蛋白条带,纳豆激酶兔抗血清效价为1∶64。成功制备的兔抗纳豆激酶抗血清,为研究纳豆激酶的功能提供了物质基础。 相似文献
13.
[目的]为克隆大肠杆菌NrfA基因,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体,制备相应的多克隆抗体并鉴定。[方法]以以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到NrfA基因编码区,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;再免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,WesternΒlotting检测抗体的特异性。[结果]适构建的表达载体pET-28a(+)-NrfA在大肠杆菌中诱导后可以高效表达NrfA蛋白,免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测,其效价为1:204900,经WesternBlotting分析,抗体的特异性较好。[结论]成功克隆大肠杆菌的NrfA基因,构建了表达载体,制备的NrfA多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。为研究细菌有关NrfA奠定了基础。 相似文献
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羊口疮是由口疮病毒(orf virus,ORFV)引起的接触性、嗜上皮性的传染病。020基因是该病毒重要的酶活力调节蛋白。根据Gen Bank中020基因的序列设计引物,从ORFV-F10株感染的病料中提取DNA,PCR扩增获得目的基因。然后将其亚克隆至p ET-32a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒p ET-32a-ORF-020。鉴定正确后转化BL21感受态细胞,进行IPTG诱导表达。表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。最后将纯化的020蛋白免疫BALB/c雌鼠,制备多抗血清。SDS-PAGE结果表明,ORFV 020基因在体外获得正确表达,大小约37 k Da。Western-blot结果表明,制备的多抗血清能够与020蛋白发生特异性反应具有良好的反应原性。 相似文献
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【目的】克隆Tri101并通过原核表达获得纯化蛋白,通过免疫SPF大白兔获得高效价、高灵敏度的多克隆抗体,为Tri101蛋白及转Tri101作物的检测提供抗体基础。【方法】以禾谷镰刀菌（Fusarium graminearium）F3210为材料,PCR法获得Tri101并连接至表达载体pET29a（+）,将重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）后利用IPTG进行诱导表达。利用纯化表达产物制备多克隆抗体。【结果】SDS-PAGE分析结果表明,Tri101在大肠杆菌BL21（DE3）中得到表达,重组蛋白大小为50 kD左右,以包涵体形式存在。利用HisTrap亲和柱纯化重组蛋白,最佳咪唑洗脱浓度为200 mmol•L-1。采用烟草蚀纹病毒蛋白酶切除重组蛋白中的His标签,酶切产物经HisTrap亲和柱再次纯化后免疫SPF大白兔,制备多克隆抗体。经ELISA法检测抗体效价为1﹕12 000,检测灵敏度为0.05×10-6 µg•mL-1。Western blotting结果证明制备的多克隆抗体对Tri101具有较好的专一性。【结论】通过Tri101的克隆及原核表达,获得了纯化的融合蛋白,通过免疫动物制备了兔源多克隆抗体,可用于Tri101蛋白及转Tri101小麦的检测。 相似文献
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兔抗小麦钙调素抗血清的制备及其纯化 总被引：2，自引：0，他引：2
为制备兔抗小麦钙调素抗血清并对其进行纯化,首先从小麦叶片中提取钙调素蛋白,对其初步纯化后免疫家兔,制备得到兔抗小麦钙调素抗血清,再以大肠杆菌中诱导表达的拟南芥钙调素蛋白作为抗原,利用PVDF膜结合法纯化得到了兔抗小麦钙调素抗血清,并通过Western Blotting对所纯化的多克隆抗体进行了鉴定。 相似文献
17.
肠道通透性与肠道稳态及个体健康状况直接相关，目前尚缺乏鱼类肠道通透性的定量评价方法及试剂。血清中肠脂肪酸结合蛋白（intestinal fatty acid binding protein，I-FABP）是肠道通透性的重要血清生物学指标，可用于肠道通透性的定量评价。为建立鲫（Carassius auratus）血清I-FABP的定量检测方法，克隆了鲫I-FABP基因，经原核表达和纯化，并利用重组蛋白分别免疫新西兰白兔（New Zealand white rabbit）及小鼠（Mus musculus），制备了兔源及鼠源多克隆抗体，其效价均为1∶80 000。以纯化的兔源多克隆抗体作为包被蛋白，以辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的鼠源多克隆抗体作为酶标抗体，通过优化各反应条件建立了基于鲫I-FABP的双抗体夹心酶联免疫检测方法（double antibody sandwich ELISA，DAS-ELISA）。标准曲线的线性回归方程为y=0.003 5x+0.036 7，拟合度较高R2为 0.999 1，临界值为0.090 6。批内及批间变异系数分别为1.17%～5.50%及0.16%～4.78%，具有较好的重复性。以该方法对54份样品进行检测，与商业化试剂盒对比，符合率为100%。构建的DAS-ELISA检测方法可用于鲫肠道通透性的定量评估。鉴于鱼类I-FABP的保守性，该方法或可用于其他鱼类肠道通透性的定量评价。 相似文献
18.
Yuelan Zhao Yuzhu Zuo Lei Zhang Jinghui Fan Hanchun Yang Jianhua Qin 《Frontiers of Agriculture in China》2009,3(3):325-331
The IgG antibodies of rabbit anti-E2 protein of the bovine viral diarrhea virus were prepared by a general method from high
efficiency serum immunized by E2 recombinant protein antigen expressed in E. coli prokaryotic expression system and were labeled to make enzyme-labeled antibody with the method of NaIO4. A sandwich Dot enzyme-linked immunosorbent assay (Dot-ELISA) for the detection of BVDV was developed. The optimal reaction
conditions of Dot-ELISA were determined. The results show that optimal coating antibody was 300 μg·mL−1, the working concentration of HRP-labeled antibody was 1:50. The optimal blocking reagent and time were 5% bovine serum and
45 min. The minimum detection of the content of antigen reached 1.35 μg·mL−1. Compared with the routine IDEXX ELISA test kit with the whole virus, its specificity, sensitivity and coincidence rate were
90.48%, 96.55% and 95.24%, respectively. Compared with the sandwich Dot-ELISA with the negative staining electron microscope
and RT-PCR, the coincidence rates were 90.9% and 93.1%, respectively. In addition, Bovine viral diarrhea virus (BVDV) antigen
of 178 samples collected from cow farms in the Hebei Province, China, were detected by the developed Dot-ELISA and the IDEXX
BVDV antigen Test Kit simultaneously, BVDV antigen positive rate was 39.89%–41.01%. The result of detecting clinical samples
demonstrated that the established method showed its specificity, sensitivity and repeatability, whereas the results were easily
interpreted without an ELISA reader. 相似文献
19.
为了定位拟态弧菌热不稳定溶血素VMH蛋白的B细胞线性表位,以VMH蛋白全长氨基酸序列为基础,联合利用ABCpred和Bepi Pred网络服务器综合分析预测VMH蛋白B细胞线性表位。同时,以霍乱弧菌Cytolysin蛋白为同源建模模板,利用Modeller 9.14软件构建VMH蛋白的3D结构,并使用Py Mol软件展示预测表位,确定其在3D结构中的位置。共预测出6个最有可能的B细胞线性表位,它们分别位于VMH蛋白N端P130-141、P192-203、P236-247、P281-292、P425-436和P464-475区域,且完全或大部分暴露于蛋白3D结构表面。人工合成6条预测表位肽,分别采用肽ELISA、肽抑制性免疫印迹反应和溶血活性试验进行鉴定。结果发现6个预测表位肽均能与兔抗VMH蛋白抗体发生结合反应;除预测表位P281-292外,其余5个预测表位肽能明显抑制兔抗VMH蛋白抗体与VMH蛋白间的免疫印迹反应,且具有溶血活性。结果表明,预测表位P130-141、P192-203、P236-247、P425-436和P464-475是拟态弧菌VMH蛋白的真正B细胞线性表位。 相似文献
20.
水稻L-半乳糖内酯脱氢酶基因的克隆和原核表达及抗体的制备 总被引：2，自引：0，他引：2
俞乐 《湖南农业大学学报(自然科学版)》2010,36(4):381-384
应用RT-PCR技术从水稻叶片中克隆了水稻L-半乳糖内酯脱氢酶(GLDH)的全长基因.序列分析表明,水稻GLDH基因全长1752bp,亚克隆其部分成熟蛋白编码基因(789bp),利用基因重组技术构建了E.coli/pET30a-GLDHe,经酶切鉴定,DNA测序,证实重组质粒构建正确;将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析证实表达出相对分子质量约为36000的蛋白.用原核表达蛋白作为抗原免疫家兔制备抗体,用Westernblot检测抗体的特异性及效价,结果表明,抗体血清效价为1∶1000,在加IPTG诱导后的菌液中可以检测到相应的蛋白条带((相对分子质量为36000)),在水稻叶片样品中能检测到1条相对分子质量为36000的蛋白条带. 相似文献