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鸡IgG单克隆抗体的制备与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]制备鸡免疫球蛋白单克隆抗体,提高诊断鸡特异性抗体的水平。[方法]应用盐析法粗提和葡聚糖G200凝胶层析分离纯化鸡血清IgG,免疫BALB/c小鼠,并进行细胞融合和ELISA筛选。[结果]间接ELISA法检测C44、C45、C67和C68共4株鸡IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞的腹水效价分别为1∶640000、1∶320000、1∶640000和1∶80000。Westernblot分析显示,C44和C45株单克隆抗体识别鸡IgG轻链,而C67和C68株单克隆抗体识别鸡IgG重链,它们与鸭、猪等血清Ig均没有反应。小鼠Ig亚类分析表明,4株细胞分泌的抗体均为IgG1型。[结论]成功获得了4株稳定分泌鸡IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞。 相似文献
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目的建立KGF-2单克隆抗体间接ELISA的筛选方法 ,制备KGF-2单克隆抗体.方法以KGF-2为抗原免疫BALB/c小鼠,获得抗血清.通过棋盘滴定方法确定间接ELISA的抗原包被浓度及一抗、二抗最佳工作浓度;利用建立特异性好的间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞株.结果通过棋盘滴定最终确定了500μg/L的抗原包被浓度、1∶1 000的一抗血清稀释倍数及1∶2 000的二抗血清稀释倍数;筛选到两株可稳定分泌抗体、效价较高的杂交瘤细胞株.结论该研究建立了灵敏度高、特异性好的间接ELISA筛选体系,可用于KGF-2单克隆抗体的制备及检测. 相似文献
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为建立检测新城疫病毒(NDV)抗体的间接ELISA方法,构建了新城疫(ND)xx08株HN基因抗原表位集中区基因片段的重组表达质粒p ET28a-r HN,加入IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE鉴定表明,表达的重组蛋白大小约为28 ku。Western blot分析表明,该重组蛋白具有良好的反应性。以纯化的HN蛋白为包被抗原建立检测NDV抗体的间接ELISA方法,优化试验条件后,抗原最适包被浓度为5μg/m L,血清最适稀释比例为1∶80,与HI试验结果符合率较高,且与鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病(IBV)、鸡禽流感病毒(AIV)和鸡马立克氏病毒(MDV)等标准阳性血清无交叉反应。表明建立的间接ELISA方法可以用于临床新城疫抗体的检测。 相似文献
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[目的]制备鸡MHCⅡ类分子的单克隆抗体。[方法]在分析鸡MHCII类分子蛋白序列基础上,选取鸡MHCⅡα链基因第2～6外显子和β链基因第3～6外显子进行原核表达,以纯化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经克隆和间接ELISA筛选阳性细胞株。[结果]共得到1株分泌鸡MHCⅡα链抗体和2株MHCⅡβ链抗体的杂交瘤细胞,分别命名为MHCⅡα-4、Ⅱβ6-2和Ⅱβ6-31,其腹水效价分别为1∶256000、1∶256000和1∶1280000。Western blotting分析表明其特异性强,能与相应蛋白结合。[结论]成功获得了3株稳定分泌抗鸡MHCⅡ类分子抗体的杂交瘤细胞。 相似文献
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【目的】制备抗鸭副粘病毒(DPMV)的单克隆抗体,为鸭副粘病毒病免疫学诊断方法的建立奠定基础。【方法】采用差速和蔗糖不连续密度梯度离心法提纯DPMV,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞株SP2/0融合,采用间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)和血凝抑制(HI)试验等方法筛选阳性杂交瘤细胞株,并测定其生物学特性。【结果】筛选到7株能稳定分泌抗DPMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为J28、F4、B3、E39、E41、A12和A30。这7株单克隆抗体都具有ELISA和1FA特性,其中J28和F4还具有HI和中和特性。免疫球蛋白亚类测定结果显示,J28和F4均为IgG1,其他5株均为IgM。相加ELISA试验结果显示,单抗B3,J28与F4,A30与E39/E41/A12分别识别3个不同的抗原位点。特异性测定结果显示,7株单克隆抗体与雏番鸭细小病毒(MPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭肝炎病毒(DHV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)及正常细胞均无交叉反应。【结论】筛选出了7株具有ELISA、1FA等特性且分泌抗DPMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并明确了各株单克隆抗体的特性,为鸭副粘病毒病的免疫治疗和临床诊断奠定了基础。 相似文献
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将菌毛化的鸡大肠杆菌国内分离株GL7(O78)灭活后作为免疫原,经淋巴细胞杂交瘤技术,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选,获得3E1、3H1、4A9和5G4共4株能稳定分泌1型菌毛抗体的杂交瘤细胞,它们均为IgG。免疫印迹试验结果表明:4株单抗均能同鸡大肠杆菌1型菌毛反应,识别分子质量为17~17.5 ku的菌毛蛋白。同时对鸡大肠杆菌表达1型菌毛的分离株进行检测,结果表明同一血清型或不同血清型间的鸡病原性大肠杆菌1型菌毛之间存在差异,O血清型不能完全体现菌株间的遗传相关性。 相似文献
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抗AIV(H9)独特型杂交瘤细胞株检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：1
采用兔抗AIV IgG作为检测抗原,通过预试确定了包被抗原的工作浓度为800μg／mL,以间接ELISA 方法检测融合细胞培养上清液,筛选到产生抗AIV鸡和兔种间共有独特型抗体的杂交瘤细胞,间接ELISA试 验中P／N值达12,证明杂交瘤细胞分泌目的单克隆抗体旱现强阳性。运用该检测方法,排除了分泌抗鸡同种 型表位以及超变区其他表位抗体的杂交瘤细胞,从而为筛选分泌抗H9亚型AIV独特型单克隆抗体的杂交瘤 细胞确定了可靠的方法。 相似文献
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一株分泌抗猪γ-干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞的鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]应用杂交瘤技术获得稳定分泌抗猪γ-干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。[方法]先将原核表达产物His—PoIFN一γ免疫BALB／c小鼠4次,然后进行细胞融合,再以纯化的GST—PoIFN一1作为包被抗原,用间接ELISA筛选阳性杂交瘤无性系,最终获得能稳定分泌抗猪IFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株,对其进行问接ELISA和Westernblot检测。[结果]试验获得l株能稳定分泌抗猪IFN一1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,被命名为B3株,经间接ELISA和Westernblot检测,该株分泌的抗体能与融合蛋白His—PoIFN一γ和GST—PoIFN一γ发生特异性反应,而与其他表达鸡γ-干扰素、His和GST蛋白等的重组质粒均不发生反应。B3株分泌的抗体小鼠腹水的ELISA效价达到1：160000,抗体亚型为IgG1型,且轻链为κ链。[结论]该研究为建立猪γ-干扰素检测方法,研究机体的免疫状态及免疫机制提供了技术基础。 相似文献
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[目的]为了研究中药"金花液"防治鸡传染性支气管炎对鸡血液生化指标的影响。[方法]选择20日龄的三黄鸡80只,随机分为5组。健康对照组不攻毒不给药,其余4组接种IBV-M41病毒。0.5%浓度预防组从攻毒前3 d开始给药连续8 d;3%高剂量和1%低剂量治疗组从临床症状开始时给药,连续5 d;阳性对照组不给药,攻毒后7 d检测血液生化指标。[结果]结果表明:阳性对照组的AST、ALP、R-GT在0.01水平上极显著高于健康组和其他预防治疗组;ALT、HBDB、D-BIL与其他各组差异显著;阳性对照组的BUN、UA差异达0.01极显著水平,CRE在0.05水平上显著高于健康组和其他预防治疗组;预防组血清中的TP和ALB在0.01水平上极显著高于阳性对照组,IgG在0.05水平上显著高于健康组。[结论]"金花液"对肝功能有显著保护作用;对肾功能有显著保护作用;能提高肌体的免疫力,有效预防传染性支气管炎病的发生。 相似文献
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从免疫过rSpaA的猪的脾淋巴细胞中提取总RNA,采用RT–PCR技术反转录合成cDNA。设计兼并引物扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片段,采用重叠延伸PCR方法,将VH和VL通过Linker连接成重组单链抗体(以下简写为sc Fv)的基因片段。将sc Fv的基因连接至噬菌粒载体p Comb3Xss,将重组载体电转化至宿主菌XL1-Blue,并经辅助噬菌体M13KO7拯救,获得猪源噬菌体单链抗体库,库容约为2.5×106。以rSpaA为靶抗原,经免疫亲和筛选,获得8株特异性较好的阳性克隆。本研究结果可为制备抗红斑丹毒丝菌的重组sc Fv提供新途径,并为猪丹毒的免疫检测和综合防制提供材料基础。 相似文献
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探明鸡传染性支气管炎病毒（Avian Infectious Bronchitis Virus,IBV）感染鸡胚肾细胞（Chicken Embry-o Kidney Cells,CEK cell）,并且实现其增殖为目的。将IBV稀释液注射到SPF鸡胚尿囊腔内,培养鸡胚扩繁,观察记录结果;并培养CEK细胞,采用100倍半数组织培养感染量的IBV进行染毒实验;应用Reed-Muench法计算半数鸡胚感染量为10-6.68/0.1 mL;用Real time PCR检测IBV在感染细胞中的含量,以确定IBV在CEKcells中已经感染且增殖成功。结果表明,接种10日龄的SPF鸡胚可以收集更多的、约8 mL的尿囊液毒;反复盲传至7代的IBV可使CEK cells产生明显的细胞病变效应;通过实时荧光定量PCR和RT-PCR检测,最终确定IBV-M41型扩繁成功并且能够在CEK细胞上繁殖,为下一步实验提供了参考。 相似文献
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Zhou Jin-xin Zhang Xiao-yu Wang Yu-yang Huang Tao Guo Xiao-chen Li De-shan Ma Bo Ren Gui-ping 《东北农业大学学报(英文版)》2021,28(1):50-60
Goose parvovirus (GPV) can cause a highly contagious and fatal gosling plague (GP) disease in goslings and muscoy ducklings.Here,three goose-origin neutralizing single chain variable fragment (scFv) antibodies against GPV SYG-61 were isolated.The genes of scFv antibodies were derived from goslings immunized with GPV SYG-61,and scFvs were subcloned into a pBSD vector for the construction of pBSD-scFv libraries.The pBSD-scFv libraries were screened following three rounds using VP2 (protective antigen of GPV) as the bait by flow cytometry (FCM).After screening,the 15 clones with high mean fluorescence intensity (MFI) were isolated and sequenced.These 15 scFvs were expressed by pET-28a (+) in E.coli.The specificity and affinity of the 15 purified scFvs were successfully confirmed by ELISA.In the preliminary neutralization experiment on primary goose embryo fibroblast (GEF) in vitro,three of the 15 purified scFvs (named scFv-10,scFv-11 and scFv-50) showed significant neutralizing capacities.The study generated the first goose-origin neutralizing scFv against GPV and laid the foundation for the appearance of full-length goose-origin neutralizing monoclonal antibody against GPV. 相似文献
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[目的]克隆构建黄曲霉毒素B1(AFB1)单链抗体(scFv)基因,并对其编码蛋白序列和结构进行分析预测,为scFv分子修饰改造及在免疫学检测中的应用提供参考依据.[方法]以抗AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株为原料,通过PCR扩增重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),以(Gly4Ser)3为柔性接头(Linker)拼接构建抗AFB1 scFv基因,并采用在线生物信息学分析软件对其氨基酸序列、理化性质及蛋白结构进行分析预测.[结果]抗AFB1 scFv基因全长744 bp,编码248个氨基酸,分子量为26312.05 Da,理论等电点(pI)5.70,其二级结构中含有35个α-螺旋(占14.11%)、28个β-折叠(占11.29%)、85个延伸链(占34.28%)和100个随机卷曲(占40.32%),在三级结构中连接肽卷曲将VH和VL区域牵拉而相互靠近,形成典型的抗体结构——沟槽结构,是scFv的抗原结合区域.[结论]构建的抗AFB1 scFv其VH含有117个氨基酸、VL含有116个氨基酸,具备典型抗体结构——沟槽结构,能与抗原特异性结合. 相似文献
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为筛选牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)gP48蛋白的单链抗体,本研究利用噬菌体展示技术构建了gP48蛋白单链抗体克隆文库,通过微孔筛选法对抗体库进行3轮富集淘筛,利用ELISA技术测定单链抗体的亲和力,对亲和力较高的克隆进行基因测序分析和结合活性测定,旨在获得gP48蛋白的单链抗体。结果表明:1)成功构建了库容量为4.3×107的噬菌体单链抗体库,其重组率为83.3%,经三轮筛选对噬菌体抗体库进行富集,富集倍数为1.43×104;2)优化了间接ELISA方法,筛选到3株与BVDV gP48蛋白具有高亲和力的单链抗体以及其基因序列,通过IgBLAST分析显示,3株单链抗体均为鼠源IgG。综上,从gP48蛋白的单链抗体库中筛选获得3个具有高亲和力的单链抗体,可用于后续BVDV检测方法的建立。 相似文献
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应用SDS-PAGE对病毒的结构蛋白研究结果显示T株病毒与M41和H 相似文献
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《东北农业大学学报》2020,(1):42-49
为获得抗O型口蹄疫病毒(FMDV)高亲和力猪源单链抗体(scFv),建立抗原抗体(Ag-Ab)共表达细菌展示文库,抗原为FMDV结构蛋白VP1、抗体为高免猪抗体文库。采用细菌展示与流式细胞术结合方法,筛选出14株抗FMDV的scFv。将筛选获得scFv构建至pET28a载体中,经E. coli Rosetta表达,目的蛋白长度约为30ku,与scFv分子质量相符。Western blot结果表明,14株scFv均可与VP1特异性结合。ELISA结果表明,14株scFv均可与灭活O型FMDV特异性结合。应用共表达细菌展示技术,可避免抗原制备,简化操作流程,适用范围广泛;应用流式细胞仪筛选抗体库,可实现准确、快速、高通量筛选。抗FMDV猪源scFv研究可填补同源基因工程抗体空白,为进一步筛选中和抗体奠定基础。 相似文献
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鸡传染性支气管炎病毒核衣壳蛋白基因的克隆、表达及应用 总被引：3，自引：0，他引：3
核衣壳蛋白(N)是鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的重要结构蛋白。根据已报道的IBV基因序列扩增IBVN基因,割胶回收扩增产物并将其克隆到pET-28a( )载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,目的蛋白得到高效表达。分离纯化重组N蛋白并用其作为抗原建立ELISA检测抗体方法,研究了IBVM41攻毒后雏鸡血清特异性抗体消涨规律。 相似文献
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为了构建高效表达阳性抗甲胺磷单链抗体(scFv)基因的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris系统,设计引物扩增阳性克隆scFv基因,亚克隆至表达载体pPICZαC,构建重组酵母表达质粒pPICZαC-scFv,线性化pPICZαC-scFv并高效电转P.pastoris(X-33),抗性梯度筛选转化子以获得高效表达菌株,对获得的菌株先后进行表达条件的优化、优化条件下的诱导表达及单链抗体性质研究。结果:获得了稳定高效表达菌株X-33-Pp-Met-28D4-1,该菌株优化条件下的scFv诱导表达量为25 mg/L,纯化产物对甲胺磷的抑制中浓度IC50为93.52μg/mL,抗原抗体亲合常数为2.34×10-8mol/L。因此利用Pichia pastoris表达系统可大量制备功能性抗甲胺磷单链抗体。 相似文献