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根据GenBank中猪源输血传播病毒Ⅱ型(Swine torque teno virus genogroupⅡ,TTVⅡ)基因序列设计并合成了1对特异性引物,扩增468bp目的片段。将PCR扩增产物测序,结果与GenBank中猪TTVⅡ型基因序列同源性为95%。利用该方法对猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪链球菌、猪多杀性巴氏杆、猪霍乱沙门菌和大肠杆菌等病原核酸进行扩增,均无条带出现,表明该方法具有较高的特异性。该方法的灵敏性试验表明,最低能检测到10.2pg核酸。利用所建立的PCR方法检测来自我国华南地区192份临床样品,阳性率为21.4%(41/192)。 相似文献
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含绿色荧光蛋白基因的猪细小病毒病-伪狂犬病重组病毒的构建 总被引:6,自引:2,他引:6
将扩增得到的PPV SC-1株VP2基因产物插入转移载体质粒pPI-2.EGFP中,构建了含PPV VP2基因及其EGFP报告基因的PRV基因缺失表达载体质粒pPI-2.EGFP.VP2。采用磷酸钙转染系统,将pPI-2.EGFP.VP2 DNA和PRV DNA共转染Vero细胞后通过直接荧光观察、Dot-blot核酸杂交筛选得到几株重组病毒,将其中一株(命名为SA215-B)DNA用BamHI酶切和Southern转印杂交进一步验证重组病毒构建成功,并通过SDS-PAGE电泳和Western免疫印迹检测表明PPV VP2基因在重组病毒内获得表达,产生大小约93ku的融合蛋白,同时融合蛋白中的PPV VP2结构蛋白仍然保持了原有的反应原性,表明成功构建了含绿色荧光蛋白基因的猪细小病毒病-伪狂犬病重组病毒。 相似文献
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ORF3基因缺失对猪圆环病毒Ⅱ型感染复制能力的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
设计1对特异性引物AF-P1/AF-P2,从疑似PCV2感染的病料中扩增获得1 767 bp的PCV2全基因组(命名为PCV2-CD),克隆至pMD18-T Simple载体构建重组质粒pTS-PCV2-CD.序列分析表明:PCV2-CD与GenBank中公布的12个PCV2毒株间的同源性高达95.0%~100%.用Nco Ⅰ酶切pTS-PCV2-CD获得4 459 bp线性目的DNA片段,补平CATG 4个碱基、连接环化构建ORF3基因插入缺失重组质粒pTS-PCV2-CD-C并测序.用Sac Ⅱ酶切pTS-PCV2-CD-C.回收1 771 bp线性目的片段,体外连接环化构建了ORF3基因缺失突变毒株mPCV2-C.PCR-RFLP检测表明,在脂质体转染法转染mPCV2-C、培养并盲传4代的IBRS-2细胞中(PCVl阴性),特异性检测到mPCV2-C的DNA;电镜观察发现,在盲传6代的IBRS-2细胞胞核内观察到突变毒株的病毒颗粒.试验结果表明:ORF3基因缺失突变毒株mPCV2-C具有感染性,能够在IBRS-2细胞中复制增殖,证实ORF3基因不是PCV2复制的必需基因. 相似文献
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通过在病毒培养液中添加胰酶的方法,从仔猪腹泻粪样中分离并鉴定了1株能在Vero细胞上稳定产生CPE,并以细胞颗粒增多、肿胀、漂落为特征的猪呼肠孤病毒SC-A株。在感染细胞中,病毒胞浆包涵体及特征性微管样结构明显,病毒粒子多呈典型的晶格状排列,大小约70 nm。S2基因的克隆测序结果表明,SC-A S2全基因(DQ396805)大小为1 331 bp,其开放阅读框编码一个由418个氨基酸组成,相对分子量约为47 140的σ2蛋白;与标准株T1L、T2J、T3D的核苷酸序列和推导氨基酸序列的同源性分别为86.9%、76.7%、85.4%及94.6%、93.3%、98.3%。以σ2氨基酸序列构建的进化树分析显示,标准株及野外分离株可被划分为A(T3)、B(T2)、C(T1)3个群;除T3C31外,其余3型野外分离株及SC-A株和所有血清1型均位于C群中。 相似文献
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参考Genebank上收录的PUR46-MAD株(NC-002306)、TS株(DQ201447)和Purdue-115株(Z34093)核苷酸序列,设计并合成16对引物,应用RT-PCR技术成功地分16个片段扩增了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)SC-Y株全长基因组序列,将这16个基因片段克隆,并测定其核苷酸序列.应用生物软件BioEdit对各测序结果进行序列拼接,确认SC-Y株基因组全长cDNA 28590 bp(GenBank收录号DQ443743),共包含7个开放阅读框.基因组5'端非编码区长315 nt,3'端非编码区长277 nt.与Miller M60株、Miller M6株和TS株相比,SC-Y株S基因缺失6个碱基.通过构建结构蛋白基因(S、sM、M和N)系统进化树,结果表明,SC-Y株可能与美国Purdue株来源于共同的祖先病毒.密码子偏爱性分析结果认为猪传染性胃肠炎病毒对以T和A结尾的密码子表现轻微的偏爱性,病毒基因表达选择酵母等真核系统可能更为合适. 相似文献
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猪细小病毒SC-1株VP2基因的克隆及生物信息学分析 总被引:5,自引:0,他引:5
根据PPVNADL-2株基因组序列设计了一对引物,以复制型DNA为模板,通过PCR扩增出长约2.0kb的DNA片段,将其插入克隆载体质粒pUC19,构建重组质粒pPVP2,测序显示PPV-SC-1VP2基因全长1740bp,共编码579个氨基酸。多序列比对结果显示,猪细小病毒VP2基因保守性强,仅存在个别的差异;密码子偏向性分析结果表明,PPV-SC-1VP2基因在同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定的偏向性,并且与PPV-SC-1NS1在密码子的偏向性上具有相同的属性,主要偏向于使用以A结尾的密码子;氨基酸疏水性分析表明,PPV-SC-1VP2蛋白在77~82、291~304、362~373、400~411、465~477等位点存在较明显的亲水区段;跨膜区结构分析显示该蛋白不存在显著意义的跨膜区;分析该蛋白的抗原位点可能位于60~68、81~88、266~275、351~357、398~404位点处。 相似文献