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1.
《分子植物育种》2016,(3)
以丝瓜基因组DNA为模板,对SRAP反应中主要五个影响因素d NTP浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、DNA模板浓度、Mg~(2+)浓度进行优化,建立丝瓜SRAP-PCR反应的体系。根据实验确定的最佳反应体系为25μL SRAP体系。25μL SRAP体系为:75 ng DNA,0.2 mmol/L d NTP,1.25 U Taq酶,0.16μmol/L的单条引物,2.0 mmol/L Mg~(2+),2.5μL 10×Buffer。选用33个丝瓜品种对所确立扩增体系及扩增程序进行验证,检测结果表现为扩增产物条带清晰明亮、亮度高、重复性好,表明本试验所确定的反应体系及反应程序适用于丝瓜的SRAP分子标记。 相似文献
2.
《分子植物育种》2017,(8)
以改良CTAB法提取水葫芦苗基因组DNA为模板,利用正交设计试验对影响ISSR-PCR反应体系的5个因素(TaqDNA聚合酶,dNTP,引物,模板及Mg~(2+))进行了优化筛选。经极差分析和方差分析,最终建立了水葫芦苗ISSR-PCR的最佳反应体系。结果表明,总体积20μL的反应体系中各因素浓度分别为:TaqDNA聚合酶0.025 U/μL、Mg~(2+)1.5 mmol/L、dNTP 1.0 mmol/L、引物0.5μmol/L、模板DNA 1.5 ng/μL。通过筛选得到10条扩增条带清晰的ISSR引物,并通过梯度PCR确定了各引物的最适退火温度。在此基础上对循环次数进行优化,最终确定最佳循环次数为40次。 相似文献
3.
《分子植物育种》2021,19(7):2286-2292
为建立胡桃楸天然林ISSR-PCR反应体系,本实验从DNA的提取到扩增进行了研究。通过对比CTAB和试剂盒两种方法,发现胡桃楸最佳DNA提取方法为试剂盒法。利用正交试验设计法确定了胡桃楸ISSR-PCR反应最佳体系,并对影响胡桃楸PCR反应的Taq酶浓度、Mg~(2+)浓度、dNTP浓度等因素进行了优化。最终获得胡桃揪ISSR-PCR反应的最优扩增程序为:95℃预变性3 min,95℃变性30 s,48.3℃复性30 s,72℃延伸1 min,28次循环,最后72℃终延伸5 min。优化胡桃楸ISSR-PCR的最佳反应体系为:Taq DNA聚合酶浓度为0.75 U/20μL、Mg~(2+)浓度为1.75 mmol/L、dNTP浓度为0.20 mmol/L、引物浓度为0.35μmol/L、DNA模板浓度为150 ng/20μL。该研究为以后利用ISSR分子标记技术研究胡桃楸的亲缘关系和遗传多样性提供高效的技术手段。 相似文献
4.
《华北农学报》2017,(Z1)
为了对玉米弯孢病菌的鉴定、区域发生关系以及遗传多样性等进行研究,采用单因素试验优化玉米弯孢叶斑病菌ISSR-PCR反应体系中模板DNA、引物、dNTPs、Taq酶、Mg~(2+)的用量,并确定每条引物的最佳退火温度。结果表明,最佳反应体系为:模板DNA 1.6μL(25 ng/μL)、引物1.4μL(5μmol/L)、dNTPs 0.25μL(2.5 mmol/L)、Taq酶0.4μL(2.5 U/μL)、Mg~(2+)0.8μL(25 mmol/L)、10×Taq Buffer 2μL、dd H2O 13.55μL。在该体系下选用3个玉米弯孢病菌的全基因组DNA,分别对52条ISSR引物进行筛选,筛选出16条多态性高、扩增稳定的ISSR引物。玉米弯孢病菌ISSR-PCR反应体系的建立为利用ISSR分子标记技术对该病原菌进行遗传分析奠定了基础。 相似文献
5.
仁用杏ISSR分析体系的正交优化 总被引：6，自引：0，他引：6
本研究以仁用杏丰仁为试材,采用经改良的CTAB法提取实验材料幼叶基因组DNA.利用正交设计法,从Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq/DNA聚合酶及模板DNA用最5种因素4水平出发,构建和优化仁用杏ISSR-PCR反应体系,并采用直观分析和方差分析相结合的方法分析正交实验结果,最终建立了仁用杏ISSR-PCR最佳反应体系总体积20μL:1.5 U Taw DNA聚合酶、2.0 mmol/L MgCl_2、0.15 mmol/L dNTPs、0.35μmol/L引物、30～60 ng模板DNA.在优化体系的基础上筛选出 13个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定每个引物的最适退火温度.经对最佳反应体系和程序进行了验证,结果显示该体系具有扩增稳定性. 相似文献
6.
柑桔SRAP和ISSR分子标记技术体系的建立与优化 总被引：16，自引：0，他引：16
通过对PCR反应程序、反应体系(DNA模板量、PCR反应体积、Mg2 浓度、dNTP浓度、Taq酶用量、引物量)、电泳检测方法的系统优化,建立了柑桔SRAP-PCR和ISSR-PCR体系;以此进行大规模引物筛选,从而建立了柑桔SRAP和ISSR分子标记技术体系.SRAP-PCR:25μL体系,模板DNA25ng,Tris-HCl10 mmol/L,KCl50 mmol/L,Mg2 1.2 mmol/L,dNTP 120 μmol/L,Taq酶1.5U,引物0.4μmol/L,反应程序为94℃预变性5min,35个循环(94℃ 30s,47℃ 1min,72℃ 1min),72℃延伸10min;ISSR-PCR:25μL体系,模板DNA25ng,Tris-HCl10mmol/L,KCl50mmol/L,Mg2 1.6 mmol/L,dNTP200μmol/L,Taq酶1 U,引物0.8μmol/L.筛选出稳定性好、多态性高的24对SRAP引物和13条ISSR引物. 相似文献
7.
本研究旨在建立和优化橡胶草及其近缘种ISSR (Inter-simple sequence repeat)反应体系和扩增程序。以橡胶草及其近缘种叶片为供试材料,采用单因素试验方法,正交试验方法 L16(44)和极差分析方法,对橡胶草ISSR-PCR反应中4个主要影响因素(dNTP浓度, DNA浓度,引物浓度和Taq DNA聚合酶浓度)进行优化,并在最优反应体系的基础上进行引物和退火温度的筛选。结果表明:dNTP和DNA对PCR扩增结果有较为显著的影响,引物和Taq酶的浓度变化对扩增结果无显著影响。最后确定橡胶草及其近缘种ISSR-PCR反应体系(20.0μL)为:双蒸水14.2μL,10×Buffer (含Mg2+) 2.0μL,DNA模板50.0 ng,10 mmol/L引物1.2μL,2.5 mmol/L dNTP 1.6μL,5 U Taq DNA聚合酶0.1μL。PCR扩增程序为:94℃5 min,94℃45 s,退火1 min,72℃70 s,45个循环,72℃10 min,4℃保存。本研究为橡胶草及其近缘种的遗传多样性和交配系统等后续研究提供理论参考。 相似文献
8.
《分子植物育种》2017,(5)
本研究采用L_(16)(4~5)正交试验设计方法,对朱顶红SRAP-PCR反应体系中的5种因素(Mg~(2+)浓度,d NTPs浓度,引物浓度,DNA模板量和Taq DNA聚合酶用量)进行优化,结果表明各因素对朱顶红SRAP-PCR扩增反应影响大小依次为:d NTPs浓度引物浓度Mg~(2+)浓度DNA模板量Taq DNA聚合酶用量。优化获得的朱顶红最佳SRAP-PCR反应体系为:1×PCR Buffer、Mg~(2+)浓度2.0 mmol/L、d NTPs浓度0.2 mmol/L、引物浓度0.25μmol/L、20μL体系中DNA模板量80 ng以及Taq DNA聚合酶用量0.5 U。用10个朱顶红品种基因组DNA对所得最优体系进行验证,证明该体系具有较高的稳定性和重复性,能够为朱顶红遗传多样性研究和遗传图谱构建等提供重要技术支持。 相似文献
9.
枣ISSR扩增体系的建立 总被引：5，自引：0，他引：5
以冬枣DNA为研究对象,利用单因素试验,分析了Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶含量、引物浓度、模板DNA含量以及退火温度对ISSR-PCR扩增的影响,经优化建立了枣属植物最适ISSR-PCR反应体系,25μL反应液中包含1×PCR Buffer、2.0 mmol/L Mg2+、0.25 mmol/L dNTP、1.5 UTaq酶、1.25μmol/L引物和50 ng模板,最适退火温度为58℃。PCR反应体系的建立为应用ISSR标记技术开展枣种群遗传变异分析和构建遗传图谱奠定基础。 相似文献
10.
以小花异裂菊的叶片为材料,采用正交和单因素试验研究Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响。建立了适宜于小花异裂菊的ISSR-PCR反应体系,即25μL的体系中含Mg2+1.5 mmol/L,dNTP 0.20 mmol/L,TaqDNA聚合酶1.5 U,引物0.8μmol/L,模板DNA 50 ng,10×Buffer 2.5μL。该体系稳定、可靠,为利用ISSR分析小花异裂菊遗传多样性等工作奠定了良好的基础。 相似文献
11.
《分子植物育种》2020,(12)
为建立郁金香SSR-PCR反应体系,本研究以36个荷兰引进的郁金香栽培品种和5个产于中国新疆的野生种为试验材料,采用单因素试验和L_(16)(4~5)正交设计相结合的方法,对影响郁金香SSR-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA、Taq酶用量进行优化,建立最佳的SSR-PCR反应体系,并利用3对引物在41份郁金香材料中验证反应体系的稳定性。结果表明:在20μL的PCR反应体系中,10×PCR Buffer (Mg~(2+)free) 2μL、Mg~(2+)2.0 mmol/L、dNTPs 0.75 mmol/L、引物2.0μmol/L、模板DNA 10 ng、Taq酶0.15 U为最优体系;通过正交试验确定5个因子对SSR-PCR体系的影响程度为:模板DNATaq酶引物Mg~(2+)d NTPs。筛选出的3对引物在41份郁金香材料中均可扩增出目的条带,表明该体系的稳定性好。本研究建立SSR-PCR反应体系,为郁金香SSR标记的开发以及遗传多样性分析、品种指纹图谱构建、种质资源鉴定等方面提供了帮助。 相似文献
12.
《分子植物育种》2020,(15)
以藜芦为试验材料,通过L_(16)(4~5)正交试验与单因素实验两种方法对藜芦ISSR-PCR反应体系中的5个主要因素(模板DNA,引物, Taq DNA聚合酶, dNTPs, Mg~(2+))进行筛选与优化,建立藜芦ISSR-PCR最佳反应体系;在此优化体系下,从100条引物中筛选适宜的ISSR引物,设置温度梯度检测各引物最佳退火温度。结果表明,藜芦20μL ISSR-PCR反应体系包括:0.30μmol/L引物、24 ng/20μL模板DNA、2 U/20μL Taq DNA聚合酶、0.20 mmol/L dNTP、1.00 mmol/L Mg2+;从100条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。利用14份藜芦样品验证该优化体系的稳定性,证明该体系稳定可靠,可为后续藜芦的遗传多样性分析研究提供帮助。 相似文献
13.
黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)为茄科枸杞属小灌木。果实为黑紫色球形浆果,具有较高的药用价值、营养价值、生态价值和经济价值。该研究以青海省野生黑果枸杞为材料,将对黑果枸杞ISSR-PCR反应产生主要影响的五种因子(Taq DNA聚合酶, dNTP, Mg~(2+),引物和模板DNA)进行L_(16)(4~5)的正交试验,以建立黑果枸杞ISSR-PCR最佳反应体系,并对反应体系进行验证。在此基础上筛选出适宜的ISSR引物,用梯度法优化各引物的最佳退火温度。结果表明:黑果枸杞20μL ISSR-PCR反应体系中包括Taq DNA聚合酶0.02 U/20μL,Mg~(2+) 1.65 mmol/L,dNTP 0.15 mmol/L,引物0.60μmol/L和模板DNA 50 ng;在100条ISSR引物中筛选出16条最适引物,并确定了各引物的最适退火温度为44℃～54.5℃;最佳扩增程序设定为94℃预变性5 min;然后94℃变性20 s,44℃～54.5℃复性1 min,72℃延伸1 min 20 s,共进行38个循环;最后72℃延伸6 min,4℃保存。该体系在黑果枸杞不同样品中所得条带清晰且多态性丰富,有助于后续青海省黑果枸杞种质资源筛选和遗传多样性分析研究。 相似文献
14.
大豆SSR技术反应体系的优化 总被引：3，自引：0，他引：3
以大豆为材料,研究了PCR反应体系的主要成分模板DNA浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq酶浓度及退火温度对大豆SSR扩增结果的影响,探索影响SSR扩增结果的各因素的最佳用量及引物的退火温度。结果表明:在试验设计范围内,DNA浓度和dNTP浓度对扩增影响较大,引物浓度在0.05~0.2μmol/L范围内对扩增影响较小,Taq酶浓度对扩增有一定影响,引物要有其扩增适宜的退火温度。确立了适合大豆SSR分子标记研究的优化体系。最终确定总反应体系为20μL,模板DNA 20 ng,dNTP 200μmol/L,引物0.15μmol/L,Taq酶0.5 U,10×Taq Buffer 1.5 mmol/L,ddH2O补至20μL。 相似文献
15.
16.
利用桃儿七叶绿体全基因组开发cpSSR引物,使用正交设计试验,对桃儿七cpSSR-PCR反应体系中的5种主要因素(模板DNA,Mg~(2+),Taq DNA酶,dNTPs及ISSR引物)进行筛选优化来研究桃儿七遗传多样性。选取甘肃碌曲县则岔石林桃儿七居群样本及13个不同桃儿七居群验证该反应体系。正交试验表明:各因素显著性为Mg~(2+)引物Taw酶DNA浓度dNTPs,桃儿七cuss-PCR反应的最佳体系为(25μL):DNA20 ng/μL,Mg~(2+)1.5 mmol/L,dNTPs 2.0 mmol/L,Taq DNA酶0.5 U,引物1.0μmol/L,2.5μL 10×Buffer。该体系具有很高的稳定性和重复性,并为野生桃儿七遗传多样性及保护策略研究提供了技术支持。 相似文献
17.
《分子植物育种》2017,(4)
为通过ISSR分子标记研究桃儿七遗传多样性,建立并优化桃儿七的ISSR-PCR反应体系。使用正交设计辅以单因素试验,对桃儿七ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素(模板DNA,Mg~(2+),Taq DNA酶,d NTPs及ISSR引物)进行筛选优化,选取甘肃碌曲县西仓神山山顶桃儿七居群样本验证该反应体系。正交试验各因素显著性为引物Taq DNA酶DNA浓度dNTPsMg~(2+),桃儿七ISSR-PCR反应的最佳体系为(25μL):2.5 mmol/L Mg~(2+),0.2 mol/L dNTP,0.4μmol/L引物,0.5 U Taq DNA酶,40 ng DNA,2.5μL 10×Buffer。该体系具有高稳定性,多态性丰富的特点,为野生桃儿七遗传多样性及保护策略研究提供了技术支持。 相似文献
18.
二月兰SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选 总被引：1，自引：1，他引：0
为建立适合二月兰的SSR-PCR反应体系,采用正交试验设计方法对影响二月兰SSR反应体系的5个因素(DNA模板、Mg~(2+)、d NTPs、引物和Taq聚合酶)进行优化试验,筛选出每个因素的最佳水平。结果表明,10μL反应体系中,Mg~(2+)浓度2.0 mmol/L,d NTPs浓度0.4 mmol/L,引物浓度0.6μmol/L,DNA模板量20 ng,Taq聚合酶量0.6 U。以3份二月兰基因组DNA为模板,利用优化后的SSR-PCR反应体系进行引物筛选,从50对SSR引物中成功筛选出扩增条带清晰、具有多态性的引物有12对,证明该反应体系具有较好的稳定性和通用性。研究建立和优化的二月兰SSR-PCR反应体系,为进一步利用SSR标记技术开展二月兰分子生物学研究提供了理论依据和技术参考。 相似文献
19.
以CTAB法提取的马蹄金叶片DNA为模板,应用L16(45)正交表系统分析了DNA、Mg2+、dNTP、Taq酶、引物5种ISSR反应成分浓度变化对扩增结果的影响。量化分析结果表明:Taq酶、dNTP不同水平对PCR反应结果有显著影响,正交设计可以应用于ISSR-PCR反应体系的建立,用这种方法建立的马蹄金IS-SR优化反应体系为:1×buffer,25ng模板DNA,1.75mmol/LMg2+,225μmol/LdNTP,0.9μmol/L引物,1.25UTaqDNA聚合酶,总体积20μl。这一优化系统的建立为今后利用ISSR标记技术,研究马蹄金的地理变异提供一个标准化程序。 相似文献
20.
建立最适的PCR反应体系是成功进行ISSR-PCR的关键,且反应的扩增效果易受多种因素的影响,本研究采用正交试验和单因素筛选试验两种方法,选用凤仙花叶片DNA为实验材料,针对影响凤仙花ISSR-PCR反应较大的 Mg~(2+)、dNTPs、Taq酶、引物、模板DNA这5个因素进行优化并筛选,最终建立凤仙花ISSR-PCR最佳反应体系:25μL PCR反应体积中, Mg~(2+)浓度为2.0 mmol/L、引物浓度为0.4μmol/L、模板DNA浓度为150 ng、dNTPs浓度为0.15 mmol/L、Taq酶为0.5 U。利用该体系筛选出14条可用于凤仙花ISSR-PCR扩增的引物。通过建立凤仙花属最佳ISSR-PCR反应体系,为研究凤仙花属植物提供分子标记水平上的理论依据和技术方法。 相似文献