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旨在筛选PK-15细胞中与猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)复制起始区(origin of replication, Ori)互作的细胞蛋白谱,并初步探究PARP1蛋白对PCV2复制的调控。利用DNA-protein pull down结合LC-MS/MS方法筛选PCV2复制起始区DNA互作蛋白;对互作蛋白进行GO分析以及KEGG通路富集分析,并绘制蛋白互作网络图。在对互作蛋白进行分析的基础上,选择聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP1)蛋白,开展了深入研究。构建了PARP1蛋白以及PCV2复制蛋白Rep真核表达质粒,并利用DNA-protein pull down及DNA IP试验验证PARP1蛋白与PCV2 Ori的互作;通过Co-IP试验,研究了PARP1蛋白与PCV2 Rep蛋白的互作;在细胞中过表达或沉默PARP1蛋白,通过qPCR方法检测对PCV2复制的影响。本研究共鉴定到130种可能与Ori互作的宿主蛋白,其中,与DNA功能相关的蛋白共有45种,主要涉及宿主DNA损伤修复及DNA复制功能;验证了PARP1蛋白与PCV2基因组Or... 相似文献
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重组新城疫病毒表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建表达猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白(Cap)的重组新城疫病毒(NDV),本研究利用NDV LaSota弱毒疫苗株为活病毒载体,通过反向遗传操作系统构建出表达PCV2 Cap的重组病毒(rLa-PCV2/Cap),以及表达删除核定位信号(NLS)的Cap(Cap△41)的重组病毒(rLa-PCV2/Cap△41),并对外源蛋白的表达效果进行了检测.通过间接免疫荧光试验证明,两种重组病毒感染的BHK-21细胞中,PCV2 Cap蛋白以及删除NLS的Cap△41蛋白均获得正确表达;其中,完整的Cap蛋白定位于核内,而删除NLS的Cap△41蛋白则定位于胞浆中,本研究结果为研究新型PCV2疫苗奠定基础. 相似文献
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为便于快速、准确检测猪圆环病毒2型(PCV2),减少其对我国养猪业的威胁,建立了PCV2 Cap蛋白琼脂扩散试验(AGP)检测方法。应用表达制备好的PCV2 Cap蛋白,与弗氏佐剂乳化后免疫家兔,制备多克隆抗体并进行抗体效价测定。确定AGP最佳工作条件,并进行抗体特异性、稳定性及符合率试验。结果显示:制备的多克隆抗体ELISA效价可达1:12 800,AGP效价可达1:32,表明其具有良好的特异性、稳定性;对20份PCV2 Cap蛋白抗原进行检测,发现其结果与应用标准猪血清抗体检测结果符合率为100%。结果表明,制备的抗PCV2 Cap蛋白多克隆抗体可替代标准抗体,用于PCV2 Cap蛋白的AGP试验检测。本研究为PCV2检测以及后续的免疫学特性研究提供了技术支撑。 相似文献
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猪圆环病毒(PCV)能够引起多种综合征和疾病,给养猪业造成了较大的经济损失。PCV2毒株在2003年后以PCV2b取代PCV2a成为临床感染的猪群中最为流行的基因型。PCV基因组为单股负链环状DNA,其中ORF2编码病毒核衣壳蛋白Cap蛋白,Cap蛋白是主要的免疫原性蛋白。本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将PCV2b的Cap蛋白基因克隆到杆状病毒载体中,通过制备杆粒、转染sf9细胞,获得表达PCV2b Cap蛋白的重组杆状病毒毒株,从IFA、SDS-PAGE及Western-blotting分析结果可以看出,该重组杆状病毒毒株成功表达了PCV2b Cap蛋白,为制备PCV2b Cap蛋白亚单位疫苗打下基础。 相似文献
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旨在筛选并鉴定与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳蛋白(N蛋白)相互作用的宿主蛋白。本试验通过构建猪肺酵母cDNA文库、酵母双杂交、免疫共沉淀、激光共聚焦、过表达和干扰试验等手段,筛选与N蛋白互作的宿主蛋白并研究其对PRRSV复制的影响。结果显示：N蛋白和核糖体蛋白S20(RPS20)在酵母细胞内发生互作,免疫共沉淀和激光共聚焦试验进一步确定N蛋白和RPS20蛋白互作并共定位于细胞质中。过表达和干扰试验证实RPS20能够影响HP-PRRSV在细胞内的增殖。本研究丰富了PRRSV与宿主因子互作的网络,为进一步研究RPS20蛋白在PRRSV感染过程中的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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为建立猪圆环病毒2型(PCV2)山西流行毒株Cap蛋白的原核可溶性表达体系,并分析比较重组蛋白与2种商品化基因工程Cap亚单位疫苗在小鼠体内不同阶段的免疫原性,本试验以PCV2e SXJX株(GenBank登录号：MH922991.1)的ORF2基因为基础,根据大肠埃希菌密码子偏性优化序列,将其插入原核表达载体pET-28a-c(+)中,鉴定为阳性后转入宿主菌BL21(DE3)中,经优化表达条件后,对超声破碎后的菌体上清进行纯化,分析纯化后产物的纯度和抗原性,并利用负染透射电镜观察重组Cap蛋白体外自组装成病毒样颗粒(VLPs)。分别将同等免疫剂量的PCV2e重组Cap蛋白和2种商品化PCV2基因工程亚单位疫苗免疫健康BALB/c雌鼠,应用ELISA方法检测不同阶段小鼠体内特异性抗体的水平。结果显示：重组Cap蛋白可在大肠埃希菌中表达,以完全可溶性形式存在于菌体超声波破碎后的上清中,表达产物纯化效果良好,并能被PCV2单克隆抗体识别;透射电镜观察结果发现,表达的重组Cap蛋白可以自组装成约20 mm大小的VLPs;动物免疫试验结果显示,在首免后第21天PCV2e Cap试验组抗体水平显... 相似文献
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《中国兽医学报》2019,(6):1052-1057
构建3型猪圆环病毒(PCV3)Cap蛋白的重组植物乳杆菌并进行验证。通过PCR方法扩增含1320信号肽和DCpep优化的PCV3 Cap基因(PCV3D),使用无缝克隆技术连接到pSIP411载体中,电转入克隆宿主乳球菌NZ3900中,提取测序结果正确的重组表达质粒NZ3900:pSIP411-PCV3D再次电转入植物乳杆菌Lp12,制备重组菌并验证其表达。结果显示:成功扩增出目的条带为789 bp的经过修饰和优化的PCV3 Cap基因(PCV3D)片段,重组表达质粒电转入植物乳杆菌Lp12,成功构建重组植物乳杆菌Lp12:pSIP411-PCV3D。Western blot、流式细胞术等方法检测重组蛋白表达,获得阳性结果,阳性率为47.9%;免疫荧光进一步表明重组蛋白能够在细胞中表达。本试验成功构建了1株表达PCV3 Cap蛋白的植物乳杆菌,为PCV3口服候选疫苗的开发研究提供依据。 相似文献
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猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因编码病毒的核衣壳蛋白(Cap),该蛋白属于病毒保护性抗原,具有重要免疫功能。本研究以PCV2871毒株基因组为模板,用特异性上下游引物扩增获得ORF2基因,利用真核表达载体构建了表达PCV2Cap蛋白的重组质粒pCAGGS-ORF2。采用脂质体将pCAGGS-ORF2转染至293T细胞,用抗PCV2-Cap单克隆抗体对重组质粒转染细胞进行了免疫活性分析和免疫荧光检测,表明Cap蛋白在细胞中获得表达;利用共聚焦显微镜对Cap蛋白在293T细胞中的亚细胞定位观察结果表明,转染24h后可见Cap蛋白的表达随培养时间延长显著增多,72h达到高峰,表达的Cap蛋白主要分布在细胞核中。构建的pCAGGS-ORF2真核表达重组质粒在293T细胞中的表达,为进一步PCV2基因疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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猪圆环病毒2型重组Cap蛋白在昆虫杆状病毒中的表达 总被引：3，自引：1，他引：3
猪圆环病毒2型(PCV2)基因组包含2个开放阅读框架(ORFs),其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep),ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap).为了在昆虫细胞表达Cap蛋白,本研究采用PCR扩增PCV2-ORF2编码基因,将PCR产物插入到昆虫杆状病毒转移载体上,经酶切反应及DNA序列分析得到验证.重组质粒与昆虫杆状病毒线性基因组混合,转染到昆虫细胞(Sf-21)进行基因重组,经3次病毒蚀斑克隆,获得高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒,毒价可达1.28×108pfu/mL.采用SDS-PAGE凝胶电泳分析表明,重组Cap融合蛋白分子量为32.8 ku,占总蛋白含量的17.2%.免疫印迹试验分析表明,重组Cap蛋白与PCV2阳性血清产生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫活性反应.本研究为进一步进行该病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定了基础. 相似文献
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猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）是近年来新发现的引起仔猪多系统衰弱综合症的必需病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白（Rep）和核衣壳蛋白（Cap）,其中Cap含有病毒主要抗原表位,是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因。本研究利用PCR技术将Cap蛋白基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体（pShuttle-CMV）,与腺病毒骨架载体（pAdEasyTM）共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒tAd-Cap,测定其TCID50为1015．7／mL。用RT—PCR、间接ELISA、Westernbfot和IPMA等方法证明了Cap蛋白在腺病毒中获得表达。该研究为发展PCV2的重组腺病毒基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献
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猪圆环病毒3型Cap蛋白单克隆抗体的制备及其在免疫组化试验中的初步应用 总被引：1，自引：0，他引：1
为制备猪圆环病毒3型(PCV3)Cap蛋白单克隆抗体(MAb),并初步应用于感染细胞或组织样品中PCV3抗原的间接免疫荧光试验(IFA)或免疫组化(IHC)检测,本研究将PCV3 Cap蛋白的去核定位信号肽基因克隆于原核表达载体pET-28a中,经IPTG诱导表达了具有免疫原性的融合蛋白。以表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,共获得8株能够稳定分泌针对PCV3 Cap蛋白的MAb杂交瘤细胞株。Western blot与IFA试验结果显示,8株MAbs均能够与真核表达的重组Cap蛋白反应。选取3株杂交瘤细胞制备3株MAbs,小鼠腹水效价分别为1∶409 600、1∶204 800和1∶409 600。利用3株MAbs对自然感染PCV3临床病猪的腹股沟淋巴结进行IHC检测,结果显示3株MAbs的腹水均能够与感染PCV3的临床样品发生特异性的免疫反应。本研究制备的MAbs具有较好的特异性,为深入研究Cap蛋白的结构和PCV3快速诊断奠定了基础。 相似文献
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为制备猪圆环病毒2a型（PCV2a）和2b型（PCV2b）Cap蛋白，用生物信息学软件优化PCV2a Cap基因和PCV2b Cap基因密码子、克隆至p ET28a载体中、转化BL21(DE3)、构建重组蛋白表达菌株，通过优化原核表达的温度、IPTG浓度等条件进行蛋白表达，采用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白鉴定。结果显示：重组PCV2a-Cap蛋白和PCV2b-Cap蛋白的分子量约为30 k Da，在不同温度下都以包涵体形式存在，在37℃下以终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达的Cap蛋白表达量最高。试验成功制备了PCV2a-Cap蛋白和PCV2b-Cap蛋白，为制备PCV2二价疫苗及其诊断方法的研究提供了基础材料。 相似文献
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本研究旨在通过构建pGEX-4T-1-Cap原核表达载体,制备猪圆环病毒3型（PCV3）重组核衣壳（Cap）蛋白抗原。将密码子优化的PCV3 Cap全基因插入pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,筛选出最佳诱导条件,通过谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化重组Cap蛋白。结果表明,成功构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap;在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、16 ℃诱导20 h的条件下,可获得大量可溶性重组Cap蛋白,SDS-PAGE结果表明分子质量在51.6 ku,与预期相符;Western blotting分析表明经纯化的Cap蛋白与鼠抗GST单克隆抗体、PCV3兔源阳性血清呈阳性反应,进一步证实了重组蛋白的表达。本研究表达并纯化了PCV3 Cap重组蛋白,为新型基因工程亚单位疫苗的研制和ELISA血清学诊断方法的建立奠定了基础。 相似文献
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为在真核细胞中共表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白与猪O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白,本研究将其各自编码基因克隆于杆状病毒双表达载体(pFastBacTMDual)中构建重组转移质粒(pFBD-Cap-VP1),转化至DH10BacTM感受态细胞中制备重组杆粒(rBacmid-Cap-VP1),并转染Sf21昆虫细胞,拯救出能够共表达PCV2-Cap和FMDV-VP1蛋白的重组杆状病毒(rBac-Cap-VP1)。SDS-PAGE和western blot检测结果表明,共表达的重组PCV2-Cap和FMDV-VP1蛋白产物的分子量分别为28 ku和30 ku,各占总蛋白含量的11.6%和3.4%,能够分别与PCV2和FMDV抗体发生特异性反应,表明共表达蛋白具有良好的反应原性。本研究为PCV2和FMDV基因工程二联亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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为制备猪圆环病毒4型(PCV4)Cap蛋白单克隆抗体,以原核表达的重组Cap蛋白免疫6～8周龄小鼠,三次免疫后取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。利用亚克隆技术和间接免疫荧光(IFA)方法筛选到2株阳性单克隆杂交瘤细胞株,分别命名为5H9和2F3。间接免疫荧光和Western blot试验表明,2株单抗均能特异性识别293T细胞中特异表达的Cap蛋白,且5H9和2F3的IFA效价分别为1∶12 800和1∶6 400。亚类鉴定结果表明,两株单抗重链均属于IgG1,轻链类型为kappa型。本研究制备的抗PCV4 Cap特异性单抗,为PCV4检测方法的建立和流行病学调查提供了有效的生物材料,也为该病毒的分离鉴定与Cap蛋白功能的探究奠定了基础。 相似文献
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猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)Cap蛋白是病毒的主要结构蛋白,能诱导宿主产生特异性免疫应答。口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP1蛋白是病毒的主要免疫原性蛋白,能刺激机体产生中和抗体。利用杆状病毒表面展示系统,将这2种病毒蛋白与猪CD40配体(CD40 ligand,CD40L)进行融合表达并展示在杆状病毒表面,构建了rv Ac-Cap、rv Ac-VP1和rv Ac-Cap-VP1 3种重组杆状病毒。通过SDS-PAGE和Western blotting检测3种重组杆状病毒感染的Sf9细胞总蛋白,证明3种融合蛋白成功表达。纯化的重组杆状病毒颗粒以1×108pfu/只的剂量免疫接种BALB/c小鼠,通过间接ELISA检测血清中Cap和VP1的抗体浓度,证明表面展示有Cap和VP1的重组杆状病毒能激发小鼠产生较高水平的抗体,与PCV2和FMDV商品化疫苗免疫组的抗体浓度差异不显著(P0.05),表明该重组杆状病毒具有较好的免疫原性。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2017,(6)
为建立稳定表达携带SFB标签的猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的细胞株并研究其诱导凋亡活性,本研究利用Gateway系统构建真核表达载体p DEST-SFB-ORF2,转染PK15细胞,嘌呤霉素抗性筛选,western blot和免疫共沉淀试验鉴定,获得2株稳定表达携带SFB标签的Cap蛋白的PK15细胞株。间接免疫荧光检测发现重组Cap蛋白在部分细胞内呈点状荧光分布,可能形成病毒性颗粒;流式细胞仪检测表明Cap蛋白的表达可诱导PK15细胞凋亡。本研究成功表达携带SFB标签的PCV2 Cap蛋白,并验证了其诱导凋亡活性,同时为下一步通过串联亲合纯化/质谱方法鉴定Cap蛋白的互作蛋白研究奠定基础。 相似文献