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猪γ-干扰素双顺反子表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达 总被引：8，自引：1，他引：8
提取经 Con A诱导培养的猪外周血白细胞总 RNA,RT- PCR扩增出猪 IFN- γ基因并克隆到 p GEM- T- easy载体 ,测序结果表明 ,扩增片段为含有信号肽的猪 IFN-γ完整基因。亚克隆猪 IFN-γ成熟蛋白编码基因 ,并对其 5′段前 2个稀有密码子进行大肠杆菌偏嗜性改造。通过引入 SD序列 ,成功构建了猪 IFN- γ原核双顺反子表达载体 p L CS-po IFN2 G,并实现了猪 IFN-γ在大肠杆菌中的高表达 ,约占菌体总蛋白的 5 6 .5 %。表达产物以包涵体形式存在 ,用含 7mol/L 盐酸胍的变性液溶解及含 0 .5 mol/L盐酸胍复性液复性处理 ,复性后的表达产物经凝胶层析纯化后 ,细胞病变抑制法测定结果表明 ,重组猪 IFN-γ具有较高干扰素活性 相似文献
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本研究采用RT-PCR方法从培养的鹅外周血淋巴细胞总RNA中成功扩增到鹅IFN-γ基因。将克隆在pMD18-T载体中的鹅IFN-γ基因插入原核表达载体pGEX-6P-1,得到重组质粒pGEX-6P-1-IFN-γ。重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后作SDS-PAGE分析,得到约43 ku融合表达蛋白特异条带。用GST亲和纯化柱对原核表达产物中目的蛋白进行纯化,得到1.2 mg/L的纯化蛋白。用100TCID50病毒量在鹅副黏病毒(GPMV)/鹅胚成纤维细胞系统上测定表达蛋白的抗病毒活性,观察不同处理组的细胞形态并用RT-PCR方法鉴定,发现表达蛋白稀释倍数小于104可抑制GPMV复制,按照Reed-Muench法计算表达的鹅IFN-γ抗病毒效价为2.0×103U/mL,表明表达蛋白具有良好的抗病毒活性。 相似文献
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本文旨在通过原核表达获得猪磷酸酪氨酸互作结构域1(p PID1)重组蛋白,并制备p PID1多克隆抗体。将p PID1基因插入p ET28a(+),构建重组p ET28a(+)-p PID1大肠杆菌表达质粒,然后将重组质粒p ET28a(+)-p PID1转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中,获得的重组子以不同异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)浓度、温度和时间诱导,确定p PID1融合蛋白表达的最适条件。将表达产物经镍离子-亚氨基二乙酸(Ni2+-IDA)亲和层析纯化后进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MSMS)鉴定。同时,将纯化获得的p PID1融合蛋白免疫SD大鼠,制备p PID1多克隆抗体,并检测抗体效价。结果表明:p PID1融合蛋白表达的最佳条件为30℃以0.1 mmol/L IPTG诱导4 h;纯化的融合蛋白经MALDI-TOF-MSMS鉴定为p PID1;特异性的p PID1多克隆抗体成功制备,抗体效价为1∶20 480。本试验成功制备了高纯度的重组p PID1及其多克隆抗体。 相似文献
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鸡催乳素和抑制素-α亚基重组蛋白的构建及表达 总被引：3，自引：0，他引：3
将鸡催乳素 (PRL)和抑制素 - α亚基 (INB- α)基因编码序列重组为融合基因 ,制备了同时包含这 2种激素基因的融合蛋白。通过 PCR和分子克隆的方法首先将全部粤黄鸡 PRL成熟肽 c DNA克隆到载体 p RSET A的 Bgl 和 Eco R 克隆位点之间 ,获得重组质粒 p PRL- RSET。鸡 INB- α片段经扩增后分别被克隆到质粒 p RSET A和 p PRL- RSET的 Nhe 和 Xho 克隆位点之间 ,获得重组质粒 p INB- RSET和 p INB- PRL。以上重组质粒构建的正确性分别由各特定引物组合扩增的 PCR产物长度、特定限制性内切酶消化各重组质粒所得产物长度以及对各质粒的测序结果得到验证。重组质粒 p PRL- RSET和 p INB- PRL 转化 E.coli BL2 1(DE3)株 ,IPTG诱导后所表达的产物经 SDS- PAGE显示 ,其分别与所预期的重组蛋白分子大小相符。质粒 p PRL - RSET和 p INB- PRL的表达产物和用 Ni- NTA凝胶纯化的 2重组蛋白产物都可与抗鸡 PRL 抗体产生特异的免疫印迹 ,并且表达菌裂解液和相应纯化蛋白的免疫印迹处于同一位置。结果说明 ,试验已成功完成了鸡 PRL、INB-α及 2者融合蛋白的构建、表达和纯化 相似文献
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重组鸡抗菌肽Gallinacin-9的原核表达及其抗菌活性的鉴定 总被引：7，自引：2，他引：5
采用RT—PCR方法,从鸡舌组织中扩增到Gallinacin-9（Gal-9）基因,测序表明Gal-9为201bp,其成熟肽由67个氨基酸残基组成。进一步将克隆的Gal-9基因亚克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1的EcoR I和Sal I双酶切位点上,构建重组表达质粒pGEX—Gal-9,经序列分析鉴定确证目的基因克隆人载体的预期位点。将重组质粒转化大肠杆菌BL21,于37℃诱导培养不同时间,SDS-PAGE电泳表明该基因在大肠杆菌中高水平表达,表达的重组鸡Gab-9融合蛋白相对分子质量约为32ku。重组蛋白占菌体总蛋白的40％。表达的重组鸡Gal-9融合蛋白以包涵体的形式存在。重组蛋白经纯化后,分别以对数生长中期的大肠杆菌BL21（DE3-）株与致病性链球菌CAB株为检测菌,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定了重组Gal-9蛋白的抗菌活性,结果表明,重组Gal-9对这2种细菌都具有抗菌活性。 相似文献
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堆型艾美耳球虫单链抗体-PE40重组免疫毒素的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
用HindⅢ对已构建的质粒pT-PE40和原核表达载体pET22-ScFv进行单酶切,回收纯化1 101 bp的PE40基因片段并将其亚克隆至pET22-ScFv载体中,构建重组免疫毒素表达质粒pET22-ScFv-PE40。将该质粒转化入感受态大肠杆菌J M109中增殖,提取质粒后用SalⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定,得到了1 114 bp和6 181 bp目的基因片段。测序鉴定PE40的插入方向,选取以PE40基因5′端与ScFv基因3′端连接的重组质粒,构建了抗堆型艾美耳球虫重组免疫毒素质粒pET22-ScFv-PE40。抗堆型艾美耳球虫重组质粒pET22-ScFv-PE40经1 mmol/LIPTG诱导,在大肠杆菌中表达约68 000的目的蛋白。使用抗PE多克隆抗体对目的蛋白进行蛋白印迹分析,结果表达产物与抗PE多克隆抗体发生抗原抗体反应,证明融合基因得到表达。 相似文献
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《中国兽医杂志》2018,(8)
为了表达非洲猪瘟K205R蛋白,进而制备其多克隆抗体,为非洲猪瘟血清学检测方法的建立奠定基础。以合成的K205R基因为模板,PCR扩增该基因序列,并将其克隆至原核表达载体p ET-21a中,得到重组质粒p ET-21a-ASFV-K205R。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达His-ASFV-K205R融合蛋白,通过亲和层析的方法纯化His-ASFV-K205R融合蛋白。通过Western Blot方法鉴定融合蛋白的抗原性,以此融合蛋白为抗原免疫兔制备多克隆抗体,通过ELISA的方法测定多抗效价。结果表明,原核表达的K205R蛋白具有很好的抗原性,制备的兔多克隆抗体效价为1∶128 000,为建立非洲猪瘟的血清学检测方法提供生物材料。 相似文献
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猪γ干扰素的体外表达及其多克隆抗血清的制备 总被引：3，自引：3，他引：0
从健康仔猪前腔静脉无菌采血,分离外周血单个核细胞,提取细胞总RNA,用猪γ干扰素(IFN-γ)基因特异性引物通过RT-PCR扩增猪IFN-γ的全长cDNA序列,将其克隆到pMD18-T载体中,再亚克隆到pUC18和表达载体pET-30a中,经测序发现其序列与GenBank报道的IFN-γ基因序列基本一致.将重组质粒pET-30a-IFN-γ转化大肠杆菌BL21,于37℃经IPTG诱导表达,IFN-γ基因获得表达,表达产物以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的39%.经SDS-PAGE及Westernblot分析表明,表达的融合蛋白分子量约为25 ku.将包涵体用8 mol/L脲变性,用ProBondTM Purification Systerm纯化,经透析复性,得到纯化的目的蛋白,含量可达0.3 mg/mL.将复性蛋白免疫新西兰白兔三次,制备了高滴度的猪IFN-γ抗血清.本实验表达和纯化了猪IFN-γ,并制备兔抗猪IFN-γ的抗血清,为下一阶段关于猪γ干扰素重组蛋白其应用奠定了基础. 相似文献
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《畜牧与兽医》2017,(9):67-70
根据禽网状内皮组织增生症病毒(REV)DBYR1102株的前病毒基因组c DNA序列设计并合成1对引物,以p T-G质粒为模板,通过PCR扩增获得该病毒CA基因片段。将其克隆于pET-30a(+)中,构建原核表达质粒pET30a-CA。重组质粒经双酶切和测序鉴定,转化BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。利用Ni-NTA His Bind Resin纯化重组蛋白,并经蔗糖浓缩,Western blot法检测重组蛋白的反应原性。纯化后的目的蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗CA多克隆抗体并对其进行鉴定。结果表明构建的重组质粒pET-30a-CA在大肠杆菌BL21中呈可溶性高效表达。经Ni柱纯化和蔗糖浓缩后得到纯度较高的融合蛋白,以纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,抗体效价达1∶25 600。该研究为REV的检测及CA基因的深入研究奠定了基础。 相似文献
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从鸡胚原代细胞CEF中扩增出鸡HMGB1基因,构建重组原核表达质粒p ET-28a-ch HMGB1,并将p ET-28a-ch HMGB1转入大肠杆菌BL21(DE3)中,于37℃进行诱导表达,经SDS-PAGE分析表明该重组蛋白可以在大肠杆菌中高效表达且以可溶性蛋白的形式存在。蛋白通过Ni-NAT纯化树脂亲和纯化,并作为免疫原制备鼠抗ch HMGB1多克隆抗体血清。该多克隆抗体同时具有ELISA、Western blot和IFA效价,且特异性识别禽源细胞内HMGB1蛋白。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2016,(3)
采用PCR方法扩增犬瘟热病毒N基因,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建犬瘟热N基因原核表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达重组N蛋白。从包涵体中纯化重组蛋白,制备多克隆抗体,采用Western blot检测其特异性。结果显示PCR扩增得到犬瘟热N基因,重组N蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到表达,制备的多克隆抗体能与N蛋白特异性反应。 相似文献
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鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的原核表达及生物学活性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
通过PCR方法扩增不含信号肽的鸡GM-CSF成熟蛋白基因,克隆至原核表达载体pET-32a（＋）,构建原核表达质粒p32GM-CSF,通过IPTG诱导重组鸡GM-CSF蛋白表达,经镍离子亲和层析纯化后,用MTT法检测表达重组蛋白的生物学活性,并制备兔抗鸡GM-CSF多克隆抗体。结果表明成功地构建了p32GM-CSF原核表达质粒,SDS-PAGE结果显示表达的重组蛋白约34 ku,主要以包涵体形式表达,纯化后得到高纯度目的蛋白。West-ern Blot结果表明,该重组蛋白能与制备的抗鸡GM-CSF抗体特异性结合。MTT试验证实,该重组蛋白具有明显增强鸡骨髓细胞增殖的生物学活性;这些研究结果表明,表达的重组chGM-CSF蛋白及其多克隆抗体拥有相应的生物学功能,这将为进一步研究鸡GM-CSF蛋白的生物学功能及其应用奠定基础。 相似文献
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为制备MHCⅠ基因工程疫苗的基础材料,构建了鸡MHCⅠ分子重组质粒并进行原核表达,进而制备鸡MHCⅠ分子的多克隆抗体。应用PCR方法,克隆鸡MHCⅠα和β2m基因,构建重组载体pETMHCⅠα和pET-MHCⅠβ2m,经PCR、双酶切和测序鉴定后,将重组质粒在大肠埃希菌Rosetta中进行诱导表达,融合蛋白纯化后,接种昆明小鼠制备多克隆抗体,血清稀释后用免疫印迹法(Western blot)分析。结果表明,鸡MHCⅠα和β2m基因在大肠埃希菌中成功表达,融合蛋白分子质量分别约为52.1ku和33.0ku;制备的鼠抗鸡MHCⅠα和β2m链多克隆抗体,经Western blot检测证实抗体特异性较强,可进一步用于鸡MHCⅠ分子的研究。 相似文献
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[目的]利用大肠杆菌原核表达系统对猪干扰素α-1(Po IFNα-1)基因进行表达,制备Po IFNα-1重组蛋白多克隆抗体。[方法]根据Gen Bank发表的Po IFNα-1核苷酸序列,合成密码子优化的Po IFNα-1基因,构建Po IFNα-1基因的p ET-28a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌后,利用IPTG进行诱导表达。表达的Po IFNα-1重组蛋白纯化后,免疫昆明系小鼠,制备多克隆抗体。采用Western blot技术检测Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体与天然Po IFNα-1的反应性。[结果]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中成功表达,针对Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体能够识别天然的猪干扰素α-1。[结论]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌中获得了成功表达,为后续研究奠定了基础。 相似文献
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以重组克隆质粒p0390-MF-NASHOR1为模板,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增出烟碱酰胺合成酶基因(nas)片段并将其克隆到原核表达载体pGEM-KG中,获得重组表达质粒pKG-NAS。将此重组表达载体质粒转化到大肠杆菌DH5α中,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-poly acrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)结果显示,烟碱酰胺合成酶基因在大肠杆菌中成功表达,表达的烟碱酰胺合成酶融合蛋白分子量大约为61 kDa。将初步的纯化产物作为免疫原去免疫新西兰大白兔制备兔抗烟碱酰胺合成酶血清,用蛋白免疫印迹法(western blot-ting)对制备的兔抗血清中的多克隆抗体进行了鉴定,显示该抗体具有较好的特异性。烟碱酰胺合成酶基因多克隆抗体的成功制备为检测该基因在草坪草中的表达提供了可靠的手段和技术平台,为进一步阐明该基因的作用机理奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2020,(6)
试验旨在表达、纯化扩展莫尼茨绦虫VASA蛋白,并制备兔抗VASA多克隆抗体。根据扩展莫尼茨绦虫全基因核苷酸序列设计特异性引物,利用PCR方法扩增vasa基因片段;将扩增产物与原核表达载体pET-22b(+)连接,获得重组质粒pET-22b-VASA;经Amp抗性筛选阳性菌,双酶切、PCR测序鉴定后,将其转化大肠杆菌(DE3)感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达;重组融合蛋白经镍柱纯化后,进行Western blot鉴定;将融合蛋白免疫兔,制备多克隆抗体。结果显示,重组质粒pET-22b-VASA构建正确,通过IPTG诱导获得大小约32 200的VASA重组融合蛋白;Western blot分析表明其与鼠抗His单克隆抗体呈阳性反应。纯化的VASA蛋白免疫兔获得了多克隆抗体,ELISA检测其效价为1∶128 000。本试验成功制备了具有免疫原性的VASA蛋白及其兔源多克隆抗体,为VASA蛋白生物学功能及该蛋白在绦虫体内的分布等研究奠定基础。 相似文献
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马γ-干扰素成熟蛋白基因在大肠埃希氏菌中表达及其多克隆抗体制备 总被引：5，自引：0，他引：5
采用RT-PCR从ConA刺激的马外周血单核细胞(PBMC)中扩增获得含信号肽的马γ-干扰素(Equine interferon-γ,EIFN-γ)基因,将其克隆至载体pCR2.1-TOPO中。通过PCR方法从重组质粒(pCR-EIFN-γ)中扩增马干扰素成熟蛋白(Mature EIFN-γ,reEIFN-γ)基因,并将其亚克隆至原核表达载体pET-28a( )。重组子经测序鉴定正确后转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,对其产物进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,将纯化后的表达产物免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。结果表明,mEIFN-γ基因全长为441bD,含一个开放阅读框,编码146个氨基酸的成熟蛋白;对其表达产物以可溶性和包涵体两种形式存在,重组蛋白相对分子量约为18Ku,且具有免疫反应活性。mEIFN-γ基因在大肠杆菌中高效表达并在非变性和变性条件下,采用Ni~ 亲和层析纯化方法均可获得高纯度的重组马γ-干扰素制备的多克隆抗体,为建立马γ-干扰素检测方法、监测机体免疫状态和研究机体免疫机制奠定了基础。 相似文献
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为获得山羊IFN-γ重组蛋白,提取山羊外周血淋巴细胞总 RNA,反转录得到 cDNA,以此为模板经PCR扩增获得IFN-γ的ORF区,构建重组克隆载体。经PCR扩增得到编码山羊IFN-γ成熟肽的基因序列,连入重组表达载体 pET-32a,转入 BL21（Codon Plus）感受态细胞中,测序并分析。重组表达载体经IPTG诱导后,对产物进行SDS-PAGE分析,并过镍柱纯化。用获得的纯化蛋白免疫家兔制备抗体。结果显示,编码山羊IFN-γ成熟肽部分的片段长432 bp;SDS-PAGE分析显示,融合蛋白大小约为34．9 ku,在30℃条件下,以0．3 mmol／L的IPTG诱导6 h,可得到大量可溶性表达的目的蛋白;间接 ELISA测定制得的多克隆抗体效价为1∶106。 相似文献