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[目的]建立通过山羊乳汁获取甜味蛋白Brazzein的方法.[方法]将前期工作中构建的Brazzein基因山羊乳腺特异表达载体STP-pBC1进行线性化,采用脂质体法转染山羊成纤维细胞,以期获得转基因阳性细胞.[结果]采用脂质体法转染山羊成纤维细胞后,通过最适G418浓度（400 μg/ml）筛选获得转基因阳性细胞;转基因阳性细胞形态呈现梭形且核仁清晰,其生长曲线呈现正常的“S”;转基因阳性细胞经冷冻复苏后,仍呈现与冷冻前新鲜转基因细胞相似的形态和生长曲线;PCR鉴定结果表明,STP-pBC1已整合入转基因细胞的基因组中.[结论]成功获得乳腺特异的转甜味蛋白基因Brazzein的山羊成纤维细胞株. 相似文献
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为改善山羊乳品质,创制乳汁中富含n-3不饱和脂肪酸的奶山羊育种新材料,首先构建了一种山羊乳腺特异性表达载体,以实现n-3不饱和脂肪酸合通路中4种脂肪酸合成酶基因(fat-1,fads2,elovl5和scd-1)的共表达。为初步验证该载体的有效性,通过脂质体法转染小鼠乳腺上皮细胞系C127,经G418筛选收集阳性C127转基因细胞,并对其进行反转录PCR(RT-PCR)检测。结果表明,4种基因均可在C127细胞转基因中表达。将该多基因共表达载体转染奶山羊成纤维细胞,通过G418筛选获得了稳定转染的细胞系。PCR结果显示,4个目的基因均成功整合到奶山羊成纤维细胞基因组中。总之,本研究成功构建了乳腺特异性共表达4种脂肪酸合成酶转基因载体及其山羊转基因细胞系,为创制乳腺特异性表达多不饱和脂肪酸的转基因奶山羊奠定了基础。 相似文献
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人Ⅰ型胶原基因脂质体转染牛耳细胞克隆筛选方法 总被引：1，自引：0，他引：1
构建连接有人Ⅰ型胶原基因的质粒(PGCl-collagen).利用脂质体介导的方法转染荷斯坦奶牛耳成纤维细胞,优化一系列转染条件以提高转染效率,再利用G418和GFP荧光的表达来筛选稳定转染的细胞,最后以末转染的成纤维细胞作为阴性对照组,PGCl-collagen作为阳性对照组对转染的细胞进行PCR验证.结果显示:在6孔培养板中细胞融合度达到50%～60%左右介导1～3μg重组质粒转染24 h,转染效率可达25%～30%,筛选单克隆细胞在荧光显微镜观察检测到绿色荧光蛋白的表达.在使用800U的G418筛选效果最好,维持浓度300～600U,获得25个稳定表达的阳性细胞系.从中选取6个克隆进行PCR验证.成功利用脂质体转染方法将人I型胶原基因成功转染到荷斯坦奶牛耳成纤维细胞,PCR验证结果正确. 相似文献
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[目的]构建刺激植物响应蛋白Epll基因的真核表达载体,筛选多拷贝酵母转化子.[方法]以深绿木霉（Trichoderma atroviride）ACCC30153的cDNA为模板进行PCR获得Epl1基因片段,并将目的片段插入表达载体pPIC9K的相应位置,获得重组表达载体,并将pPIC9K-Epl1转入毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中,并用不同中终浓度的遗传霉素G418筛选多拷贝重组酵母菌株.[结果]对重组载体进行PCR及双酶切检测为阳性;在含有终浓度为2 mg/ml遗传霉素G418的YPD平板上筛选得到7株多拷贝的转化子GS115-Epl1,经PCR鉴定1株转化子呈阳性.[结论]Epl1基因的我体构建及多拷贝酵母转化子筛选为以后大量分离纯化Epl1蛋白并研究其功能奠定基础. 相似文献
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利用DNA重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因MaSp1高度重复序列进行多次重组,人工构建成1.6 kb的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因Sil-E,DNA序列分析证明了人工基因序列的正确性.将家蚕L链基因启动子片段、L链cDNA、L链基因终止子融合在一起,构建成丝腺特异性表达单元.再与Sil-E融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元.将该表达单元克隆到转座子piggyBac的转基因载体中,获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体.采用显微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中.筛选转基因阳性个体,经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明目的基因整合到家蚕基因组中,为进一步研究家蚕作为生物反应器表达蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础. 相似文献
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《吉林农业科学》2014,(4):50-53
为利用核移植法获取转基因克隆猪提供供体细胞,体外分离培养猪胎儿成纤维细胞并进行了绿色荧光蛋白基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养猪胎儿成纤维细胞,绿色荧光蛋白表达载体以脂质法介导转染猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,利用荧光显微镜检测荧光蛋白的表达。结果表明,组织块贴壁后9 d可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9 d即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示荧光蛋白基因整合到细胞基因组中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,为下一步通过核移植方法获得转基因猪提供了基础。 相似文献
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【目的】通过体细胞核移植为获得皮肤特异表达蜘蛛拖丝蛋白的绵羊奠定基础。【方法】将pcDNA3.1和带有角蛋白结合蛋白启动子质粒pGM-T-KAP6.1分别用Bgl Ⅱ和Hin d Ⅲ双酶切后连接,再与蜘蛛拖丝蛋白基因核心序列4S连接,最后通过酶切与pIRES2-EGFP质粒连接后构建真核表达载体pIRES2-EGFP-4S;将此载体线性化后,采用脂质体法转染绵羊皮肤成纤维细胞,通过G418筛选获得转基因阳性细胞。【结果】筛选得到转pIRES2-EGFP-4S的阳性细胞。对阳性细胞经体外培养后的检测显示：（1）细胞形态（长梭形）、细胞生长曲线（呈S形）、群体倍增时间（随培养时间增加逐渐缩短）和细胞接种率（细胞贴壁率及存活率在24 h内逐渐升高,并达到最高值125%）等均具有正常绵羊成纤维细胞的生物学特征;（2）阳性细胞经冷冻复苏后具有与新鲜阳性细胞相似的生物学特征;（3）PCR检测结果显示,pIRES2-EGFP-4S在阳性细胞的基因组中整合。【结论】获得具有在绵羊皮肤特异表达,且便于检测的转蜘蛛拖丝蛋白4S的绵羊成纤维细胞株。 相似文献
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【目的】将前期构建的含有黑曲霉β-甘露聚糖酶基因manA的质粒p PSPBGP-manA转染杜洛克猪胎儿成纤维细胞,利用G418筛选出转基因细胞系,通过体细胞核移植方法生产出转manA基因猪,利用分子生物学方法对转基因猪进行阳性鉴定、基因及蛋白表达水平的检测,同时测定转基因猪唾液β-甘露聚糖酶酶活、粪便营养物质含量,旨在为生产及进一步研究转manA基因猪提供一些科学依据。【方法】用限制性内切酶Not I将质粒p PSPBGP-manA线性化并通过脂质体法将其转入杜洛克猪胎儿成纤维细胞,然后用不同浓度的G418进行筛选、维持培养,将筛选后的细胞进行体细胞核移植生产克隆猪;克隆猪出生后采取尾组织样用酚-氯仿法提取基因组DNA进行PCR及Southern blotting鉴定阳性转基因猪;收集转基因猪唾液并利用DNS法进行β-甘露聚糖酶活性测定,同时收集转基因猪粪便测定粪便中营养物质含量;取转基因猪的腮腺、颌下腺、舌下腺、心脏、肝脏等组织并用Triol法提取RNA,然后进行RT-PCR鉴定manA基因的表达,再进行相对定量PCR检测manA基因在不同个体及组织间的表达差异;通过Western blotting技术分析转基因猪外源性manA基因的蛋白表达水平。【结果】经G418筛选后进行PCR鉴定得到阳性转基因细胞系;通过体细胞核移植方法生产出21头克隆猪,经PCR及Southern blotting鉴定出16头转基因猪,阳性率为76%;转基因猪唾液中β-甘露聚糖酶的活性为(0.092±0.003)U·m L-1,粪便中粗蛋白含量明显降低;经RT-PCR、相对定量PCR鉴定,manA基因在转基因猪腮腺和舌下腺组织中特异表达,其它组织不表达,腮腺组织表达量高于舌下腺组织;Western blotting检测发现在腮腺和舌下腺组织中有manA的表达。【结论】通过G418筛选得到转manA基因细胞系并成功得到转manA基因猪,外源manA基因能够在转基因猪中腮腺和舌下腺组织特异性表达,为转manA基因猪的生产及进一步研究奠定了基础。 相似文献
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[目的]通过电转的方法,建立FKBP38细胞株.[方法]对自制的MEF细胞进行MMC处理,从而得到Feeder细胞,并在Feeder细胞上培养ES细胞.[结果]通过电转的方法,将FKBP38载体转入ES细胞中,经G418,Ganc筛选克隆和PCR检测,得到FKBP38阳性克隆.[结论] FKBP38 CKO胚胎干细胞株构建完成. 相似文献
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将已经通过体外验证能够有效抑制山羊痘病毒复制的shRNA转入山羊体细胞,构建其表达细胞系.将已经通过验证能够靶向抑制山羊痘病毒ORF095基因并有效抑制GTPV的pGPU6/GFP-ORF095-siRNA-70转染山羊原代成纤维细胞,经800μg/mL G418抗性筛选7～8d后,用含200μg/mL G418和10～15ng/mL EGF的培养基进一步单克隆化并将单克隆细胞扩大、传代培养,应用RT-PCR检测及测序鉴定所构建的细胞系.结果表明:本试验获得的1株成纤维细胞系基因组含有ORF095-siRNA-70表达框架,为进一步进行体细胞克隆转基因动物的制备和RNAi体内抗山羊痘病毒的研究奠定了基础. 相似文献
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【目的】构建新疆细毛羊MSTN基因慢病毒表达载体,研究其在细毛羊成肌细胞分化中的作用,并探讨其作用机制。【方法】采用RT-PCR技术,扩增MSTN编码区序列,克隆入plex-mcs慢病毒表达载体,构建plex-MSTN慢病毒表达载体,并进行酶切及测序鉴定。将plex-MSTN包装成plex-MSTN慢病毒。用酶消化法分离培养新疆细毛羊成肌细胞,慢病毒感染制备MSTN过表达成肌细胞系,通过马血清诱导分化,Western blotting检测分化细胞MSTN基因的表达,免疫荧光分析分化肌管的融合率及肌管直径,Realtime RT-PCR检测分化相关基因的表达。【结果】 克隆的新疆细毛羊MSTN基因编码区全长序列（1 128 bp）与NCBI上公布的序列99.9%同源,仅在外显子2上存在单碱基突变;Western blotting检测结果显示,MSTN过表达成肌细胞过表达MSTN蛋白;免疫荧光检测表明,MSTN过表达成肌细胞的肌管融合率与肌管直径分别为5.69%和12.35 μm,显著低于非转化成肌细胞（10.21%和18.5 μm）（P<0.05）;Realtime RT-PCR结果显示,MSTN过表达成肌细胞中的Myogenin、p21、MyoD-基因表达显著下调,Smad3基因表达极显著上调（P<0.01）。【结论】 成功构建了细毛羊MSTN基因慢病毒表达载体,MSTN基因对细毛羊成肌细胞的分化具有显著的抑制作用,确定了MSTN基因与Myogenin、p21、MyoD及Smad3基因在成肌细胞分化过程中的调控关系。 相似文献
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[目的]探讨VEGF基因在不同繁殖力绵羊母羊妊娠期不同阶段的子宫内膜表达规律及差异。[方法]以已妊娠的2.5岁的东北细毛羊和小尾寒羊为试验动物,利用手术法采集样品组织。通过提取检测样品组织总RNA,并对其进行PCR扩增、检测分析扩增产物研究了VEGF基因在妊娠期绵羊子宫内膜的表达规律及差异。[结果]VEGFmRNA在绵羊各妊娠期的子宫内膜均有强烈表达,随着妊娠的持续,表达量逐渐升高,妊娠后期与妊娠前期相比子宫内膜VEGF基因的mRNA表达有明显差异（P〈0.05）。小尾寒羊在妊娠各期子宫内膜上VEGF基因的表达水平均高于东北细毛羊,但差异不显著（P〉0.05）。[结论]该研究为阐明VEGF基因在绵羊妊娠发育过程中的作用机制提供了参考。 相似文献
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中国美利奴羊羊毛角蛋白组成的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
本文分析研究了中国美利奴羊新疆型与军垦型羊毛的角蛋白组成。通过尿素-变性凝胶电泳、SDS-凝胶电泳和双向电泳等的实验结果表明：中国美利奴羊新疆型和军垦型羊毛的角蛋白分别有16-21个主要组分，可分为低硫蛋白、高硫蛋白和高甘氨酸/酪氨酸蛋白三族，其表观分子量为59600-8200 Dalton，通过进一步对电泳凝胶光密度扫描测得，中国美利奴羊毛的角蛋白组成含量与澳州美利奴羊毛相近，与新疆细毛羊和军垦细毛羊羊毛比较，其高硫蛋白含量有明显增加，由于遗传因素引起的蛋白质组分的差异也主要表现于高硫蛋白中。 相似文献
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[目的]检验绵山羊双羔素的免疫效果,提高中国美利奴羊的繁殖率,增加养羊的经济效益。[方法]应用绵山羊双羔素(睾酮-3-羧甲基肟·牛血清白蛋白),在新疆维吾尔自治区巩乃斯种羊场和新疆生产兵团76团分别免疫中国美利奴新疆型羊841只和军垦型羊3 502只。[结果]新疆型试验组产羔率为143.68%,对照组产羔率为125.10%,试验组比对照组提高产羔率18.58%;军垦型试验组产羔率为120.27%,对照组产羔率为105.05%,试验组产羔率比对照组提高15.22%。[结论]绵山羊双羔素可以提高中国美利奴新疆型和军垦型羊的产羔率。 相似文献
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绵羊肉品质性状的测定与分析 总被引：3，自引：0，他引：3
[目的]分析绵羊的肉品理化性状,揭示绵羊肉品品质的内在特性。[方法]对德克萨尔羊、中国美利奴新疆军垦型和湖羊3个绵羊品种的背最长肌的肌肉失水率、肌内脂肪、水分、熟肉率、肌纤维密度及肌纤维直径进行测定和比较。[结果]德克萨尔羊的肌内脂肪含量最高,显著高于中国美利奴新疆军垦型和湖羊,德克萨尔羊的熟肉率极显著高于中国美利奴新疆军垦型和湖羊,失水率低于中国美利奴新疆军垦型和湖羊,水分各品种羊差异均不显著;德克萨尔羊肌纤维密度最大且极显著高于湖羊、显著高于中国美利奴新疆军垦型,湖羊肌纤维直径极显著高于中国美利奴新疆军垦型和德克萨尔羊。[结论]该研究为羊的肉质评定提供了理论依据。 相似文献
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【目的】研究绵羊核因子I/B （nuclear factor I/B,NFIB）基因的组织表达规律,并克隆中国美利奴羊（新疆军垦型）NFIB基因的全长编码区（coding sequence,CDS区）序列。【方法】采用半定量RT-PCR的方法分析NFIB基因的组织表达谱和皮肤表达特性,利用RT-PCR扩增绵羊NFIB基因的全长CDS区、克隆测序,并进行序列分析。【结果】①NFIB基因在绵羊多种内脏器官和皮肤组织中都有着不同程度的表达,且在皮肤组织中表达较高;NFIB基因在超细毛品系体表不同部位皮肤组织中的表达水平不存在显著性差异（P＞0.05）;同时在6个不同品系/品种绵羊体侧部皮肤组织中的表达水平也不存在显著性差异（P＞0.05）;超细毛品系绵羊皮肤组织NFIB基因的表达水平在不同季节存在显著性差异（P＜0.05）;②绵羊NFIB基因编码区至少存在3种剪接形式,其开放阅读框（open reading frame,ORF）的长度依次为1 263、1 128 和1 038 bp,分别编码420、375和345个氨基酸。【结论】中国美利奴羊（新疆军垦型）NFIB基因在皮肤组织中的表达量较高,其在超细毛品系羊体侧部皮肤组织中的表达量具有显著的季节性差异;绵羊NFIB基因至少可以编码3种不同的蛋白剪接体（protein isoform）。 相似文献
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克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4基因并稳定转染胎儿成纤维细胞 #br# 总被引：1，自引：1，他引：1
【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosin beta 4,Tβ4) 基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM 2 000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】 克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142 bp,其中包含135 bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β4(XM002706880.1)同源性为100%。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和Tβ4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。【结论】克隆得到内蒙古白绒山羊Tβ4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β4基因绒山羊提供了条件。 相似文献
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中国美利奴羊(新疆型)皮肤组织GAPDH基因实时荧光定量PCR方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】建立GAPDH内参基因实时荧光定量PCR方法,为进一步研究中国美利奴羊(新疆型)相关基因的定量表达奠定基础。【方法】采用中国美利奴羊(新疆型)皮肤组织为试材,根据Genebank中绵羊GAPDH基因序列,设计并合成一对引物,建立基于SYBR Green I染料技术的Real-Time PCR检测体系,绘制出标准曲线并对其熔解曲线分析。【结果】以cDNA为模板建立的标准曲线循环阈值(Ct)与标准cDNA模板在一定浓度范围内呈良好的线性关系,GAPDH基因标准曲线中模板拷贝数(X)与Ct值的关系为Ct=一3.679 51g/X+35.648,相关系数R=0.999 8;试验重复性好,批内和批间变异系数(CV%)分别为0.22%～3.45%和1.30%～4.89%。【结论】所建立的方法具有快速、线性范围广、重复性强等特点,GAPDH可作为内参基因用于绵羊相关基因的定量表达研究。 相似文献