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新兴猪γ-干扰素基因克隆及其真核表达质粒的构建 总被引：4，自引：3，他引：1
为研发猪γ-干扰素(interferon-gam-ma,IFN-γ)制剂,根据已发表的猪IFN-γ基因序列设计一对引物,应用RT-PCR技术从3周龄新兴猪脾细胞中扩增出约500 bp的基因片段;将其片段连接到pMD18-T载体,经PCR、酶切及序列测定表明,该基因片段由501个核苷酸组成,共编码166个氨基酸,与NCBI GenBank上登载的猪IFN-γ基因序列完全一致。新兴猪IFN-γ基因的成功克隆及真核表达质粒的构建,将为进一步研发猪干扰素制剂奠定了基础。 相似文献
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根据GenBank中收录的三种猪Ⅰ型干扰素（porcine interferon,pIFN）基因序列,设计了3对特异性引物。运用RT—PCR技术从长白猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到了三种猪干扰素基因,并将其克隆至pGEM-T Easy载体上。序列测定结果显示,获得的猪干扰素α1基因序列全长570bp,编码189个氨基酸,获得的猪干扰素α2基因序列全长540bp,编码179个氨基酸,获得的猪干扰素β基因序列全长563bp,编码186个氨基酸。三种猪Ⅰ型干扰素基因与已知猪Ⅰ型干扰素核苷酸序列和氨基酸序列的相似性最高可达99％～100％。 相似文献
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根据Genβank发表的序列,应用DNAstart分析软件设计并合成一对引物用于扩增水貂β干扰素（IFN—β）基因,从病死水貂的脾脏中提取总RNA,RT—PCR扩增水貂β干扰素基因,获得了约561bp片段,将其克隆到pEasy—T1载体中,进行序列分析,证实该基因是水貂β干扰素基因。将测序结果与GenBank发表的雪貂（EF581890．1）的IFN—β基因序列进行比较,核苷酸序列同源性为100．0％,氨基酸同源性为100．0％。同时将核苷酸序列、氨基酸序列与其他几种犬科动物进行遗传进化分析,其同源性分别在83．0％～100．0％之间和69．4％～100．0％之间。 相似文献
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猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测 总被引：4，自引：0，他引：4
GM-CSF在机体免疫系统中发挥重要的免疫调节作用.用PHA与LPS体外联合刺激猪外周血单个核细胞,采用RT-PCR技术成功克隆了猪GM-CSF基因.序列分析表明,该序列与NCBI/GenBank上登载的序列有两个碱基不同;将猪与人、牛、羊、狗、猫、鼠等动物的GM-CSF基因序列相比较,其一致性分别为82.1%、85%、88.1%、82.8%、83.7%、70.5%,在氨基酸水平上一致性为70.3%、70.9%、78.1%、70.3%、71.9%、54.4%.然后利用生物信息学和分子生物学软件,对猪GM-CSF的结构进行预测,结果表明,猪GM-CSF为一结构松散的球状蛋白分子.猪GM-CSF基因的成功克隆及其编码蛋白结构的预测为开发高效、低毒且性质稳定的猪GM-CSF产品奠定了基础. 相似文献
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为研究猪附红细胞体MSG1基因的遗传变异特点,从上海地区3个屠宰场采集自然感染附红细胞体的猪血液,提取基因组DNA,根据GenBank已经发表的猪附红细胞体MSG1基因序列(登录号AM407404.1),设计引物进行PCR扩增,将扩增产物连接到pMD18-T载体上,进行序列测定和分析.结果共获得了82条猪附红细胞体MSG1基因序列,序列长度为1 011 bp,共编码336个氨基酸.同源性分析显示与GenBank中已经发表的猪附红细胞体MSG1基因核苷酸序列相似性为96.5％～98.3％,氨基酸的相似性为97.9％～99.1％0.MSG1基因核苷酸序列的系统进化分析表明,上海地区猪附红细胞体分离株与GenBank登录的德国54/96分离株序列的亲缘关系较远. 相似文献
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根据GenBank中牛干扰素-β1(IFN-β1)基因序列(E00137),设计并合成了1对引物,以梅花鹿肝脏组织DNA为模板,采用PCR技术扩增梅花鹿IFN-β1全基因,并克隆、测序。结果表明:梅花鹿IFN-β1基因全长561 bp,编码186个氨基酸,含有6个与二硫键形成有关的半胱氨酸,3个糖基化位点,成熟蛋白含有4个α螺旋,3个β折叠区,7个β转角。序列比较分析发现,梅花鹿IFN-β1基因序列与GenBank发表的23种IFN-β1基因核苷酸序列同源性为3.2%91.1%,氨基酸序列同源性为21.9%91.1%,氨基酸序列同源性为21.9%79.7%。梅花鹿与其他23种动物的IFN-β1基因序列分析和系统进化树分析表明,IFN-β1基因存在种属特异性。梅花鹿INF-β1基因的成功克隆,为进一步研究梅花鹿INF-β1基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。 相似文献
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从猪肝脏中提取基因组DNA,利用PCR法直接扩增了猪β干扰素成熟蛋白编码基因。将PCR产物亚克隆至pGEM-7Zf( )载体,转化入大肠埃希菌TG1,筛选出阳性菌株后进行测序。序列分析结果表明,克隆片段含编码猪β干扰素成熟蛋白质的495个核苷酸,与GenBank上(登录号:S41178)的序列同源性达到100%。在此基础上,构建了猪β干扰素原核表达载体pQE30/poIFN-β并转化入大肠埃希菌M15。该工程菌在37℃经0.03mmol/LIPTG诱导4h后,进行SDS-PAGE电泳,结果在分子质量约20ku的位置出现了明显的目的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在。经凝胶分析软件Bandscan分析,表达产物约占菌体总蛋白的18%。包涵体用6mol/L盐酸胍溶解,经过Ni-NTA亲和层析法纯化,获得了纯度较高的目的蛋白,为下一步对猪β干扰素进行复性及活性研究打下了基础。 相似文献
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根据GenBank中猪源输血传播病毒Ⅱ型（Swine torque teno virus genogroupⅡ,TTVⅡ）基因序列设计并合成了1对特异性引物,扩增468bp目的片段。将PCR扩增产物测序,结果与GenBank中猪TTVⅡ型基因序列同源性为95%。利用该方法对猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪链球菌、猪多杀性巴氏杆、猪霍乱沙门菌和大肠杆菌等病原核酸进行扩增,均无条带出现,表明该方法具有较高的特异性。该方法的灵敏性试验表明,最低能检测到10.2pg核酸。利用所建立的PCR方法检测来自我国华南地区192份临床样品,阳性率为21.4%（41/192）。 相似文献
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为了提高猪的抗病毒性,试验以三元猪(杜×长×大)为试验动物,提取猪肝脏的DNA,利用特异性引物PCR扩增三元猪β干扰素(IFN-β)基因,将其克隆到pGEM-T Easy质粒载体上,菌液PCR鉴定重组质粒后进行测序鉴定,同时对IFN-β进行了全面的生物信息学分析。结果表明:经PCR扩增获得了IFN-β全基因序列,其长度为682 bp;生物信息学分析显示三元猪IFN-β基因的开放性阅读框编码186个氨基酸残基,前21个为信号肽;三元猪IFN-β蛋白分子质量为21.97 ku,等电点为4.89;三元猪IFN-β与已报道的其他猪的IFN-β氨基酸序列具有较高的相似性;三元猪和马首先聚类,其次是人和猴,与鸡的同源性最低;三元猪IFN-β蛋白具有IFN-αβ的匹配区域,同时含有IFN-αβ受体复合物两个跨膜亚基IFNAR-1和IFNAR-2的结合位点,预测IFN-β蛋白属于IFN-αβ超家族。 相似文献
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为了克隆甘肃合作猪白细胞抗原(SLA)DRA和DRB基因,分析SLA-DR基因特性和抗原多态性,首次研究了甘肃合作猪在异种移植等研究领域中的应用前景.应用RT-PCR分别扩增合作猪SLA-DRA和SLA-DRB基因并进行测序,将所获得基因序列登录GenBank(登录号分别为FJ905823和FJ9058258),再用NCBI中的BLAST和ExPASy等相关软件进行生物信息学分析.发现在猪-人异种移植中,近亲繁殖的合作猪种在与人类主要组织相容性复合体遗传基因水平相似性方面有一定优势,也可作为备选猪种对相关基因进行必要的修饰和改造. 相似文献
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根据已发表的AY687281基因序列,设计1对特异性引物,采用PCR方法从长白猪白细胞基因组中扩增到猪β干扰素基因,将PCR产物克隆到pMD18-T载体,进行序列测定。序列分析表明,获得的猪β干扰素基因全长561bp,编码186个氨基酸,与GenBank中AY687281基因序列同源性达99.2%,在28、34、128位核苷酸发生了点突变,由G变为A,由C变为G,由A变为G,由C变为T,导致10、12、43位氨基酸由A变为T,L变为V,E变为G,而在177位点核苷酸的突变没有改变氨基酸。将该基因克隆到pEGX-4T-1表达载体中,转化宿主菌Rosetta,对猪β干扰素进行原核表达。重组表达菌经IPTG诱导后,得到高效表达,所表达蛋白约为43 000,占总蛋白的39.3%,表达产物主要为包涵体。纯化后的包涵体具有抗病毒的生物学活性,能抑制口蹄疫病毒（FMDV）增殖。 相似文献
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首先提取采自甘肃玛曲的皮蝇一期幼虫的总RNA,合成cDNA,根据设计的特异引物,利用PCR技术扩增出Hypodermin A(HA)基因片段,将此片段与PGEM-T Easy载体连接,构建克隆载体PGEM-HA,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,进行测序与分析。结果表明,扩增的HA基因长678bp,编码229氨基酸。克隆到的基因序列与NCBI GenBank上登陆的皮蝇HA基因序列核甘酸同源性为96.6%,推导氨基酸同源性达97.8%。该基因的成功克隆为其进一步表达打下了坚实的基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2014,(8):1261-1266
利用THB(Todd-Hewitt Broth)固体培养基和色素试验培养基选择培养无乳链球菌,参照GenBank中无乳链球菌参考菌株(Accession:AF015927.1、JQ289582.1)16SrRNA和种属特异性基因cfb(CAMP因子)序列设计引物,对奶样中分离的12株疑似无乳链球菌进行鉴定。结果显示,经PCR扩增后,被检测的12株细菌均可扩增出预期大小的16S rRNA基因序列,而12株中有8株可以扩增出预期大小的cfb基因序列,条带单一,特异性好。序列BLAST显示,12株菌的16S rRNA基因序列与NCBI上报道的无乳链球菌相应序列高度同源(>99.0%),各分离菌株间的16S rRNA基因序列也高度同源(99.0%～100.0%);cfb基因序列与NCBI上已报道的无乳链球菌相应序列具有高度同源性(>99.0%),各菌株间cfb基因序列也高度同源(100.0%)。经选择培养与PCR鉴定结果可以确定12株疑似菌株中有8株为无乳链球菌。 相似文献
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根据GenBank上发表的牛干扰素γ基因序列设计引物,从牛外周血淋巴细胞中提取基因组RNA,采用RTPCR技术,扩增出干扰素γ基因并进行序列分析。琼脂糖凝胶电泳显示牛干扰素γ扩增片段约为500bp。序列分析结果表明,牛干扰素γ基因序列全长517bp,开放阅读框架内501个核苷酸,共编码166个氨基酸,分子质量19.4ku,与参考序列完全一致。克隆序列经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切后连接到经同样双酶切的PBV220质粒中,转化入大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆进行温度诱导表达,经SDSPAGE分析,在约19.4ku处有表达的蛋白带,表达产物经免疫荧光染色鉴定为阳性。 相似文献