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1.
为了建立猪圆环病毒2型（PCV2）SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,采用PCR扩增PCV2 ORF2基因242 bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了PCV2荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.2×101拷贝/μL,与猪圆环病毒1型（PCV1）、猪瘟病毒（CSFV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、乙型脑炎病毒（JEV）核酸均不发生扩增反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明：建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PCV2的检测。 相似文献
2.
《畜牧与兽医》2020,(8)
为建立快速、灵敏且特异的检测猪圆环病毒3型(porcine circovirus, PCV)的实时荧光定量PCR方法,本研究根据ORF2基因的保守序列设计一对特异性引物和TaqMan探针,通过构建标准品质粒来制作荧光定量PCR标准曲线,优化反应条件,验证敏感性、特异性及重复性,建立了检测PCV3的实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法可以特异性检测出PCV3,而对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒等检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。用构建的标准品质粒测得的灵敏度可以达到10 copies/μL,重复试验批内及批间变异系数均小于2%,表明其具有良好的灵敏性和重复性。以上结果表明,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏性高、特异性强的优点,可为我国PCV3型的早期检测及相关研究工作提供可靠的技术支持。 相似文献
3.
为建立同时快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪圆环病毒3型(PCV3)的二重PCR方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV M基因和PCV3 Rep基因高度同源保守序列设计并合成2对特异性引物,分别扩增PEDV M基因与PCV3 Rep基因,经过反应条件优化,建立了检测PEDV与PCV3的二重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:该方法对PEDV和PCV3的检测结果为阳性,而对猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒等8种常见的病原体均未检测到荧光信号;且具有良好的线性关系,R^2为0.99;应用本方法对PEDV和PCV3的最低检出量分别为37.6拷贝/μL和61.2拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于2%。结果表明:本试验建立的PEDV和PCV3二重实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效、定量检测PEDV和PCV3提供了技术帮助。 相似文献
4.
《四川畜牧兽医》2021,(5)
为建立一种快速、特异、灵敏的猪圆环病毒3型(PCV3)实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中PCV3全基因组序列高度保守区域设计了一对特异性引物和探针,通过对反应体系和扩增条件进行优化,建立了能够特异性检测PCV3的荧光定量PCR方法。该方法对7.87×10~3～7.87×10~9拷贝/μL的PCV3标准质粒呈现良好的线性关系,最低检出浓度为7.87×10~1拷贝/μL,比常规PCR的灵敏度高100倍。与猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪乙型脑炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒均无交叉反应,具有良好的特异性。不同浓度质粒标准品的组内和组间重复性试验结果均显示变异系数(CV)小于1%,重复性较好。对2018～2020年从四川省不同地区收集的329份正常猪血清及187份疑似PCV阳性临床样品进行检测,得出PCV3阳性率分别为31.3%和38.5%,流行率较高。上述结果表明,本研究建立的荧光定量PCR方法能够快速灵敏地检测PCV3,为PCV3的临床检测及流行病学调查奠定了基础。 相似文献
5.
猪圆环病毒3型TaqMan荧光定量PCR方法的建立和初步应用 总被引：2，自引：1，他引：1
为了灵敏而便捷的检测猪圆环病毒3型(PCV3),根据PCV3ORF2基因组保守序列设计合成4对引物,先使用荧光染料(SYBR)定量PCR法验证其能否有效扩增目的片段,并根据结果和引物对所扩增序列的交集进一步设计TaqMan探针,通过优化反应条件和反应体系建立快速检测PCV3的实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,SYBR染料法和TaqMan探针法均能有效地扩增PCV3标准质粒以及其他阳性样品,并且对1.29×10~2~1.29×10~9拷贝·μL~(-1)的PCV3标准质粒(Pmd18-t-Cap)呈现良好的线性关系,该方法的检测灵敏度为1.29×10~2拷贝·μL~(-1),比常规PCR的灵敏度高100倍,该方法与猪圆环病毒2型、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒基因以及猪链球菌、猪肺炎支原体等细菌基因均无交叉反应,具有良好的特异性;批次内重复和批次间重复试验结果显示变异系数(CV)均小于1.5%,呈良好的可重复性。用该方法对2016年至2017年间收集的124份来自湖北省等地的猪病料DNA样品进行检测,结果显示本地区PCV3阳性率为8.06%(10/124),PCV2和PCV3共感染率为8.06%(10/124)。上述结果表明,本研究建立TaqMan荧光定量PCR能够灵敏特异的检测圆环病毒3型,为圆环病毒3型的临床检测提供有效手段。 相似文献
6.
采用PCR方法克隆了猪圆环病毒2型 (porcine circovirus 2,PCV2) 衣壳蛋白（capsid protein,CAP）基因,构建了重组质粒p-18T-CAP,并将其作为标准阳性模板。参照GenBank收录的PCV2 ORF2基因设计合成1对特异性的引物和与该引物相匹配的特异探针,通过对反应条件进行优化,以定量的10倍系列稀释的质粒p-18T-CAP为标准品进行TaqMan荧光定量PCR扩增,建立了一种检测PCV2的TaqMan荧光定量PCR方法。试验结果显示,该方法与猪圆环病毒 1 型、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒等均无交叉反应;该方法最低可检测到4.53×102拷贝/μL,比PCR检测方法高100倍;其标准曲线线性范围是102～109拷贝/μL,且具有良好的重复性。 相似文献
7.
《中国兽医学报》2016,(3):378-383
参照GenBank中猪伪狂犬病毒(PRV)gE基因以及猪圆环病毒2型(PCV2)中ORF2特异性序列,设计特异引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件,建立了同时检测PRV野毒株和猪圆环病毒(PCV2)的双重荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果表明,该方法检测PRV和PCV2灵敏度分别可达2.23×101、4.5×102拷贝/μL,均比常规PCR检测方法高100倍;同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、均为阴性,无交叉反应;对30份疑似病料进行检测并与普通PCR进行比较,结果显示,二者检测PRV的总符合率为96.67%,检测PCV2的总符合率为93.33%。本试验建立的TaqMan-MGB双重荧光定量PCR检测方法可同时对PRV野毒株和PCV2进行早期快速诊断,可应用于病原学监测,流行病学调查等。 相似文献
8.
9.
《畜牧与兽医》2020,(8)
试验旨在建立一种快速的猪圆环病毒3型(PCV3)抗体检测方法。采用PCR方法对PCV3 ORF2基因主要抗原区域进行扩增,并利用原核表达系统进行截短表达,以纯化后的重组蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA抗体检测方法。结果显示:PCR扩增了片段大小为348 bp的ORF2基因主要抗原区域,PCR扩增产物克隆至pET-32a原核表达载体,转入大肠杆菌BL21,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白,纯化后经Western blot鉴定表明具有良好的反应活性。以重组蛋白作为包被抗原建立了检测PCV3抗体的间接ELISA方法,对PCV3阳性血清的最低检出效价可达1∶20 480;用该方法检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、乙型脑炎病毒(JEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪常见疫病阳性血清,结果均为阴性;批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均小于5%。应用该方法检测四川地区533份不同日龄临床猪血清样品,PCV3阳性感染率达14.82%。表明建立的ELISA方法具有良好的敏感性、特异性、重复性和临床适用性,为我国商品化PCV3血清学抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。 相似文献
10.
根据猪圆环病毒2型(PCV2)Rep基因序列，设计引物及探针，建立了PCV2实时荧光重组酶介导等温扩增(recombinase-aid amplification, RAA)检测方法。该方法能在40℃恒温条件下20 min内对病原进行快速检测，与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪传染性胃肠炎病毒、繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒3型和口蹄疫病毒均无交叉反应；对病毒核酸的最低检测限为21.2 copies/μL。用荧光PCR检测方法与建立的荧光RAA检测方法对66份临床样品进行检测，两种方法符合率为90.09%。结果表明，建立的PCV2实时荧光RAA方法适用于PCV2的快速检测。 相似文献
11.
猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
本研究以猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白ORF2基因为目的基因,设计合成特异性引物和探针。PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体,筛选得到标准阳性质粒。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了PCV2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异性强,对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)等猪常见病原的检测结果均为阴性;与普通PCR方法相比,其敏感性高出100倍,可达100拷贝/μL;对临床样品的检测证明,该方法可有效检测出淋巴结、肺脏等组织中的PCV2。 相似文献
12.
猪圆环病毒2型和3型双重PCR检测方法的建立及应用 总被引：2，自引：0，他引：2
建立一种能够同时快速检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重PCR方法,为猪圆环病毒病的快速诊断及流行病学的研究提供技术支持。根据Gen Bank中报道的PCV2和PCV3毒株全基因序列,在建立各病毒单项PCR检测方法的基础上,筛选双重PCR反应的最佳条件。扩增两种病毒的片段分别为1 154 bp和649 bp。建立的PCV2/3双重PCR检测方法的最佳退火温度为55℃,最佳引物终浓度为1. 0pmol/μL。应用建立的双重PCR方法和单项PCR方法分别对73份临床猪病料进行PCV2和PCV3检测,对结果进行对比分析,结果显示两者的符合率为100%。经初步临床应用,所建立的双重PCR检测方法可用于对PCV2和PCV3的同时鉴别检测。 相似文献
13.
为快速检测猪圆环病毒4型(PCV4),本研究根据PCV4的Cap基因片段保守区设计引物和探针,建立了PCV4重组酶介导核酸等温扩增荧光法(RAA),并应用该方法对40份猪组织样品进行检测。结果表明,该方法可在20 min内,42℃恒温条件下特异性检测出PCV4,以猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒核酸为模板进行反应的扩增结果均为阴性;最低检出限至7.42×101拷贝/μL,灵敏度较高。利用建立的RAA检测方法和常规PCR法分别对猪组织样本进行检测,均未检出,表明当前猪场流行率较低。综上所述,本研究建立的PCV4实时荧光RAA检测方法快速简便、特异性强、灵敏度较高,可应用于PCV4的临床筛查与流行病学研究。 相似文献
14.
《中国畜牧兽医》2016,(7)
本研究根据猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的gE基因序列特点,设计特异性实时荧光定量引物,建立基于SYBR GreenⅠ染料的猪PRV实时荧光定量PCR方法。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法检测猪PRVgE基因在7.53×10~1~7.53×10~6拷贝/μL范围内有较好的线性关系;对猪圆环病毒(porcine circovirus2,PCV2)、猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)和猪链球菌(Streptococcus susi)核酸均未见阳性扩增信号;从生成的熔解曲线可见,建立的方法仅对猪PRV检测出现单一特异峰,其熔解温度(Tm值)为(92.9±0.1)℃,PCV2、PPV、副猪嗜血杆菌和猪链球菌均未见特异性峰值;建立的实时荧光定量PCR方法的组内和组间变异系数分别为0.31%~1.14%和0.42%~1.74%。以上结果表明,本研究建立的猪PRV实时荧光定量PCR方法敏感性高、特异性强、重复性好,为深入开展猪PRV对宿主致病机制的研究提供检测手段。 相似文献
15.
为建立快速区分3种猪圆环病毒（PCV2、PCV3和PCV4）的现场检测方法,采用微流控芯片环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）,收集3种猪圆环病毒临床阳性样本进行核酸提取,与市场上3种猪圆环病毒荧光探针法检测试剂盒进行灵敏度、特异性和重复性同步比对。结果显示：微流控芯片LAMP法在3种猪圆环病毒联检测试中具有非常高的灵敏度,可以在30 min内,实现不低于荧光定量PCR法的敏感性;与非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒临床阳性样本均无交叉反应,特异性好;测试3种猪圆环病毒重复性Ct值变异系数（CV）均在2%以下,稳定性好。结果表明：3种猪圆环病毒微流控芯片快速联检技术特异性好、灵敏度高、重复性强,检测速度快,环境要求低,可以满足现场检测的要求,适用于养猪场等场所的猪圆环病毒现场快速检测。本方法的建立为猪相关病原体的现场快速核酸检测提供了有力工具。 相似文献
16.
参照GenBank登录的相关基因序列,设计了2对引物分别用于扩增伪狂犬病毒(PRV)gH基因与猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因的部分片段。将测序正确的PRV gH基因与PCV2ORF2基因片段克隆入pGEM-T Easy载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果显示,PCV2与PRV荧光定量PCR的标准曲线的Tm值分别为80.8℃和86.7℃,熔解曲线特异,灵敏度分别可达215拷贝/μL和180拷贝/μL,是普通PCR检测方法的100倍。结果表明,建立的PCV2与PRV荧光定量PCR检测方法实现了2种病毒的同时检测,能够对PRV、PCV2混合感染的临床病料进行快速诊断。 相似文献
17.
猪圆环病毒2型和3型双重PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
《中国兽医学报》2019,(1):25-30
猪圆环病毒3型(PCV3)是一种新的猪圆环病毒,与猪皮炎和肾病综合征、母猪繁殖障碍及心脏和多系统炎症相关。为了建立一种同时快速检测猪圆环病毒2型(PCV2)和PCV3的双重PCR方法,根据GenBank收录的PCV2和PCV3基因序列,分别在PCV2 Cap基因和PCV3 Rep基因高度同源保守区设计并筛选2对特异性引物,经过双重PCR反应条件的优化,建立了同时检测PCV2/3的双重PCR检测方法。本方法可同时扩增出PCV2、PCV3的486,270bp特异性片段,而扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)等病原核酸结果均为阴性;PCV2/3最低检出量分别为139,21.7拷贝/μL。经临床应用表明,本试验建立的双重PCR方法简便、快速,敏感度高,特异性强,为PCV2/3的鉴别诊断和联合检测提供了依据。 相似文献
18.
《中国兽医学报》2015,(9)
旨在建立一种能快速、灵敏、同时检测出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)与猪瘟病毒(CSFV)3种病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。参照GenBank中登录的相关基因序列,设计了3对引物分别用于扩增PRRSV ORF7基因、PCV2ORF2基因与CSFV 5′端保守序列的部分片段。将测序正确的3段基因片段分别克隆入pGEM-T Easy载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和溶解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果表明,PCV2、PRRSV与CSFV荧光定量PCR的标准曲线的Tm值分别为84.6、86.7、89.3℃,溶解曲线特异,灵敏度分别可达181、202、177拷贝/μL,是普通PCR检测方法的100倍。本试验建立的PRRSV、PCV2与CSFV的荧光定量PCR检测方法实现了3种病毒的同时检测,能够对PRRSV、PCV2、CSFV混合感染的临床病料进行快速诊断。 相似文献
19.
利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),以猪圆环病毒2型Cap基因的保守序列为靶序列设计并筛选出一组特异性的引物和探针,建立了快速检测猪圆环病毒2型核酸的RPA方法。试验结果表明,该方法特异性强,猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)核酸检测结果均为阴性,灵敏性高,最低可检出核酸浓度为0. 87×10-4ng/μL,简单快速,且重复性好。利用所建立的RPA方法对183份临床样品进行检测,结果与实时荧光PCR方法符合率为98. 9%。本研究为猪圆环病毒2型核酸的快速检测提供了一种新方法,尤其适合基层实验室或养猪场的快速检测。 相似文献
20.
根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7和猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1的核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR/PCR扩增,分别扩增出大小为308 bp和417 bp的部分基因片段。用T4连接酶将目的片段与pGEM-Teasy载体系统连接,并转化到大肠杆菌DH-5α株感受态细胞。提取的质粒经PCR、酶切和测序鉴定,证实为PRRSV和PCV2的阳性重组质粒。将重组标准质粒10倍系列稀释后作为模板,通过实时荧光定量PCR方法(Real-time PCR),建立了PRRSV、PCV2的标准曲线及其直线回归方程,并确定其最佳读板温度。该方法具有线性关系好、特异性强、敏感性高、重复性好等特点,为分析PRRSV和PCV2共感染猪体内病毒的绝对含量提供了必要的技术平台。 相似文献