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通过设计简并引物和TAIL-PCR的方法从Streptomyces fradiae var. k11中克隆得到一个β-l,4-甘露聚糖酶编码基因manS221,其全长1 359 bp,编码452个氨基酸,前端28个氨基酸为预测信号肽。构建表达载体pET-28a-manS221并转化大肠杆菌BL2l（DE3）,特异性表达manS221基因, 重组的甘露聚糖酶通过Ni-NTA亲和层析纯化。酶学性质分析表明,重组甘露聚糖酶最适温度为52℃,最适pH值为6.0,在pH 5.0~9.0的范围内有良好的稳定性,并且对中性蛋白酶具有高抗性。这些优良的性质使得ManS221在食品、饲料和纺织工业生产中具有良好的应用前景。 相似文献
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几丁质酶广泛存在于自然界的许多物种,并参与几丁质降解、蜕皮、免疫和致病性等诸多功能.采用同源克隆结合RACE-PCR的方法,首次从螨类中克隆到二斑叶螨几丁质酶基因(TuChi)的cDNA全长序列(GenBank登录号:JQ041366).TuChi全长1 822 bp,包含3'非翻译区(UTR)为150 bp和5'UTR为52 bp,开放阅读框(ORF)为1 620 bp,编码539个氨基酸.预测的相对分子量为60.7 ku,理论等电点为5.99.二斑叶螨几丁质酶具有几丁质酶典型的结构域,包括1个N-端信号肽序列、1个几丁质催化区域、1个几丁质结合域,以及连接催化区和结合域之间的连接区域.与其他物种几丁质酶进化树比较分析表明,TuChi与昆虫几丁质酶家族Group 1具有较高的同源性,推测其与二斑叶螨的蜕皮密切相关. 相似文献
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LI Jun HUANG Xiao-wei ZHANG Ke-qin 《浙江大学学报(农业与生命科学版)》2004,30(4):438-438
An extracellular protease from Clonostachys rosea (syn . Gliocladium roseum) was purified to SDS-PAGE homogeneity with 14-fold purification by ultrafiltration、ammonium sulfate precipetation、hydrophobic interaction chromatography and anion exchange chromatography. The molecular weight of the protease was 32 kDa as estimated by SDS-PAGE. The N-terminal sequence of first 10 amino acids was A-T-Q-S-N-A-P-W-G-L. This enzyme exhibited pH and temperature optima of 9-10 and 60 ℃, res… 相似文献
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从云斑天牛肠道中筛选到一株产植酸酶活性较高的假单胞菌Pseudomonas sp.TN06。采用简并PCR和TAIL-PCR的方法获得一个新的β-折叠桶植酸酶基因(phyA06),开放阅读框全长1 902 bp,编码633个氨基酸和1个终止密码子,预测其前23个氨基酸为信号肽,含有两个β-折叠桶结构域。将phyA06基因在大肠杆菌中表达,重组蛋白经镍柱纯化后达到电泳纯。纯化后的重组酶最适pH为7.0,在pH 6.0~10.0的条件下具有很好的稳定性;最适温度为55℃,热稳定性良好。同时,该酶在低温下仍保持一定活力,甚至0℃仍有活性。该植酸酶具有应用于水产饲料行业的潜在价值。 相似文献
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[目的]克隆自然生长于黑龙江省盐碱地的羊草ClassⅡ几丁质酶基因并进行序列分析,为进一步研究几丁质酶基因的生物功能和应用奠定了基础。[方法]构建羊草叶片的cDNA文库,对其进行DNA序列测定和分析,并与GenBank中收录的植物几丁质酶基因序列及编码的氨基酸序列进行同源性比较。[结果]在羊草叶片eDNA文库中克隆出1条全长eDNA片段,片段长996bp,其中,可读框768bp,编码255个氨基酸。编码产物在结构上缺乏CBD和C-端延伸区,具有ClassⅡ几丁质酶的结构特征,其氨基酸序列与黑麦和小麦ClassⅡ几丁质酶具有很高的同源性;构建的pQE—LcChi2重组载体经诱导后表达出一个约27KD的蛋白,与推测的pQE-LcChi2基因编码产物大小一致。[结论]LcHi2基因在大肠杆菌中能够表达,是一个具有表达功能的基因。 相似文献
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[目的]研究青霉(Penicillium glaucum)XGY36胞外产阿魏酸酯酶的纯化和酶学性质。[方法]菌株胞外产酶发酵液经硫酸铵沉淀、DEAE-cellulose DE52离子交换柱层析、Sephadex-G75分子筛层析进行纯化,得到纯度较高的酶蛋白,并对其酶学性质进行研究。[结果]从菌株发酵液中分离纯化到电泳纯的阿魏酸酯酶,纯化倍数6.54,酶活性回收59.7%。阿魏酸酯酶经SDS-PAGE获得1个条带,其表观分子量为36.5 ku。催化底物阿魏酸乙酯的最适反应温度为50℃,最适p H为5.0。阿魏酸酯酶在60℃以下和p H 3.0~7.0范围内稳定。金属离子Zn~(2+)、Mg~(2+)、Ca~(2+)对酶有明显的激活作用,而Pb~(2+)、Hg~(2+)和Ag+对阿魏酸酯酶有强烈的抑制作用,Na+、K+、Mn~(2+)、Cu~(2+)和Fe~(2+)对酶活的影响不大。[结论]青霉阿魏酸酯酶具有潜在的应用价值,适合应用于食品、医药及生物等领域。 相似文献
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羊草ClassⅡ几丁质酶基因的克隆及序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
1材料与方法
1．1植物材料采摘自然生长于黑龙江省安达市（119°28’E,44°1’N）盐碱地的羊草叶片,-70℃冰箱保存。1．2总RNA的分离与eDNA文库的构建用液氮研磨叶片后,用TRIZOL Reagent（GIBCO BRL）提取总RNA,使用PolyATtract mRNA Isolation Systems（Promega）提取mRNA。然后采用Stratagene提供的cDNA合成体系合成cDNA,体外包装和扩增,构建羊草叶片的cDNA文库。 相似文献
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重组枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的纯化和性质研究 总被引：1，自引：0，他引：1
研究嗜热枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及其重组酶的纯化和性质。该基因序列全长723bp,编码240个氨基酸。根据基因同源性分析,该壳聚糖酶与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的壳聚糖酶前体基因的同源性最高,为98%。粗酶液经Ni-IDA亲和层析得到电泳级纯酶,比活力高达1 051.8U/mg。经测定,该酶反应最适温度为45℃,最适pH为6.0,在40℃和pH 4.5～8.0下稳定。该酶为内切壳聚糖酶,能够高效降解壳聚糖,生成一系列的壳寡糖,在壳寡糖的制备生产方面具有广阔的应用前景。 相似文献
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漆酶广泛存在于土壤中,在有机农药残留和木质素的降解方面具有潜在的工业价值。从土壤宏基因组中得到了一个全长为1 389 bp漆酶基因lac13H9,编码462个氨基酸,预测理论分子量为50 k Da,含有一个17个氨基酸组成的信号肽,与NCBI蛋白数据库比对结果表明是一个新的漆酶基因。将lac13H9转入到大肠杆菌Transseta(DE3)中通过微好氧发酵进行异源表达,并通过Ni柱亲和层析纯化。获得的重组漆酶Lac13H9具有良好的酶学性质,其最适温度为40℃,最适p H为6.0,且具有较好的热稳定性,在50℃下保温90 min还有60%的剩余酶活力,同时发现低浓度的Fe2+促进漆酶酶活,高浓度则抑制酶活。良好的酶学性质为该酶的应用奠定了基础。 相似文献
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以角毛壳菌cDNA文库中获得的几丁质酶基因片段(GenBank Accn:DV546055)为基础,用反向PCR技术克隆出该基因的全长cDNA序列,命名为chi58。其开放阅读框(ORF)1602bp,编码533个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为58kD,理论等电点为4.47。序列分析表明,该基因由2个内含子和3个外显子组成。经BlastP分析,chi58基因的氨基酸序列的保守性不高,与其相似性最高的是球毛壳菌(Chaetomium globosum XM001230073),相似性为75%。表明该基因是一条新发现的几丁质酶家族基因。该序列已收录于GenBank,登录号为EF026977,DQ886936。 相似文献
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利用平板快速筛选法,从土壤中筛选到一株细菌BacillusSp.2108,其代谢物对几丁质酶具有较强的抑制活性。对其发酵液离心,用硫酸铵盐析后,经Sephadex G-25脱盐柱脱盐、DEAE Sephrose Fast F low阴离子交换柱层析和低压液相色谱Superdex G 75凝胶过滤层析等步骤进行分离纯化,最后通过SDS-PAGE检测,得到一条单带。纯品经SDS-PAGE,转膜,测序,及序列比对,初步判定此抑制物是一种中性蛋白酶。 相似文献
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从云南酸矿废水中获得了一株脂肪酶活性较高的嗜热真菌,经显微形态及转录间隔区（ITS）序列分析鉴定为新萨托菌,命名为Neosartorya fischeri P1。通过同源克隆,从该真菌中获得了脂肪酶基因Lip024,并在Escherichia coli BL21 (DE3) 和Pichia pastoris GS115 中进行表达,表达量分别为0.09 U/mL、0.26 U/mL。重组酵母菌株在3.7L发酵罐进行高密度发酵后,重组酶酶活达5.22 U/mL。重组蛋白经超滤浓缩和阴离子交换柱纯化后达到电泳纯。重组酶酶学性质分析表明：该酶的最适pH为7.0,在pH 3.0~7.0的范围内非常稳定,酶活力均保持在95%以上;最适温度为50℃,并具有一定的热稳定性。此外,Ca2+和Mg2+能够显著提高Lip024重组脂肪酶的酶活。 相似文献
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[目的]研究嗜热木聚糖酶的酶学性质.[方法]考察了基因工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-xynB64所产嗜热木聚糖酶反应的最适温度、最适pH,嗜热木聚糖酶的热稳定性、pH稳定性,以及不同金属离子对酶活力的影响.[结果]嗜热木聚糖酶的最适反应温度为110℃左右,最适pH为6.6,具有较广的pH稳定范围和非常好的热稳定性,高浓度的Mn2+、Mg2+、Ca2+对该酶有激活作用,Cu2+、Zn2+以及低浓度的Mn2+对该酶有抑制作用.[结论]研究可为嗜热木聚糖酶的广泛应用提供参考依据. 相似文献
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利用简并PCR和TAIL PCR从嗜热特异腐质霉Humicola insolens Y1中克隆得到一个新的耐热型木聚糖酶基因xynD。该基因全长1 104 bp, 共编码367个氨基酸，不含有内含子，N端的22个氨基酸为信号肽。成熟蛋白在毕赤酵母中进行了重组表达，重组蛋白经超滤和离子交换柱纯化后达到电泳纯。对其酶学性质分析表明，XynD的最适pH为6.0，在pH 4.0～7.0可以保持80%以上的酶活性，在pH 5.0～10.0具有良好的pH稳定性。最适作用温度为70℃，在60℃条件下保持稳定。多数金属离子对XynD酶活力没有明显的影响。麦芽汁降解实验表明，XynD与商用β 葡聚糖共同作用可以提高麦芽的过滤速率(45.7％)并降低粘度(81％)。因此XynD在酿酒业，特别是啤酒制造业具有潜在的应用价值。 相似文献
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葡萄糖氧化酶(GOX)已广泛应用于各种工业生产中。目前,除了曲霉和青霉属来源的GOX外,鲜有新型GOX被报道。经基因克隆和序列同源性分析,Cladosporium tianshanense SL19来源的葡萄糖氧化酶基因CtgoxB是一个新基因,该基因全长1 707 bp,无内含子,编码568个氨基酸,N-端第1～16个氨基酸为信号肽,与已报道的GOX序列最高一致性为35%。CtgoxB在毕赤酵母中实现异源表达,但重组蛋白CtGOXB未检测到GOX活性。通过序列和结构分析,同源重组构建的突变体CtGOXB-C1最终恢复了GOX活性。经SDS-PAGE鉴定,重组蛋白CtGOXB-C1表观分子量约为120 kDa,大于理论分子量(61.6 kDa)。经酶学性质测定,CtGOXB-C1比活为123.8 U/mg,在pH 8.0和30℃条件下具有最高的酶活,且在10℃时依然维持65%的酶活,具有嗜低温特性。CtGOXB-C1在pH 6.0～9.0条件下保温1 h后,剩余酶活维持在80%以上,可以在中碱性条件下维持较高酶活,并且对表面活性剂SDS具有较强的抗性。这些性质表明CtGOXB-C1在水产饲料和洗涤剂等行业中具有良好的应用潜力。 相似文献
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枇杷果肉过氧化物酶的分离纯化及其性质研究 总被引：2，自引：0，他引：2
枇杷果肉制成丙酮粉,通过硫酸铵沉淀分级分离、透析、DEAE-纤维素离子交换柱层析纯化,获得两个酶活力峰,第二活力峰的酶制剂经过PAGE和SDS-PAGE电泳获得单一纯的过氧化物酶(PODⅡ),纯酶比活力为710.5U/mg。酶亚基分子量为22.6kDa,等电点pI为3.6。酶的动力学研究表明:酶的最适pH为5.0,在pH2.6～10区域较稳定;酶最适温度是35℃,对热敏感,高于45℃以上酶的稳定性差。酶对愈创木酚和H2O2的表观Km值分别为20.58和12.04mmol/L,以愈创木酚为底物时,酶比活力最大,其次是苯酚、邻苯二酚、对苯二酚和间苯二酚,酶未能催化以焦性没食子酸为底物的氧化反应。Al3+、Mn2+、Zn2+和Hg2+对酶有抑制作用,Mg2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Ba2+和Pb2+对酶有激活作用;半胱氨酸等12种化合物对酶活力均有不同程度的抑制作用,在防止或减轻枇杷采后的酶促褐变中将起到重要的作用。 相似文献
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短小芽孢杆菌XZG33耐高温酸性β-甘露聚糖酶酶学性质研究 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]从短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）XZG33发酵液中分离纯化甘露聚糖酶,并对其酶学性质进行研究。[方法]利用硫酸铵分级盐析、DEAE-cellulose DE52阴离子交换层析和Sephadex G-100分子筛凝胶过滤层析等方法,分离纯化到了均一的蛋白酶,酶纯度提高了39.7倍,回收率20.2%。通过SDS-PAGE电泳和SephadexG-75分子筛凝胶电泳测得酶蛋白分子量是40.0 kDa,为单亚基蛋白。酶最适作用pH值5.0,最适作用温度60℃,在pH值2.0～8.0范围内酶活性及稳定性较高。在80℃以下保温1 h,残余酶活还在80.0%以上。二价金属离子Mg2＋、Ca2＋、Co2＋及Mn2＋对酶有明显激活作用。酶对槐豆胶有强的底物水解特异性,而对淀粉、羧甲基纤维素钠以及桦树木聚糖水解活性极低。在最适作用条件下,以槐豆胶为底物测定Km为4.6 mg/ml。[结论]鉴于短小芽孢杆菌XZG33甘露聚糖酶具有以上优良的酶特性,它在食品原料及功能性低聚糖的开发方面有着潜在的应用价值。 相似文献
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一种来源于Bispora betulina的酸性木聚糖酶基因克隆及其酶学性质研究 总被引：1，自引：1，他引：1
利用简并PCR和TAIL-PCR技术从嗜酸性真菌Bispora betulina中克隆得到一个酸性木聚糖酶基因xyn11BB。该基因全长1 207 bp,含有三段内含子、一段外显子和一个终止密码子,编码由297个氨基酸组成的蛋白质,推测蛋白质含有一个CBM1结构域。将不带原基因信号肽编码序列的cDNA基因以正确阅读框架克隆到表达载体pPIC9上,并在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中诱导表达,其表达活性达121.15 U/mL。重组蛋白经硫酸铵分级沉淀和阴离子交换柱纯化后达到电泳纯。对其酶学性质分析表明,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH为4.5,在酸性条件下具有良好的活性和稳定性,可作为饲料用酶的备选。 相似文献