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基因组编辑技术是用特殊的核酸酶对基因组进行精准修饰的一种新兴技术。2013 年研究人员发现了CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统,将其中的CRISPR/Cas9 系统成功改造成RNA引导的核酸内切酶,发展了CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术。该技术能够对包括植物在内的几乎所有物种的基因组进行高效、精准的定点修饰,而且程序简易、操作方便灵活,加速了遗传工程、功能基因组学的研究,给生命科学的各个领域带来了革命性变化。本综述回顾了CRISPR/Cas9 的出现、改进与发展,简述了CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术的作用机理,归纳总结了CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术在作物品种改良、提高作物品质和产量中的应用,最后,分析了该技术在作物品种改良中的发展前景及应用价值,以期为合理利用该技术进行种质创新、品种改良提供理论依据。 相似文献
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CRISPR/Cas9系统是一项简单、高效的基因定点编辑技术,在植物遗传改良及作物良种选育等方面具有重要的应用价值。本研究主要介绍了CRISPR/Cas9的原理及构建方法,论述了近年来CRISPR/Cas9技术在植物基因功能及基因表达调控、植物基因组的定向编辑以及作物分子育种中的应用及研究进展,分析了该基因编辑系统的主要影响因素及优化改进方式,探讨了该系统在应用中的问题及解决途径并对今后发展方向进行了展望,为该技术在植物基因组定点编辑及作物遗传育种等领域研究提供参考。 相似文献
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CRISPR是细菌或古生菌对入侵到体内的病毒,通过核酸特异性识别、Cas9蛋白酶切割产生的一种天然免疫系统。基于CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术,通过sgRNA介导和Cas9蛋白切割实现对靶基因的定点编辑。因其操作简便、编辑效率高、适用范围广的特点,迅速成为研究植物、动物、微生物基因功能的重要手段。同时,随着大量基因组信息和相应数据库的广泛建立,CRISPR/Cas9技术利用反向遗传学,配合生物信息技术,成为遗传改良、创新特异种质的一种极有效的新手段。本文主要对CRISPR/Cas系统的基本原理、CRISPR/Cas9基因编辑技术的作用机制,以及CRISPR/Cas9技术在粮油作物遗传改良、品种选育研究中取得的进展进行了综述,为遗传育种工作者利用该技术进行遗传改良和品种优化升级育提供有效的参考。 相似文献
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基于优化sgRNA系统提高海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑功效的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
CRISPR/Cas9基因组编辑体系已经在多种作物中被建立,其最大的优势在于能简单高效定向创制突变体。然而,CRISPR/Cas9基因组编辑体系在实际操作过程中经常会出现没有编辑的情况,或者靶向编辑目的基因的同时也会引发不同程度的脱靶效应,这对CRISPR/Cas9基因组编辑技术的运用带来不利影响。本研究基于前期在海岛棉体细胞中建立的CRISPR/Cas9基因组编辑体系,通过对构建Cas9不同密码子优化方式、不同PAM位点个数和不同靶位点数量的编辑载体,来分析比较编辑效率和脱靶效应的差异。结果表明, 2种Cas9密码子不同优化方式的编辑载体产生的编辑效率和脱靶效应无显著差异;优化后的双PAM位点的编辑效率显著高于单PAM位点,且脱靶效率显著较低;大部分双靶序列编辑效率均高于单靶序列且脱靶效率较低。上述研究结果为今后优化CRISPR/Cas9介导的海岛棉基因组编辑体系奠定了重要的理论依据。 相似文献
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CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物基因工程育种中的应用 总被引:2,自引:0,他引:2
《分子植物育种》2017,(7)
作为传统基因工程育种技术,转基因技术在植物分子育种工作中的应用受到技术本身缺陷及其他风险因素的限制。CRISPR/Cas9基因编辑技术是近几年新发展起来的一种基因组定向编辑技术。本研究介绍了CRISPR/Cas9基因编辑技术的基本原理和研究进展,分别比较分析了CRISPR/Cas9系统与前两代基因编辑技术(ZFNs和TALENs)和传统转基因技术之间的差异。至今为止,CRISPR/Cas9基因编辑技术已经在多种植物中实现了定点突变诱导(插入,缺失或修饰等)。由于成本低廉、操作简易和突变诱导率高等特点,CRISPR/Cas9系统作为一项高效植物遗传改良和育种研究的分子操作技术手段,应用前景十分广阔。 相似文献
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靶向BnSVP的CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术是一种新兴的分子修饰工具,可实现基因组特定位点碱基的缺失、插入或替换,造成基因功能丧失,现已广泛应用于基因功能的研究。为深入探讨甘蓝型油菜中Bn SVP的生物学功能,以中双11号基因组(甘蓝型油菜参考基因组,v4.1)中的4个Bn SVP为靶标基因,并针对不同染色体上的Bn SVP基因,应用CRISPR-P 2.0软件共设计了12条特异sg RNA种子序列,以实现4个Bn SVP同源基因的全部或部分敲除;以p YLCRISPR-Cas9P35S-H为基本载体,以At U3b或At U3d为sg RNA转录启动子,采用Golden gate cloning技术分别组装构建了6个双靶点CRISPR/Cas9植物表达载体。测序结果表明,6个CRISPR/Cas9植物表达载体各sg RNA表达盒DNA序列正确,双靶点组装顺序无误。研究结果为进一步原生质体瞬时表达和农杆菌介导的油菜遗传转化奠定了基础,同时也为应用CRISPR/Cas9基因组编辑系统研究植物多拷贝同源基因的功能提供参考。 相似文献
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《分子植物育种》2021,19(10):3290-3297
双生病毒是一类全世界范围内普遍存在的单链环状DNA病毒,其中菜豆金色花叶病毒属的病毒种类数量最多,危害最大。近年来,CRISPR/Cas9基因组编辑技术快速发展,已被用于植物抗病毒工程中。然而,CRISPR/Cas9系统中并不是所有的靶向序列都能成功完成基因组编辑,进而实现抗病毒的效果。本研究通过病毒基因组序列比对分析发现菜豆金色花叶病毒属各类病毒基因组上存在一个高度保守位点,位于复制起始蛋白(Rep)基因中。以该保守序列作为CRISPR/Cas9系统的靶序列,通过瞬时转化的方法,在本式烟草中快速验证该病毒靶序列的抗病毒效果。结果显示,本研究成功构建了针对双生病毒基因组的编辑系统,通过瞬时转化烟草后有效地抑制了病毒的积累,验证了该靶序列抗病毒的有效性,为后续基于CRISPR/Cas9基因组编辑技术在稳定转化番茄上实现对双生病毒的广谱抗性奠定基础。 相似文献
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CRISPR/Cas9基因编辑技术作为一项革命性的生物技术,为基因组编辑提供了高效、精准的工具,然而其广泛应用也引发了众多生物伦理和法律挑战。本研究旨在探讨CRISPR/Cas9基因编辑技术在生物伦理和法律层面所面临的问题。本研究介绍了CRISPR/Cas9技术的基本原理和其在生物学、农业等领域的应用,详细探讨了基因编辑技术可能引发的伦理问题,包括人类基因编辑的道德边界、遗传信息的安全性等,还分析了基因编辑技术在法律方面的挑战,如知识产权、监管标准和医疗法律责任等。通过综合评述生物伦理和法律领域的争议和讨论,本研究旨在促进对CRISPR/Cas9基因编辑技术应用的全面理解和审慎考虑。 相似文献
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【目的】对已克隆的海岛棉U3和U6启动子进行功能鉴定,为构建棉花CRISPR/Cas9多位点基因编辑技术体系提供更多可用的U3和U6启动子。【方法】分别构建以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子驱动sg RNA,以抗旱负调控基因GGB为靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体,然后在新海16的棉花叶片原生质体中进行功能鉴定。通过Polymerase chain reaction方法富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段,并利用PEG瞬时转化法将核心片段转入原生质体中。提取转化后的原生质体基因组DNA,采用酶切/Polymerase chain reaction法分析棉花GGB基因的突变情况并测序验证。最后绘制靶基因突变的频率分布图来计算该CRISPR/Cas9系统的编辑效率和确认突变的真实性。【结果】靶基因测序结果显示靶标位点序列突变的类型全部为碱基替换。【结论】以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子的CRISPR/Cas9基因编辑体系可以成功地定点编辑棉花GGB基因的序列,引起基因突变。 相似文献
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《分子植物育种》2017,(3)
CRISPR-Cas9基因组编辑技术通过向导RNA的介导和Cas9蛋白的切割来实现对靶基因的定点编辑,实际操作中只需对向导RNA起始的20个核苷酸进行修改即可完成对不同靶标基因的编辑,该技术以其简便、高效的特点,迅速成为动植物中最为广泛使用的基因组编辑工具。本研究对CRISPR-Cas9系统进行了简单的介绍,总结了CRISPR-Cas9系统在水稻基因组编辑中的应用,并针对该系统存在的脱靶效应,提出了几点策略,最后对CRISPR-Cas9基因组编辑技术与转基因技术之间的关系进行了探讨,并对CRISPR-Cas9系统在进一步扩大水稻基因组编辑范围、调控基因表达水平等方面进行了展望,以期为研究该方面工作的水稻育种家提供参考。 相似文献
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基于棉花U6启动子的海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑体系的建立 总被引:3,自引:0,他引:3
CRISPR/Cas9基因组编辑技术是基因功能研究的一种强有力的工具, 目前已在许多生物体中成功实现内源靶向基因的突变。利用已克隆的海岛棉新海16的2个U6启动子, 分别构建带有新海16内源基因(GbGGB和GbERA1)靶位点DNA片段的CRISPR/Cas9基因编辑载体。以新海16的胚性愈伤组织为供试材料, 制备海岛棉的原生质体。通过PCR方法大量富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段(包括GbU6::sgRNA和CAMV35S::Cas9两部分), 并利用PEG法转化海岛棉的原生质体。对原生质体基因组DNA进行酶切后PCR, 成功检测到内源靶基因的突变现象。对PCR产物进行克隆测序, 结果显示序列突变的类型主要以碱基替换为主, 少数为碱基缺失。结果表明基于海岛棉U6启动子的CRISPR/Cas9基因编辑系统能在海岛棉中实现靶向基因编辑的功能, 为棉花功能基因组学研究提供了重要的技术基础。 相似文献
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CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于细菌、酵母、动物和植物中的基因组定点编辑技术,但该编辑系统的使用范围受PAM (proto-spacer-motif)位点NGG的限制。本研究通过突变Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)编码氨基酸(1135位的天冬氨酸D突变成缬氨酸V, 1335位的精氨酸R突变为谷胱氨酸Q, 1337位的苏氨酸T突变为精氨酸R,命名该突变子为Cas9-VQR)改造其识别PAM为NGA的位点以扩大其使用范围。并使用玉米Ubi启动子启动Cas9-VQR基因、优化SpCas9的密码子、加入保守的核定位信号序列、增加单子叶植物中保守的3′UTR序列和使用水稻U6启动子启动gRNA来修饰该编辑系统。结果表明Cas9-VQR系统能够识别PAM为NGA的位点,并进行有效的切割。体外酶切活性检测结果表明Cas9-VQR的切割效率为5%~70%。水稻转化检测结果表明Cas9-VQR的切割效率约为27.5%~70.5%,平均切割效率为46.23%。本研究拓宽了CRISPR/Cas9系统在作物中的使用范围,特别是NGA PAM位点较高的作物。 相似文献
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《分子植物育种》2017,(6)
CRISPR/Cas系统最早发现于细菌,对入侵的病毒或噬菌体DNA具有免疫作用。基于CRISPR/Cas的免疫机制,设计开发的CRISPR/Cas9基因编辑系统已经成为真核生物基因编辑的主流工具,在拟南芥、水稻等高等植物的基因组功能研究中已经广泛应用。本研究以中国鹅掌楸纤维素合酶(Cellulose synthase,CESA)为研究对象,首次构建了具有表达中国鹅掌楸纤维素合酶(Cellulose synthase,CESA)gRNA(guide RNA)的CRISPR/Cas9基因敲除系统,以LcCESA1基因外显子5'端的第一个外显子区域的GN19NGG序列设计gRNA引物;以p201N-Cas9为载体,Gibson Assembly誖Master Mix为连接酶,通过Gibson Assembly连接技术,将CESA1-gRNA连入p201N-Cas9中,获得p201N-Cas9-CESA1-gRNA载体。根据载体中插入序列,设计了两对检测引物,经PCR鉴定,均获得了相应大小的序列;测序分析进一步证实确认gRNA已经完整准确地连入载体。p201N-Cas9-CESA1-gRNA载体能对CESA1基因进行定向编辑,对后续研究鹅掌楸纤维素合酶的基因功能具有重要意义。 相似文献