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1.
【研究目的】建立可在临床上检测鸡传染性支气管炎抗体的检测IBV抗体的间接ELISA方法;【方法】以表达的重组IBVNP蛋白为包被抗原,将之包被于聚苯乙烯酶标板上,以封闭液进行封闭,然后加待检血清在37℃作用1h,洗涤后加酶标兔抗鸡IgG抗体,在37℃作用1h,加底物显色,终止反应后测定OD值;【结果】抗原包被浓度为1.45μg/ml,待检血清最佳稀释度为1:40,酶标二抗最佳工作浓度为1:1000,确定阳性判定标准为OD450≥0.314。NP-ELISA与AIVH9、H5、H7、IBD、ND、EDS76的标准阳性血清不发生交叉反应,具有良好的特异性;【结论】NP-ELISA具有特异性强、灵敏度高、重复性好、方便快速的特点,可用于临床IB抗体的检测。 相似文献
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【目的】研究并建立大豆抗原蛋白血清抗体间接ELISA检测方法。【方法】首先用大豆抗原蛋白对仔猪进行致敏,然后采用棋盘滴定法确定最佳抗原包被质量浓度及血清稀释倍数,并对其他条件进行优化,最终建立检测血清大豆抗原蛋白11S、7S抗体的间接ELISA方法,确立待测血清判定标准,并对建立的ELISA方法进行重复性、准确性和敏感性检测。【结果】建立的ELISA方法的最佳反应条件为:11S抗原蛋白最适包被质量浓度为2.0μg/mL,包被作用时间37℃下2h;将10g/L BSA作为封闭液,37℃封闭1h;待测血清37℃作用1h;酶标二抗最适稀释度为1∶1 500,37℃作用1h;显色剂最佳显色时间15min。7S抗原蛋白的最适包被质量浓度为2.5μg/mL,包被作用时间37℃下2h;将10g/L BSA作为封闭液,37℃封闭1h;待测血清37℃作用1h;酶标二抗最适稀释度为1∶1 500,37℃作用1h;显色剂最佳显色时间25min。11S和7S抗原蛋白间接ELISA检测方法的批内、批间变异系数均小于10%,重复性较好,灵敏度较高。【结论】建立了仔猪血清大豆抗原蛋白抗体间接ELISA检测方法,该法具有很强的特异性和敏感性,可用于大豆抗原蛋白11S、7S过敏反应的临床诊断。 相似文献
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间接ELISA法检测羊促乳素抗体方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】建立促乳素单克隆抗体制备中筛选阳性分泌细胞的间接ELISA检测方法。【方法】用促乳素纯品与Freund佐剂免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠,初次免疫采用抗原与完全Freund佐剂,每2周免疫1次,从第2次开始采用抗原与不完全Freund佐剂,免疫4次后尾静脉采血,收集血清制备阳性对照抗体,以未免疫的BALB/c小鼠血清为阴性对照,筛选间接ELISA法检测促乳素抗体的最佳反应条件,并对单克隆抗体制备中的阳性细胞进行筛选。【结果】间接ELISA法的最佳反应条件:血清稀释倍数为1∶200,抗原包被质量浓度为100 ng/mL,封闭液为1%牛血清白蛋白,酶标抗体的工作浓度为1∶10 000,酶标抗体作用时间为37℃90 min,底物作用时间37℃30min。用该方法检测融合的杂交瘤细胞,最终获得OD450为0.875和0.460的阳性细胞株。【结论】建立了检测促乳素抗体的间接ELISA检测方法,该方法方便易行。 相似文献
4.
芽孢杆菌BJ-6分离于杏树根部土壤,对多种植物病原真菌有抑菌活性,试验制备其抗血清,明确ELISA反应条件,用于相似抗原性生防茵的筛选.分别以芽孢杆菌BJ-6的抗茵蛋白和茵体研磨物为免疫抗原,制备出两种抗血清,采用间接ELISA方法测定发现:其效价分别为1:3200和1:6400;所购辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体效价为1:7000;待测抗原可在37℃3 h、4℃18 h+37℃3 h、37℃3 h+4℃18 h和4℃18h条件下包被:初步测定两种抗血清具有种的特异性. 相似文献
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实验通过纯化猪附红细胞体后免疫小鼠及家兔制备阳性血清,建立了猪附红细胞体双抗夹心ELISA检测方法.实验结果表明,以鼠阳性血清1:200稀释后作为捕获抗体,4℃包被过夜,1%明胶溶液37℃封闭1 h,兔阳性血清1:400稀释后作为检测抗体,辣根过氧化物酶标羊抗兔Igc抗体h:8000稀释,37℃显色10min为最佳反应条件.同时进行特异性、敏感性、重复性实验.该方法对猪附红细胞体最低检出量为3.812μg·mL-1,具有良好的特异性、敏感性和重复性,有望作为群体检测方法. 相似文献
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为提高鸡新城疫-传染性支气管炎二联活疫苗的耐热性能,根据前期研究设计了3个耐热保护剂配方,比较不同配方对疫苗的抗原冻干损失、温度耐受性和保存期的影响.结果显示,保护剂TS11、TS37、TS51所制备疫苗的抗原冻干损失均在0.5 lg以下,相互之间差异不明显.但TS37所制备疫苗在37℃和45℃耐受后的抗原效价下降滴度明显低于TS11和TS51,这说明TS37具有更好的耐热保护效果.另外,25℃、2～8℃保存试验显示,配方TS37可使疫苗在室温下至少能保存1个月、冷藏条件下至少保存27个月而抗原含量和攻毒保护仍能达到质量标准要求.因此,本试验研制成功针对鸡新城疫-传染性支气管炎二联活疫苗的耐热保护剂TS37,该保护剂可使疫苗实现2～8℃下长期保存. 相似文献
8.
为了快速诊断和检测鸭肿头败血症病毒抗原,用分离自典型鸭肿头败血症的XD株病毒,制备鸭抗XD IgG、兔抗XD IgG,建立了检测鸭肿头败血症病毒(DSHSV)抗原的间接夹心ELISA法。试验的最佳条件为:抗体包被量为8μg/mL,封闭液为0.5%明胶,抗原孵育条件为37℃1.5 h,兔抗XD病毒IgG浓度5μg/mL,酶标羊抗兔抗抗体浓度为1∶2000,洗涤液为0.02 mol/LpH7.2 PBS。阴阳性结果判定的临界OD值为0.412。重复性试验显示变异系数小于10%。建立的间接夹心ELISA法不与鸭肿头败血症阴性抗原、鸭大肠杆菌抗原、鸭瘟抗原、鸭肝炎病毒抗原呈现交叉反应。敏感性比琼脂扩散实验高1280倍。包被的酶标板在4℃至少可以保存3周。用此方法对人工感染鸭组织脏器中鸭肿头败血症病毒检测结果显示,心、肝、肺、肾检出率最高,脑、脾、胰次之。 相似文献
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【目的】制备猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白及其多克隆抗体,建立检测PDCoV N蛋白抗体的间接ELISA方法。【方法】从PDCoV CH-01毒株中扩增N全基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-PDCoV-N,转入BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组N蛋白,并对该蛋白的反应原性进行鉴定。诱导表达的N蛋白经镍柱纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。同时用镍柱纯化后的N蛋白作为包被抗原,建立PDCoV的间接ELISA检测方法,对该方法的特异性、重复性和稳定性进行检测,并利用该方法对河南部分地区猪场送检的165份临床猪血清样本进行PDCoV抗体检测。【结果】成功克隆了1 026 bp的N基因,构建了重组表达载体pET-28a-PDCoV-N,经诱导表达后获得了重组N蛋白,其相对分子质量约42.9 ku,Western blot分析表明所表达的蛋白可与抗PDCoV全病毒猪阳性血清发生反应。制备的PDCoV N蛋白多克隆抗体经Western blot检测表明,该抗体具有特异性;间接免疫荧光试验测定该多克隆抗体在ST细胞上的最佳使用稀释度为1∶200。以N蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法,确定最佳的反应条件如下:抗原2μg/mL在4℃过夜包被,10 g/L BSA在37℃下封闭2 h,血清(1∶80稀释)37℃孵育1 h,酶标二抗(1∶6 000稀释)37℃孵育1 h,TMB在37℃下显色15 min;待检血清OD_(450)值≥0.272判定为阳性。特异性试验结果显示,该包被抗原与其他猪常见病毒的阳性血清均无交叉反应,批内和批间重复试验变异系数均小于5%。用间接ELISA法对来自河南不同地区的165份血清样本进行检测,结果表明各地样本PDCoV抗体阳性率平均为53.94%。【结论】成功表达了PDCoV N蛋白,制备了其多克隆抗体,建立了PDCoV间接ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,可用于临床猪血清中PDCoV抗体的检测。 相似文献
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[目的]研究几种(海藻糖、蔗糖、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮、硫脲、明胶、L-精氨酸、抗坏血酸)保护剂,为口蹄疫抗原保护剂配方的形成提供参考。[方法]用三因素、三水平、双重复正交试验方法筛选出了对口蹄疫病毒(FMDV)抗原保护效果最好的I(4#)保护剂配方,以加保护剂A(已申请专利)的病毒为对照,比较其在不同条件下的TCID50和146s抗原的含量。[结果]通过方差分析4#保护剂保存病毒测得TCID50极显著的高于1、3、5、6、7、8号,显著高于2、9。将4#保护剂加入被保存的病毒抗原中,分别于4℃下保存90、120、150 d,其logTCID50分别为5.3、5.0和4.5,而加保护剂A(已申请专利)的对照病毒则为5.0、4.5和4.3;在37℃下保存40、50和60 h,其logT-CID50分别为4.5、2.5和1.0;而加保护剂A的对照病毒则为3.5、1.5和0.5,为了进一步验证保护剂对FMDV抗原的保护性能,进行了FMDV146s抗原含量的测定。分别于4℃下保存150 d,37℃下保存40 h,测得结果分别为0.796、0.462μg/ml,而加保护剂A的对照病毒则为0.602、0.307μg/ml。[结论]该复合配方保护剂I(4#)对FMDV有效抗原的保护作用优于保护剂A,尤其是病毒保护剂对提高FMDV的冷冻保存时间和耐热效能作用明显。 相似文献
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本试验用鸡胚大量繁殖鸡传染性支气管炎病毒（IBV）,收集尿囊液,用1％胰蛋白酶处理制备IBV血凝抗原,建立了血凝—血凝抑制（HA—HI）检测IBV抗体的方法,其特异性强、操作简便。另外,本试验建立Dot—ELISA方法用于检测IBV,病料经处理后,点样于硝酸纤维素膜,加兔抗IBV抗体,经PPA—DAB—H_2O_2系统显色,其检测结果与双抗体夹心ELISA的检测结果一致。两种诊断方法的建立为临床上检测病原和监测抗体提供了便捷的手段。 相似文献
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以鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M-41株为材料,人工诱发SPF鸡的IB(传染性支气管炎)。从IB潜伏期和康复期传染性、不同感染途径对IB的影响、不同日龄鸡只的易感性、与IB传染源接触的安全时间与安全距离进行了实验流行病学研究。结果表明:IB与SARS相似,在潜伏期传染性极低,而康复期IB与SARS相比则有一定的传染性;不同的感染途径均可引起发病,但发病的严重程度不一致,这与对SARS的研究相似;在易感性上,低日龄鸡对IB更易感,而儿童对SARS则不易感。与IB传染源接触的安全时间与安全距离则有待更深入的研究。 相似文献
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对两周龄SPF鸡用鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41株攻击时,以0．3ml／羽(100EID50)滴鼻人工感染发病,试验鸡出现气管哆音等典型的IBV临床症状,以及气管、肺、肾脏等器官的组织学病变。经nested RT-PCR全程跟踪检测,掌握了IBV M41株经呼吸道感染后动物带毒、排毒的时间规律,从而为控制和降低IB的发生提供参考。 相似文献
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[目的]从发病鸡群中分离出鸡传染性支气管炎病毒,并对其进行鉴定。[方法]从安徽某鸡场发病鸡群中分离出鸡传染性支气管炎病毒,采用鸡胚盲传,观察病毒对鸡胚的致病作用。通过动物回归试验,在SPF鸡上复制出支气管堵塞的症状,扩增分离毒株的S1基因片段,并与IBV疫苗毒株进行比较。[结果]对分离到的毒株进行HA检测,结果表明收获的尿囊液对鸡红细胞无凝集活性,说明分离到的病毒中无NDV、AIV等,但经1%胰酶处理则可凝集鸡红细胞,符合传染性支气管炎病毒的生物学特征。该毒株的第6代SPF鸡胚尿囊液通过滴鼻接种SPF鸡,可复制出与现场相似的临床症状,其发生了支气管堵塞的现象,初步证实分离的病毒为一株鸡传染性支气管炎病毒,命名为XZ株。[结论]该研究为鸡传染性支气管炎的防治提供了理论依据。 相似文献
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【目的】制备出广谱型鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N蛋白单克隆抗体,为后续N蛋白保守区域表位鉴定及IBV通用型快速检测方法的建立打下基础。【方法】通过原核表达IBV广西优势血清型代表株GX-YL5的N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,选取血清效价在104以上的免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选后通过小鼠腹水诱生法制备单克隆抗体,采用Western blotting、IFA及间接ELISA等进行效价、亚型、反应特异性、交叉反应谱鉴定,并将制备获得的单克隆抗体应用于免疫组化检测,检测SPF鸡人工感染4株IBV代表变异株(GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ171023和GX-QZ170728)后不同时段内气管和肾脏中的带毒情况。【结果】制备获得的单克隆抗体N2D5效价大于217,其亚型为IgG2b;Western blotting和IFA鉴定结果表明单克隆抗体N2D5只与IBV发生阳性反应,与新城疫病毒(NDV)、传染性喉气管炎(ILTV)、禽偏肺病毒(a MPV)、传染性法氏囊病(IBDV)、禽白血病病毒(ALV)及马立克氏病毒(MDV)的反应结果均呈阴性;单克隆抗体N2D5能与国内流行的多种基因型及广西目前流行的7种血清型IBV发生交叉反应,包括常用标准株、疫苗株和野毒株。将制备获得的单克隆抗体N2D5应用于免疫组化检测,结果发现在3株鸡源IBV代表性变异株及1株鸭源分离株人工感染SPF鸡后不同时段内的气管和肾脏中均能检测到病毒信号,进一步证明其广谱性。【结论】基于杂交瘤技术制备获得的IBV单克隆抗体N2D5属于IgG2b亚型,具有特异性高、反应谱广的特点,且与IBV的结合能力强,可作为特异性诊断抗体应用于IBV临床诊断及病毒分布规律研究。 相似文献
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七彩山鸡新城疫病毒的分离鉴定与免疫保护试验 总被引：6，自引：1，他引：5
用SPF鸡胚从疑似七彩山鸡新城疫病鸡群中分离到一株病毒,进行HA及HI试验以及病毒中试验。结果表明,血凝作用可被NDV阳性血清所抑制,而不能被AIV（H9亚型）、EDS76所抑制,经ND标准阳性血清处理的病料接种的鸡胚未见死亡,证明分离毒为NDV。动物回归试验表明,分离毒肌肉注射非免疫七彩山鸡能使之发病、死亡,出现与自然病例一致的症状与病变,但肌注SPF鸡只感染,不出现临床症状。其生物学特性NHAT为快、HOT为8min、ICPI为1．73、IVPI为1．45、MDT为44h。表明该七彩山鸡NDV分离株与鸡F48E9株在生物学特性上表现出不同的特性。用分离毒株制成油乳剂灭活疫苗,分别以分离毒株和Lasota株的灭活苗免疫广西麻鸡和七彩山鸡,进行疫苗免疫效果比较和交叉免疫保护试验。结果表明,分离毒株灭活苗免疫组鸡各个时期所产生的HI抗体效价和Lasota灭活苗免疫纽鸡的抗体效价相差不明显,各组的升降规律也基本一致;Lasota灭活苗免疫七彩山鸡对分离毒株的攻击只能80％保护。而其他各免疫组的无论是对分离毒株还是F48E9株的攻击均能100％保护。说明NDV不同毒株之间的毒力和抗原性存在一定的差异。 相似文献
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从患传染性腺胃病的病鸡中分离到4 株病毒,其中H95株在SPF鸡胚上已稳定传代。病料及H95 传代后的鸡胚尿囊液经蔗糖梯度和CsCl密度梯度离心后的纯化物,电镜下为大小80～160 nm 、有囊膜的病毒颗粒,囊膜表面有纤突,呈冠状形态。病毒在CsCl中的浮密度为1.19～1.23 g/cm 3, 对热和氯仿敏感,耐酸,能抵抗1% 胰酶,无直接血凝性,经卵磷脂酶C处理后的病毒则能凝集鸡红细胞,能干扰新城疫病毒在鸡胚上的增殖。应用杂交瘤技术筛选出4 株抗H95株的阳性克隆,经Western blotting, 其中3 株单抗能识别54 kd 蛋白多肽,该条带也能与来自鸡传染性支气管炎病毒(IBV) M41 株的针对N 蛋白的单抗反应。中和试验表明, H95株与其它IBV 毒株在血清型上存在差异。上述研究结果初步表明,鸡传染性腺胃病的病原是冠状病毒科的成员,并且很可能是鸡传染性支气管炎(IB)中以腺胃病变为主要特征的一种新的致病病型。 相似文献
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探明鸡传染性支气管炎病毒（Avian Infectious Bronchitis Virus,IBV）感染鸡胚肾细胞（Chicken Embry-o Kidney Cells,CEK cell）,并且实现其增殖为目的。将IBV稀释液注射到SPF鸡胚尿囊腔内,培养鸡胚扩繁,观察记录结果;并培养CEK细胞,采用100倍半数组织培养感染量的IBV进行染毒实验;应用Reed-Muench法计算半数鸡胚感染量为10-6.68/0.1 mL;用Real time PCR检测IBV在感染细胞中的含量,以确定IBV在CEKcells中已经感染且增殖成功。结果表明,接种10日龄的SPF鸡胚可以收集更多的、约8 mL的尿囊液毒;反复盲传至7代的IBV可使CEK cells产生明显的细胞病变效应;通过实时荧光定量PCR和RT-PCR检测,最终确定IBV-M41型扩繁成功并且能够在CEK细胞上繁殖,为下一步实验提供了参考。 相似文献
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甘鸡场鸡发生以呼吸道及肾病变为主的疾病经流行病学调查、病理剖检、病毒分离、电镜观察生物学特性及理化特性试验，血清中和试验，动物回归等确诊为肾型传染性支气管炎。采用分离毒鸡组织灭活苗结合Ａｕｓｔ－Ｔ株灭活油乳苗有效地防治了该病。 相似文献