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1.
为了探究PEDV(猪流行性腹泻病毒)流行毒株SHpd/2012侵染细胞的特性,研究采用IFA(间接免疫荧光)及绘制病毒一步生长曲线等方法,对感染PEDVSHpd/2012株后的Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)病变过程进行研究。结果发现,CPE(细胞病变)主要表现为细胞肿胀、变圆、皱缩、聚集成合胞体甚至从培养瓶壁大量脱落。IFA结果显示,接毒后12h病毒开始增殖,在接毒后36h时感染细胞数量最多,其后病毒增殖速度逐步下降,60h时趋于平稳。病毒一步生长曲线结果显示,SHpd/2012株感染细胞后24~60h的毒价一直处于较高水平,60h后开始下降。此外,本研究成功克隆并真核表达了PEDV S蛋白,为研究PEDV与受体蛋白的互作及病毒的致病机制奠定基础。 相似文献
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猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种可致仔猪严重腹泻的高度接触性肠道传染病。S蛋白在病毒感染和入侵宿主细胞的过程中具有重要作用。为了研究S蛋白的特点,本研究扩增了PEDV新流行毒株SHpd/2012的纤突蛋白S基因分段片段S11、S12、S13、S21和S22,将得到的目的片段导入原核表达载体pGEX-6P-1中,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达、鉴定,获得了正确的PEDV S的分段蛋白S11(24-277aa)、S12(272-571aa)、S13(560-797aa)、S21(793-1109aa)及S22(1102-1384aa),为后续单克隆抗体的制备和致病机制的研究奠定了基础。 相似文献
3.
应用生物信息工具和分子克隆技术对PEDV SHpd/2012株Nsp8基因编码的蛋白进行了结构和功能分析以及体外表达。结果显示,NSP8蛋白是一个含有194个氨基酸的亲水性蛋白,不含信号肽和跨膜区。SHpd/2012毒株高度保守的NSP8氨基酸序列与CV777、AJ1102等毒株同源性高。NSP8蛋白也是一个单体蛋白,共有5个优势抗原表位。此外,本研究成功地在293T细胞内表达了NSP8蛋白,为进一步研究猪流行性腹泻病毒NSP8蛋白的功能提供了理论基础。 相似文献
4.
从湖北地区规模化养殖场疑似腹泻病料中成功检测并分离获得了一株猪流行性腹泻病毒,分离毒株感染Vero细胞可引起明显的细胞病变,病毒效价达1.0×105.6TCID50/0.1 mL。间接免疫荧光结果显示HB201602感染细胞后,能被抗PEDV S蛋白的特异性单克隆抗体所识别,进一步证实所分离毒株为PEDV病毒。基于S1基因构建了系统发育树,表明2011年后分离的毒株大多以G2型变异毒株为主,HB201602属于G2-a亚型(变异毒株)簇。S1基因遗传变异分析发现G1-b亚型毒株与其他簇毒株相比存在9个特异的氨基酸突变,G1-a亚型经典毒株存在4个特异的氨基酸突变,S1基因的变异分析将有助于了解PEDV的遗传变异趋势,为新型疫苗的研发提供依据。 相似文献
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【目的】明确猪流行性腹泻病毒（PEDV）变异株的遗传进化关系及变异株各亚型间的抗原性差异位点,为PEDV新型疫苗及诊断试剂盒的研发打下基础。【方法】将采集的3份PEDV阳性仔猪肠道组织样品接种至非洲绿猴肾细胞（Vero）上进行PEDV分离,分别采用间接免疫荧光试验（IFA）、 Western blotting、 RT-PCR和电镜观察进行鉴定,通过TCID50测定病毒滴度及绘制病毒体外增殖动态曲线;将分离毒株基因组分成33段进行RT-PCR扩增,使用Lasergene中的SeqMan拼接序列,然后以MEGA 7.0进行遗传进化分析,并以Protean中的Jameson-Wolf算法进行抗原性分析。【结果】其中1份PEDV阳性仔猪肠道组织样品在Vero细胞上盲传至第6代时出现典型的细胞病变,将其命名为CH-HK-2021毒株; IFA和Western blotting鉴定结果表明CH-HK-2021毒株能与小鼠抗PEDV N蛋白单克隆抗体发生特异性反应,且RT-PCR能扩增获得预期的目的条带,证实分离毒株即为PEDV。CH-HK-2021毒株的直径在80~120 nm,且病毒粒子表面带有刺突样的形状,属于冠状病毒;其在Vero细胞上能稳定传代,目前已传至100代。CH-HK-2021毒株在感染Vero细胞24 h后,其病毒滴度达最高值,为105.6 TCID50/mL。CH-HK-2021毒株全基因组除去poly （A）尾结构为28034 bp,与PEDV参考株在全基因组水平上的核苷酸序列相似性为96.0%~98.9%,与参考毒株S基因核苷酸序列的相似性为93.1%~99.0%,其中与变异株CH/JX/01（KX058031）的核苷酸序列相似性最高,与经典毒株AVCT12（LC053455）的核苷酸序列相似性最低。CH-HK-2021毒株属于G2a变异株,为我国当前的流行毒株。G2a毒株与G2b变异株在S基因上存在42个核苷酸差异位点,在S蛋白上则存在6处抗原性差异位点,且主要的差异位点位于S2亚基上。【结论】分离获得的CH-HK-2021毒株属于PEDV G2a变异株,为我国当前的流行毒株,与PEDV经典毒株的亲缘关系相对较远。G2a毒株和G2b变异株在S2亚基上存在多处抗原性差异位点,故推测S2亚基是导致G2a毒株与G2b变异株抗原性差异的主要原因。 相似文献
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【目的】在昆虫细胞中表达猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S1-NTD蛋白,研究其免疫原性,为基于PEDV S蛋白的基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础。【方法】PCR扩增PEDV S1-NTD基因,构建其重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD和重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD。将Ac-PEDV S1-NTD转染sf9昆虫细胞,利用昆虫杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD。将P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,Western blot鉴定重组蛋白的表达,空斑试验测定重组杆状病毒的滴度。在此基础上,分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.1,1和3的P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,并在感染后1,2,3,4和5 d收集细胞,通过Western blot和空斑试验分别检测目的蛋白的表达量和重组杆状病毒的增殖情况。将MOI为0.1的P3代重组杆状病毒皮下注射免疫BALB/c小鼠,每隔2周免疫1次,共免疫3次,以注射PBS、空载体Bacmid和PEDV商业疫苗为对照组,于首免后不同时间采集血液分离其血清,ELISA法检测血清中PEDV特异性抗体的水平;于首免后35 d剖取小鼠脾脏,分离其淋巴细胞;PEDV刺激后,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖情况。【结果】PCR扩增获得了约738 bp的PEDV S1-NTD基因;成功构建了重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD、重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD和重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD。利用杆状病毒表达系统在sf9细胞内成功表达了重组PEDV S1-NTD蛋白,且杆状病毒以MOI为1感染sf 9细胞后在第3天蛋白表达量达到最高。在首免后35 d,重组杆状病毒免疫组小鼠血清效价达到最高值,为1∶5 000,与商业疫苗组效价一致;淋巴细胞增殖试验表明,重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD免疫组小鼠脾淋巴细胞对PEDV的刺激也发生了显著增殖(P0.05),而PBS和空载体Bacmid对照组淋巴细胞未发生明显增殖(P0.05)。【结论】成功构建了重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD,在昆虫细胞中成功表达了PEDV S1-NTD蛋白,且具有较好的免疫原性。 相似文献
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《南京农业大学学报》2021,44(3)
[目的]本试验旨在研究猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)流行毒株JS2013诱导Vero细胞凋亡的相关机制。[方法]用添加5μg·mL~(-1)胰酶的Vero细胞成功扩增PEDV JS2013毒株后,采用倒置显微镜、间接免疫荧光、流式细胞术、Hoechst染色、细胞活性计数(CCK-8)以及Western blot等方法,检测Vero细胞感染JS2013后产生的病变、凋亡细胞比例、细胞活性、凋亡相关蛋白的表达等。[结果]PEDV JS2013感染Vero细胞后6 h即有少量病毒进入细胞,24 h后出现典型合胞体病变,PEDV JS2013诱导Vero细胞凋亡呈剂量依赖性,并且显著抑制Vero细胞活性。Hoechst染色后可以观察到明显的凋亡小体。Western blot结果表明,感染PEDV JS2013 48 h后激活Caspase 8和Caspase 9,60 h左右激活Caspase 3。[结论]PEDV流行毒株JS2013可以诱导Vero细胞凋亡。 相似文献
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【目的】制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)CH-HeB14毒株S1蛋白的多克隆抗体,为PEDV新流行毒株诊断试剂盒和疫苗研制提供基础材料。【方法】利用RT-PCR扩增PEDV CH-HeB14毒株S1基因,对序列特征进行生物信息学分析,用PCR将S1基因截成不同片段(S1A、S1B、S1C、S1C-1和S1C-2),分别克隆至原核表达载体pET28a,转化BL21(DE3)构建重组表达菌株;用IPTG诱导重组蛋白表达,并进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。将表达蛋白与佐剂乳化制备免疫原免疫兔多克隆抗体,Western blotting和免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测抗体的免疫活性。【结果】PEDVS1、S1A、S1B、S1C、S1C-1和S1C-2片段长度依次为2 079,600,600,878,549和447bp。系统进化树表明,CH-HeB14株与2010年以来的22个新流行毒株亲缘关系较近,而与经典疫苗株CV777、attenuated DR13亲缘关系较远。成功截短表达了S1蛋白不同区段S1A、S1B和S1C-1重组蛋白(rS1A、rS1B和rS1C-1),且蛋白均以包涵体形式表达。制备了抗rS1A、rS1B和rS1C-1蛋白的多克隆抗体,其与这3种蛋白反应良好,且抗rS1A重组蛋白的多克隆抗体Western blotting效价为1∶32 000;IPMA结果显示,该抗体能与PEDV CHHeB14毒株和经典疫苗毒株attenuated DR13均发生特异性反应。【结论】成功克隆、表达了变异毒株PEDV CHHeB14的S1基因,所制备的S1蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性。 相似文献
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为了评估猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1蛋白的免疫原性,利用果蝇胚胎S2细胞表达重组S1蛋白,将纯化的S1蛋白免疫4周龄昆明小鼠,收集免疫血清及脾淋巴细胞,通过ELISA、病毒中和试验和流式细胞术等方法分析表达的重组S1蛋白的免疫原性。结果显示,与对照组(PBS)相比,重组PEDV S1蛋白免疫组小鼠血清中特异性IgG抗体水平显著提升;二免后14 d,果蝇细胞重组PEDV S1蛋白免疫组小鼠的中和抗体效价达到1∶320;免疫后小鼠脾脏淋巴细胞具有更强的增殖能力;外周血CD3+T细胞百分比显著增加,CD4+/CD8+T细胞比值高于对照组;小鼠血清中IL-4、IFN-γ水平显著上升。综上,成功表达了重组PEDV S1蛋白,其可以诱导小鼠产生高效价的中和抗体,促进细胞免疫应答。 相似文献
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为了观察与猪流行性腹泻病毒(PEDV) NSP12互作蛋白乳酸脱氢酶B (LDHB)的体外表达情况和小RNA干扰效果,构建了真核表达载体pcDNA4.0-LDHB-3*Flag,并在Vero细胞中过表达LDHB,发现在37 kDa处有大小相符的明显条带。设计的2条小干扰RNA能降低LLC-PK1细胞中LDHB的mRNA和蛋白质水平,经one-way ANOVA检验证明干扰实验组2~(-ΔΔct)的平均值显著低于对照组(P0.05)。该结果为研究LDHB在PEDV感染LLC-PK1和Vero细胞过程中的作用提供了基础数据。 相似文献
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《东北农业大学学报(英文版)》2019,26(4)
Porcine epidemic diarrhea(PED) is caused by porcine epidemic diarrhea virus(PEDV), and is characterized by vomiting, diarrhea and dehydration of suckling pigs from 80% to 100% morbidity and 50% to 90% mortality, and resulted in tremendous economic losses to swine industry.The PEDV mainly infects small intestine of pigs, resulting in vacuolar degeneration and necrosis of mucosal epithelium.The IPEC-J2 is a pig intestine epithelial cell line, which is similar to the intestinal environment of piglets, can be used to isolate and identify the PEDV field isolates.In this study, it appeared the PEDV typical postmortem changes and histopathological lesion of degeneration and destruction of small intestine in infected piglets, and IHC identified that the PEDV distributed in the mucosa and submucosa of small intestine mostly.Furthermore, the PEDV HLJ strain was successfully isolated and characterized in the IPEC-J2 cells, and indicated that the IPEC-J2 cell line was sensitive to isolate and adapt the PEDV field strain, and could be utilized to multiply the PEDV rapidly.The S gene analysis indicated that the PEDV HLJ strain was the prevailed virus, belonged to Group 1 with attenuated virulent DR13, SC1402 and J-S2/2015 strains isolated in South Korea and China from 2014 to 2015.This study had important theoretical and practical significances on analyzing genetic variation of the PEDV, understanding the pathogenic characteristics of the virus and developing new vaccines for the PED. 相似文献
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2010年以来,全国大部分地区暴发新生仔猪严重流行性腹泻,给养猪业造成巨大经济损失。为分析猪流行性腹泻病毒(PEDV)在浙江省的流行和遗传变异情况,对2010—2013年收集的临床腹泻样品,以针对PEDV S基因N端序列的RT PCR检测病原,并测序其中的41份样品的扩增序列,分析PEDV S1基因型变异情况。临床检测结果表明： PEDV临床检出率由2010年的4286%提高到2013年的70%以上,并且浙江省各地的检出率都在50%以上;一年中7至8月份检出率明显降低。 PEDV S1基因N端序列分析结果表明,临床检测株的S1基因与传统毒株PEDV CV777的S基因序列及中国最早检测到的基因序列亲缘关系较远,可能浙江省PEDV的流行株可能属于一个新的基因型。同时研究结果提示PEDV S基因的变异可能是现有CV777毒株疫苗免疫保护力不佳的原因。 相似文献
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上海地区新发猪流行性腹泻病毒的鉴定及分析 总被引：2，自引：2，他引：0
目前,仔猪腹泻病严重危害我国生猪养殖业,利用核酸分析技术我们对今春导致上海地区多个猪场仔猪腹泻病的病原体进行了鉴定,结果显示,猪腹泻病病毒(PEDV)是致病元凶.在此基础上,我们利用PEDV特异性引物,克隆了上海地区流行毒株的结构蛋白基因S、N和M,并根据保护性抗原S1基因序列比对,分析了此病毒株与其他相关毒株的亲缘关系.结果表明,上海地区PEDV流行株与2010年来我国各地发生的多数猪腹泻病毒亲缘关系接近,而与传统病毒株如CV777和周边日本和韩国近年来流行的毒株存在一定的差异.另一方面,分析还表明,近年来我国不同地区流行的PEDV存在着异质性,亲缘关系存在差异.通过这些分析,提示当前急需研制新的疫苗尤其是减毒活疫苗对PEDV予以预防. 相似文献
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对引起仔猪严重腹泻的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)进行RT-PCR检测,并对PEDV部分基因进行克隆和序列分析。从陕西省某发生严重仔猪腹泻的养猪场采集肠道内容物,利用RT-PCR技术成功检测到PEDV感染。克隆检测到的PEDV M、N和E基因片段,并将该基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其他不同来源的PEDV毒株进行比较分析。结果表明,克隆的M、N和E基因与其他已经发表的PEDV毒株核苷酸的同源性分别为96.3%～99.9%、95.2%～99.5%和96.1%～96.9%,氨基酸同源性分别为95.6%～99.6%、96.1%～99.5%和96.1%～98.7%;系统进化树结果表明,试验检测的PEDV与国内分离株的PEDV株亲缘关系更近。可见:陕西省养殖场存在猪流行性腹泻病毒感染,其M、N和E基因变异不大。 相似文献
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从患猪流行性腹泻的病猪粪便中分离了猪流行性腹泻病毒(PEDV)命名为HLJBY,将病毒在Vero细胞上传代,使之适应生长。将扩增的猪流行性腹泻病毒的N基因克隆到原核表达载体PET30a上,构建了重组表达质粒PET-30a-PEDV-N,并在37℃的条件下诱导表达,通过不同时间取样,经SDS-PAGE分析结果表明,该蛋白... 相似文献
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[目的]了解引起仔猪腹泻的猪流行性腹泻病毒是否为变异株.[方法]从疑似猪流行性腹泻病毒感染的猪场采集死亡仔猪的肠黏膜及其内容物,将病料常规处理后接种VERO细胞,采用维持培养液加10 μg/mL的胰酶的方法分离培养.用RT-PCR、间接免疫荧光、动物回归实验以及部分序列分析等方法对分离株进行鉴定.[结果]病料在接入细胞第一代即出现病变,细胞肿胀变圆,形成合胞体,逐渐脱落,细胞病变明显.随着病毒传代次数的增加,细胞病变逐渐稳定,进行RT-PCR检测、间接免疫荧光检测以及动物回归实验,最终确定分离株符合PEDV特征,并命名为BJ2015,测定毒株的TCID50为10-6.4/0.1 mL.基因测序结果显示,N基因长1 329 bp,编码442个氨基酸.与参考株N基因核苷酸序列比对及遗传进化分析表明,BJ2015与传统株CV777亲缘关系较远;与流行变异株BJ-2011-1N基因在进化树的同一个分支上,二者的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.6％、99.5％,表明BJ2015与BJ-2011-1亲缘关系较近.[结论]结果表明BJ2015为PEDV流行性变异毒株. 相似文献
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【目的】猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种对养猪业造成巨大损失的高致死率的传染性疫病。CRISPR/Cas13b系统精准切割和编辑RNA的功能提供了一种靶向抑制RNA病毒的策略。本研究尝试利用CRISPR/Cas13b的RNA干扰功能对PEDV的基因组RNA进行切割,以探索一种新型的PEDV病毒抑制策略。【方法】设计了4对靶向PEDV基因组不同区域的CRISPR RNA(crRNA)位点,构建了CRISPR/Cas13b打靶载体,以打靶载体转染Vero细胞,并利用PEDV感染转染细胞,检测PEDV在CRISPR/Cas13b转染细胞内的增殖情况。【结果】CRISPR/Cas13b系统对PEDV在Vero细胞的增殖具有明显的抑制作用。打靶载体U6-crRNA3和U6-crRNA4转染组相较于正常细胞组,病毒免疫荧光试验中荧光团明显减少;定量PCR结果显示,打靶载体转染组在细胞水平抑制50%以上病毒增殖量。【结论】本研究构建的CRISPR/Cas13b系统能有效抑制PEDV增殖,为开发有效的RNA病毒防控手段、建立抗病动物模型提供了新的研究策略。 相似文献