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1.
间接ELISA检测牛分枝杆菌抗体方法的建立及初步应用 总被引：6，自引：0，他引：6
针对现行牛结核病检疫方法结核菌素皮内变态反应(TST)的不足,本研究选用牛分枝杆菌特异性抗原MPB83、MPB70及CFP10与ESAT-6融合蛋白(CFP10-ESAT-6)分别建立了检测牛分枝杆菌特异抗体的间接酶联免疫吸附方法(ELISA)。上述3种抗原中一种以上抗原的特异性抗体为阳性时,即可判断为结核检测阳性。以TST为标准,判断ELISA方法的敏感性与特异性。结果证明,ELISA方法具有较好的敏感性(71.4%)。对ELISA检测为强阳性的奶牛进行细菌分离,并对5头结核菌分离阳性奶牛进行TST检测,结果有3头为TST阳性,2头可疑,显示出ELISA方法对严重感染牛的检测较TST具有更高的敏感性。由于TST与ELISA分别以细胞免疫与体液免疫为基础,两种检测方法结合应用可进一步提高牛结核病的检出率。 相似文献
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为寻找最适合牛结核病污染场的检测方法,加快牛结核病净化,采用牛结核菌素(PPD)皮内变态反应试验(TST)、比较皮内变态反应试验(SICTT)、牛结核病ELISA-γ-干扰素试验(IFN-γ-ELISA)、牛结核病抗体ELISA试验4种方法,对某结核病污染牛场300头奶牛进行检测,并以TST为参考标准,对不同检测方法的检测结果进行对比分析。结果显示,这4种方法中,IFN-γ-ELISA的阳性检出率最高,与TST相比,差异显著(P0.05),而其他方法的阳性检出率均低于TST。结果表明,IFN-γ-ELISA方法的检测敏感性较高,在牛结核病污染场净化初期使用,可以尽量避免阳性牛漏检,从而加快牛结核病净化进程。 相似文献
3.
为筛选及评价用于牛结核病诊断的抗原,本试验将CFP-10、ESAT-6、TB10.4、TB27.4、MPT51、MPT63、MPT64、MPB70、MPB83、Rv3872和Ag85B共11种牛分枝杆菌抗原分别作为包被抗原建立间接ELISA方法,比较其对牛结核病的检出率;同时利用豚鼠和牛的皮试试验评价重组蛋白作为皮试试验刺激原的潜力。此外,将重组蛋白分别刺激结核病阳性牛和阴性牛的抗凝血24 h,检测血浆中的IFN-γ水平,评价各重组蛋白作为IFN-γ释放试验刺激原的潜力。结果显示,不同重组蛋白对结核病阳性血清的反应活性不一,MPB70总检出率最高,为59.7%;其次是Ag85B、ESAT-6和MPB83,检出率均在45%以上;MPT51的检出率最低,仅为2.2%。豚鼠和牛皮试试验均显示,单个重组蛋白作为刺激原难以产生令人满意的迟发型过敏反应（delayed type hypersensitivity,DTH）,而TB10.4、TB27.4、MPT64、MPT63或Rv3872作为补充抗原,分别与CFP-10或ESAT-6混合,均可特异性地刺激结核病阳性牛产生较强的DTH反应,且与PPD-B无显著差异（P>0.05）。重组蛋白CFP-10、ESAT-6、TB10.4和MPT51均能刺激结核病牛全血释放一定的IFN-γ,其中CFP-10、CFP-10-ESAT-6串联蛋白和MPT51刺激结核病阳性牛全血释放的IFN-γ显著高于阴性牛（P<0.05）。因此,这11种牛分枝杆菌抗原并不适合单独用于牛结核病的血清学诊断、皮试试验或IFN-γ释放试验,但以CFP-10和ESAT-6为核心,TB10.4、TB27.4、MPT64、MPT63、Rv3872或MPT51作为其补充抗原,均能提高检测敏感性,有作为皮试试验和IFN-γ释放试验特异性刺激原用于牛结核病诊断的潜力。 相似文献
4.
《中国兽医学报》2016,(9):1531-1536
以原核表达后经纯化的重组牛朊蛋白为免疫原,免疫prnp-/-基因敲除鼠。4次免疫后,利用淋巴细胞杂交瘤技术,取脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。间接ELISA方法筛选出阳性杂交瘤细胞,采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行3次克隆,用间接ELISA筛选出了稳定分泌针对牛重组朊蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为5C9D6。Western blotting鉴定结果表明,5C9D6均能特异性识别重组牛朊蛋白、健康牛、BALB/c脑组织匀浆中的PrPc,不识别prnp-/-基因敲除鼠脑组织匀浆液。本试验制备了可与牛、BALB/c鼠反应的单克隆抗体,同时也为牛海绵状脑病的研究及其诊断方法的建立奠定了基础。 相似文献
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IBRV gD蛋白的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
《中国兽医学报》2019,(11):2129-2134
利用生物学软件分析牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gD蛋白的抗原决定簇,发现相应的核酸序列,设计特异性引物用PCR扩增IBRV gD基因片段并克隆到原核表达载体pET-32a中,通过双酶切鉴定正确和测序正确后进行诱导表达。利用间接ELISA方法和Western blot鉴定gD重组蛋白的免疫原性和反应原性。最后将gD重组蛋白用作包被抗原,并通过优化相应的反应条件建立检测IBRV抗体的间接ELISA方法。结果显示,表达的gD重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,间接ELISA阴阳性临界值为:D_(450 nm)值=0.23。重组抗原gD与口蹄疫、牛病毒性腹泻、赤羽病、副结核病、布鲁菌病、结核病等阳性血清无交叉反应,具有比较好的特异性。组内和组间变异系数均小于5%,重复性较好。建立的ELISA方法结果显示,当测试相同的200个临床血清样本时,与IDEXX牛传染性鼻气管炎病毒gB X3抗体检测试剂盒相比,两者符合率为96%。本试验为IBRV抗体间接ELISA检测试剂盒的开发奠定了基础。 相似文献
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牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立和应用 总被引：10，自引：0，他引：10
为了建立一种快速检测牛分支杆菌抗体的新方法用于诊断牛结核病,利用胶体金免疫层析技术原理,用原核诱导表达的牛分支杆菌抗原蛋白MPB83和MPB70分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗原,制备牛结核抗体检测试纸条.结果表明,粒径为40 nm的胶体金制备的试纸条敏感性最高,胶体金最佳标记pH为6.0,MPB83抗原最适标记量为每毫升胶体金6.5 μg,MPB70抗原的最适包被浓度为3.0 mg/mL,抗MPB83蛋白IgG的最佳包被浓度为2.5 mg/mL,交叉试验证明试纸条不与牛的其他非相关疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性.比较试验证明其敏感性显著高于韩国进口试纸条.在上述试验条件下生产了一批胶体金试纸条进行临床样品检测,并与细菌分离培养、结核菌素皮内变态反应(TST)和韩国试纸条比较.本试纸条与牛分支杆菌分离培养的符合率为85%,与TST的符合率为79.73%,与韩国试纸条的符合率为98.75%.快速检测牛结核抗体的免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,适用于对牛结核病进行普查和检疫,也可作为TST的辅助诊断方法,在牛结核病根除计划中具有良好的应用前景. 相似文献
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四种牛分枝杆菌特异性蛋白融合表达及在牛结核病诊断中的临床应用 总被引：2，自引：0，他引：2
以原核表达的MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6融合蛋白作为诊断抗原,建立牛结核病抗体检测间接ELISA(iELISA)。该iELISA与导致常见牛病的非相关抗原无交叉反应。用iELISA检测90份健康牛血清,确定样本阴阳性临界值(S/P)为0.17。与商品化胶体金试剂条(ICG)平行检测150份临床奶牛血清样本,结果与ICG的符合率为93.33%(140/150)。以结核菌素皮内试验(TST)为参考方法,检测了华中地区四个奶牛场的560头中国荷斯坦奶牛和90份进口奶牛结核阴性血清,结果iELISA与TST的总符合率为87.32%(489/560)。对其中22头奶牛进行鼻拭子分菌检验,4头分菌阳性奶牛的血清抗体检测也为阳性,iELISA与细菌培养的总符合率为77.27%(17/22)。以TST为参考方法,iELISA的敏感性和特异性分别为72.37%和89.67%。 相似文献
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从牛布鲁菌基因组中克隆出VirB12基因,以pET-28α(+)为模板构建VirB12原核表达载体pET-V12,pET-V12在E.coli BL21(DE3)中表达重组VirB12蛋白.经Western-blotting分析,表明重组的VirB12蛋白具有免疫原性.以纯化的VirB12蛋白为抗原,建立了间接ELISA检测牛布鲁菌抗体的方法.经对300份牛血清样品间接ELISA与虎红平板试验(RBPT)检测结果的比较,该方法的敏感性为89％,特异性为98.3％,准确度为92.7％. 相似文献
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以原核表达的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组gD蛋白作为包被抗原,建立检测IBRV抗体的间接ELISA方法.构建pET30a-gD重组质粒,在大肠杆菌中表达IBRV重组gD蛋白,Western-blot检测该重组蛋白具有良好的免疫活性.通过方阵试验确定了抗原的最适包被浓度为2.5 μg/mL,血清最佳稀释倍数为1:200,酶标二抗最佳稀释倍数为1:5 000,与病毒中和试验,全病毒ELISA方法的检测结果符合率分别为87.5%、92.5%.用该法对黑龙江部分地区采集到的863份牛血清样品进行检测,结果阳性率为82.27%.本试验建立的间接ELISA方法可用于IBR的检测和流行病学调查. 相似文献
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LI Ming JIA Hong XIN Ting GUO Xiao-yu YUAN Wei-feng HOU Shao-hua HOU Qiang GAO Xin-tao WU Jing DONG Rui-kai YANG Hong-jun LIU Lai-xing ZHU Hong-fei 《中国畜牧兽医》2015,42(10):2544-2550
To explore the value of Mb1230 protein of Mycobacterium bovis in the diagnosis of bovine tuberculosis,we obtained the Mb1230 gene by PCR and constructed recombinant plasmid pET-22b-Mb1230.Recombinant Mb1230 protein was obtained by IPTG induction and purified by affinity chromatography.The activity of the recombinant protein was evaluated by TST test,IGRA test and indirect ELISA.The size of the recombinant protein matched with the theoretical value proved by SDS-PAGE;Western blotting result showed that the recombinant protein could react with mouse anti-His antibody,and had specific band;The results of TST test,IGRA test and indirect ELISA test also showed the recombinant protein had antigenic activity.The results indicated the recombinant protein Mb1230 had good B cell and T cell activity,so,it had the potential application in the diagnosis of bovine tuberculosis. 相似文献
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【目的】 建立基于绵羊肺炎支原体表面脂蛋白P60的间接ELISA方法。【方法】 利用生物信息学软件对P60蛋白进行抗原性分析,筛选出抗原性最佳的区域,扩增目的基因后构建重组表达载体并进行基因测序,将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导抗原性最佳蛋白表达并进行诱导时间优化;利用SDS-PAGE分析该蛋白分子质量大小及其表达形式。以重组蛋白作为抗原,绵羊肺炎支原体阳性血清作为抗体,通过Western blotting方法分析其反应原性。以重组蛋白为包被抗原,建立抗原性最佳蛋白的间接ELISA抗体检测方法,用该方法对20份阴性血清进行检测,计算阴阳临界值;检测该方法的特异性、敏感性和重复性,并用建立的间接ELISA方法与间接血凝法对92份绵羊临床血清样本进行检测。【结果】 经DNAStar分析,P60蛋白第58－928位氨基酸区域的平均抗原指数在0.8~1.7之间,亲水指数为0~2.0,证明该区域(P6058aa-928aa)抗原性和亲水性较强;通过PCR扩增得到P6058aa-928aa基因,并构建重组表达载体,通过基因测序证明该重组表达载体与预期结果一致。SDS-PAGE结果显示,IPTG诱导浓度为1 mmol/L,诱导10 h时蛋白表达量较高,蛋白分子质量为42 ku,在大肠杆菌中以包涵体的形式表达;Western blotting结果表明,构建的重组蛋白具有良好的反应原性。对ELISA各条件进行优化结果显示:抗原包被浓度为0.5 μg/mL,一抗最佳稀释浓度为1∶100,最佳孵育时间为1.5 h,酶标二抗最佳稀释倍数为1∶4 000,判定阴阳性血清的临界值为0.36。对口蹄疫病毒(FMDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、布氏杆菌(Brucella)、牛支原体(Mb)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)的标准阳性血清的检测均为阴性,证明该方法特异性较强;敏感性试验结果表明,血清稀释度为1∶2 048时仍为阳性;批内重复试验和批间重复试验的变异系数均<10%,证明该方法具有较好的重复性。利用所建立的间接ELISA方法与间接血凝法对92份羊血清检测结果表明,二者的阳性符合率为81.6%,阴性符合率为92.6%,总符合率为88.0%。【结论】 本研究建立的间接ELISA方法可用于临床样本的检测,为绵羊肺炎支原体的疫苗免疫效果评价和疾病诊断提供了较为可靠的方法。 相似文献
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[目的] 建立基于丝状支原体山羊亚种（Mmc）膜脂蛋白LPPA的间接ELISA方法。[方法] 扩增Mmc LPPA基因并将其克隆至pCold-Ⅰ载体,构建重组质粒pCold-Ⅰ-LPPA,测序鉴定正确后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经IPTG诱导表达后纯化得到Mmc LPPA重组蛋白,采用SDS-PAGE验证该重组蛋白是否表达,并采用Western blotting和传统经典的琼脂扩散血清学试验分析其与Mmc阳性血清的反应原性。以该重组蛋白为包被抗原,建立Mmc重组LPPA蛋白的间接ELISA抗体检测方法,对该方法进行反应条件优化后开展特异性、重复性试验,并将其初步应用于184份山羊血清样本。[结果] 通过PCR扩增得到Mmc LPPA基因,成功构建了重组质粒pCold-Ⅰ-LPPA,经诱导表达后得到Mmc LPPA重组蛋白,SDS-PAGE结果显示,获得了大小约23 ku的LPPA重组融合蛋白;琼脂扩散及Western blotting试验证明该蛋白反应原性良好。ELISA方法反应条件优化结果显示,LPPA抗原蛋白的包被浓度为2.0 μg/100 μL,血清稀释度为1：300,3% BSA封闭1 h为最佳反应条件,临界值为2.738。本试验建立的间接ELISA方法批内和批间变异系数均<10%,证明该方法具有良好的重复性;对绵羊肺炎支原体（Mo）、蓝舌病病毒（BTV）、小反刍兽疫病毒（PPRV）、羊口蹄疫病毒（FMDV）、弓形虫及山羊痘病毒（GPV）标准阳性血清的检测均为阴性,表明该方法特异性较强;184份临床血清临床应用结果显示,该方法与正向间接血凝诊断试剂盒检测结果阳性符合率为93.33%,阴性符合率为75.23%,两者相对符合率为82.61%。[结论] 本研究成功建立了Mmc LPPA蛋白间接ELISA抗体检测方法,为临床Mmc血清抗体水平的监测及Mmc血清流行病学调查奠定了基础。 相似文献
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为探索TB27.4蛋白在牛结核病鉴别诊断中的作用,本试验以牛分枝杆菌Vallee Ⅲ株基因组DNA为模板,PCR扩增tb27.4全长基因片段,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组质粒pET-TB27.4,优化原核表达条件,并用AKTA Purifier对蛋白的纯化条件进行优化。SDS-PAGE结果显示重组蛋白为可溶性表达,且大小与理论值相符,用牛分枝杆菌阳性血清进行Western blotting检测有特异性条带,且可特异性地刺激牛分枝杆菌感染牛外周血淋巴细胞释放大量IFN-γ。结果表明,重组蛋白TB27.4具有良好的B细胞活性和T细胞刺激活性,为进一步研究其在牛结核病诊断中的作用奠定了基础。 相似文献
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研究旨在原核表达气肿疽梭菌细胞毒素A （CctA）基因,用纯化的重组蛋白建立其间接ELISA检测方法,a。利用大肠杆菌密码子的偏爱性优化CctA基因序列,克隆至原核表达载体pET-28a （+）,双酶切鉴定原核表达质粒pET28a-CctA并测序。将重组质粒转入大肠杆菌,经IPTG诱导得到高表达的重组CctA包涵体蛋白。包涵体蛋白变性后经镍（Ni）柱纯化,SDS-PAGE检测其纯化效果。以豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清为一抗,用Western blotting方法检测重组CctA蛋白的反应原性。用棋盘滴定法建立间接ELISA检测方法,以复性后的重组CctA蛋白作为检测抗原,摸索抗原包被浓度、封闭液的种类及浓度、抗体的最适稀释度和反应条件等。选用3批气肿疽灭活疫苗免疫豚鼠后采集血清,同时用攻毒和间接ELISA两种方法验证疫苗的免疫效力。质粒双酶切结果显示,得到大小约853 bp的条带,与预期相符,且测序结果正确。SDS-PAGE结果表明,成功表达并纯化大小为35 ku的重组CctA蛋白。Western blotting结果显示,豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清与重组CctA蛋白具有良好的反应原性。建立的间接ELISA法的最适条件为：抗原的包被浓度为0.5 μg/mL,于4 ℃包被过夜;封闭液选择10%胎牛血清,37 ℃孵育2 h;二抗的稀释度为1：8 000;室温避光显色10 min后终止反应,测定D450 nm值。当P/N>4.6时,间接ELISA法检测结果与豚鼠攻毒试验结果拟合度较好。本研究成功表达CctA基因并纯化了重组CctA蛋白,建立的以重组CctA蛋白为检测抗原的间接ELISA检测方法,有望成为气肿疽灭活疫苗免疫效果验证的替代方法。 相似文献
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HANG Tianyu ZHAO Hongzhe SONG Qianjin ZHANG Jing JI Zhi WEN Yongjun GUAN Pingyuan 《中国畜牧兽医》2007,47(11):3641-3650
In this study,the genome of Brucella Rev.1 strain was used as a template to amplify the BAB gene sequence,clone it into the prokaryotic expression vector pET-30a(+),obtain the recombinant plasmid pET-30a-BAB,and perform prokaryotic expression on the recombinant plasmid.The indirect ELISA method was constructed by using the expression products detected by Western blotting.The results showed that the BAB gene was successfully cloned and expressed in this experiment,and the purified expression product was analyzed by SDS-PAGE.This study obtained a relatively pure recombinant BAB protein;Western blotting test showed that the expressed protein could react specifically with Brucella sheep positive serum and had good reactogenicity;Using the recombinant BAB protein as the coating antigen,an indirect ELISA method for detecting BAB antibodies was established and optimized.The best determined coating conditions were as follows BAB protein coating amount was 0.25 μg/mL,serum dilution was 1:400;blocking solution was 3% pig-derived gelatin;secondary antibody dilution was 1:6 000;color development time was 10 min.The established method was used to detect 40 clinical sheep serums,and the cut-off value was calculated to be 0.607.That was,when the serum tested had P/N ≥ 1.5 and D450 nm ≥ 0.607,it was judged as positive,when D450 nm ≤ 0.561,it was judged as negative,and when 0.607<D450 nm<0.561,it was judged as a suspect value,and retest was required.Compared with the Huhong plate test and the test tube agglutination test,the positive coincidence rate was 100%,the negative coincidence rate was 71.88%,and the total coincidence rate was 77.5%. 相似文献
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本研究以布鲁菌Rev.1株基因组为模板,扩增BAB基因序列,将其克隆至原核表达载体pET-30a（+）,获得重组质粒pET-30a-BAB,对重组质粒进行原核表达,经Western blotting检测后,利用表达产物构建检测布鲁菌病的间接ELISA方法。结果表明,本试验成功克隆并表达了BAB基因,纯化表达产物经SDS-PAGE分析显示,本研究获得较纯的重组BAB蛋白;Western blotting试验表明,表达蛋白可与布鲁菌羊阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性;以重组BAB蛋白作为包被抗原,建立并优化了检测BAB抗体的间接ELISA方法。确定最佳包被条件：BAB蛋白包被量0.25 μg/mL,血清稀释度为1：400;封闭液为3%猪源明胶;二抗稀释度为1：6 000;显色时间为10 min。应用建立方法对临床40份羊血清进行检测,计算得出临界值为0.607。即当待检血清的P/N ≥ 1.5,且D450 nm ≥ 0.607时,判定为阳性,当D450 nm ≤ 0.561时,判定为阴性,当0.607 < D450 nm < 0.561时,判定为疑似值,需要进行复检。与虎红平板试验和试管凝集试验比较,阳性符合率为100%,阴性符合率为71.88%,总符合率为77.5%。 相似文献
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【目的】 建立快速、准确检测猪链球菌自溶素（atl）抗体的间接ELISA方法。【方法】 根据GenBank登录的猪链球菌atl基因序列设计1对引物,采用PCR方法从猪源链球菌中获得atl基因序列;构建pET-32a-atl和pGEX-4T-1-atl重组质粒,并将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞中进行诱导表达;以表达纯化后的atl-His融合蛋白为免疫原,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;以兔多克隆抗体为一抗,用Western blotting方法检测atl-GST融合蛋白的反应原性;以纯化后的atl-GST融合蛋白为包被抗原,猪链球菌感染阳性血清作为标准血清,建立猪链球菌自溶素抗体的间接ELISA检测方法。利用本试验建立的ELISA方法与商用猪链球菌2型ELISA抗体检测试剂盒同时对184份血清样品进行检测并用本试验建立的方法进行临床样品检测。【结果】 从猪链球菌中成功扩增出atl基因;构建的重组质粒,经诱导表达和纯化,获得大小为40 ku的atl-His和48 ku的atl-GST融合蛋白;经Western blotting验证,兔抗atl-His抗血清与atl-GST融合蛋白具有良好的反应原性;间接ELISA结果显示,该检测方法的阴阳临界值为0.318,阳性血清稀释至1：1 280检测仍为阳性;批内批间变异系数均<10%,表明该方法具有良好的重复性及敏感性。本试验所建立的ELISA方法检测出96份阳性样品,商用猪链球菌2型ELISA抗体检测试剂盒检测出66份阳性样品,符合率为71.7%。应用建立的方法检测458份不同饲养阶段的猪血清样品,其中检出277份阳性样品,阳性率为60.4%。【结论】 本试验成功建立了检测猪链球菌自溶素抗体的间接ELISA方法并进行了初步应用,为猪链球菌病血清流行病学调查奠定了基础。 相似文献