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金黄色葡萄球菌粘附素Fnbp A功能区基因的克隆和原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】克隆和表达奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌纤连蛋白连接蛋白A(Fnbp A)的功能基因。【方法】采集奶牛急性乳腺炎乳样,分离金黄色葡萄球菌,提取其DNA作为模板,利用设计合成的特异性引物,对金黄色葡萄球菌进行FnbpA功能基因的PCR扩增。回收目的基因并连接到T载体,鉴定后进行测序,然后将FnbpA基因连接到pET-32a(+)质粒中,经鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导后采用SDS-PAGE分析蛋白质的表达情况。【结果】PCR产物经电泳成像,仅金黄色葡萄球菌在1.7 kb处出现特异性条带,测序发现其与GenBank公布的FnbpA序列的同源性为98%;蛋白诱导表达SDS-PAGE分析发现,在80 ku处出现特异性条带。【结论】试验成功地克隆到FnbpA基因,并在大肠杆菌中获得高效表达,蛋白量为33.4%,为进一步研究金黄色葡萄球菌粘附素基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献
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【目的】建立牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌的双重PCR检测方法。【方法】根据布鲁氏菌IS711序列和单增李斯特菌毒力因子HlyA序列设计并合成引物,建立双重PCR检测方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检测,并制备污染模型乳,通过直接检测、增菌后检测、细菌富集后增菌检测,确定最低检测限。【结果】建立了牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌双重PCR检测方法,该方法特异性好、敏感性高、可重复性好。布鲁氏菌和单增李斯特菌单PCR检测最小DNA质量浓度分别为0.282和3.33 pg/μL,双重PCR检测最小DNA质量浓度分别为2.82和33.3 pg/μL。感染模型乳不经过增菌,布鲁氏菌和单增李斯特菌最低检测限分别为104和8×104CFU/mL;经过24h增菌,就可以检测到10 CFU/mL的布鲁氏菌,经过12 h增菌,就可以检测到8 CFU/mL的单增李斯特菌;经过离心法富集细菌后再增菌,灵敏度可以扩大40~50倍,布鲁氏菌经24 h增菌后最低检测限为10 CFU/40 mL,单增李斯特菌经12 h增菌后最低检测限为8 CFU/40 mL。【结论】建立的双重PCR检测方法特异、灵敏、可重复,可单独或同时检测牛奶中的布鲁氏菌和单增李斯特菌,也可以用于其他产品中布鲁氏菌和单增李斯特菌的检测。 相似文献
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【目的】建立一种特异、灵敏的牛源幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)检测方法,为家畜感染幽门螺杆菌的流行病学调查鉴定提供支持。【方法】分别选取Hp的16SrRNA、UreA、glmM为靶基因设计特异性引物,以H.pylori动物模型适应菌株SS1株为标准菌株建立PCR检测方法,并进行PCR条件优化,运用所建立的最优PCR方法检测临床奶牛乳样和粪样中Hp的分布情况。【结果】PCR特异性试验结果显示,仅Hp SS1株能扩增出特异性条带,而对照菌株金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌及蜡样芽孢杆菌均无扩增条带。PCR灵敏度试验结果显示,16SrRNA、UreA、glmM基因在乳样中的最低检出浓度分别为101,103和103CFU/mL,在粪样中的最低检出浓度分别为101,104和104 CFU/mL。应用该PCR方法对采集自规模化养殖场及散养的共计41头奶牛的乳样和粪样进行检测,成功检出Hp DNA,靶基因16SrRNA、UreA和glmM序列与NCBI上所发表的J166和ATCC43504菌株序列的同源性均达98%以上。【结论】成功建立了特异、灵敏的牛源Hp的PCR检测方法,可以应用于临床奶牛乳样和粪样中Hp的检测。 相似文献
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奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌凝固酶基因型研究 总被引：3，自引：3，他引：0
【目的】了解上海和贵州地区引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌凝固酶基因型情况,为奶牛乳房炎的防治提供理论依据。【方法】利用16S rRNA保守序列设计引物,PCR扩增鉴定金黄色葡萄球菌,并利用凝固酶基因及其酶切产物多态性对分离鉴定出的金黄色葡萄球菌进行了凝固酶基因分型。【结果】共鉴定出78株金黄色葡萄球菌,有74株金黄色葡萄球菌扩增凝固酶基因片段,分为5个基因型和两个亚型。PCR 1型为贵州地区优势基因型,PCR 3型为上海地区优势基因型。【结论】两地区各基因型菌株分布比例有显著的地域性差异,这与两地区地理环境和养殖水平差异对病原流行传播的影响有关。 相似文献
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【目的】建立快速检测狐阴道加德纳氏菌的PCR诊断方法。【方法】根据阴道加德纳氏菌16S rRNA基因序列设计1对特异性引物,以分离的狐阴道加德纳氏菌菌体DNA为模板进行PCR扩增,建立狐阴道加德纳氏菌的PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性及其可行性进行检验。【结果】特异性试验结果表明,狐阴道加德纳氏菌能扩增出437 bp的特异性核酸片段,而大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,PCR的最低检出限量为500 mL-1。利用建立的PCR检测方法,对9株从山东省不同地区分离的疑似狐阴道加德纳氏菌菌株进行检测,结果有4株为阳性。【结论】研究建立的狐阴道加德纳氏菌PCR快速诊断方法,敏感性高、特异性强,可1次检测多个样品。 相似文献
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优化金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取方法 总被引：1，自引：1，他引：0
为提取金黄色葡萄球菌DNA,比较了酶解法、丙酮-酶解法、玻璃珠机械法等破壁方法,确定玻璃珠破壁法为最优提取方法。该方法无需对样品进行增菌,可直接从乳品中提取金黄色葡萄球菌DNA。 相似文献
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多重PCR快速检测食品中的单核细胞增生性李斯特菌 总被引：4，自引：0，他引：4
【目的】通过对检测食源性致病菌单核细胞增生性李斯特氏菌(LM)的多重PCR体系的优化,建立一种能够在食品样品中应用的四重PCR。【方法】采用热裂解提取菌液和菌落DNA,以16SrRNA、inlAB、iap、hly基因为靶基因设计引物,从影响多重PCR扩增的引物浓度、退火温度进行优化。【结果】通过其它5种同属异种菌即英诺克李斯特氏菌、西尔李斯特氏菌、威尔西李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌及副溶血性弧菌均未扩增出特异性的片段。纯培养物的最低检测限为102CFU/mL,模拟污染的生猪肉检测限不大于0.4CFU/g。【结论】通过菌落获得DNA的多重PCR方法更好,该方法具有敏感、特异、快速及准确的优点,可用于食品中LM的快速检测。 相似文献
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沙门氏菌内标PCR快速检测试剂盒的研制与应用 总被引：4，自引：1，他引：3
【目的】研制一种能有效指示假阴性的PCR检测产品,用于沙门氏菌快速、准确、灵敏的检测。【方法】针对沙门氏菌invA基因、stn基因序列分别设计引物与扩增内标,建立添加扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法,组装试剂盒,并对试剂盒的各项性能进行评价。【结果】试剂盒对147株沙门氏菌和28株非沙门氏菌的检测结果显示,所有沙门氏菌均能扩增出362 bp的目标条带,非沙门氏菌仅扩增出520 bp的内标条带。试剂盒检测沙门氏菌基因组DNA的检测限为8.0 fg/PCR,检测染菌量为4—5 CFU/10 mL的牛奶样品,增菌8—10 h即得到阳性结果。反复冻融60次或-20℃下贮存1年,均不影响试剂盒的使用效果。对食品样品的检测结果显示,阳性检出率为2/30,与国标法的检测结果相符,比未添加扩增内标的PCR检测结果（阳性检出率为1/30）准确。【结论】采用添加扩增内标的PCR试剂盒检测沙门氏菌,特异性强、灵敏度高、稳定性好,并能有效指示假阴性,提高检测的准确性,适用于食品中沙门氏菌的快速筛检。 相似文献
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食品中金黄色葡萄球菌DNA环介导恒温扩增快速检测方法的建立与应用 总被引：5，自引：0，他引：5
【目的】金黄色葡萄球菌是一种人畜共患病的重要致病菌,主要经食品传播,引起食物中毒、组织及器官的化脓性炎症,建立快速、准确的检测方法对预防和控制金黄色葡萄球菌的传染具有重要意义。【方法】DNA环介导恒温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是一种新颖的快速、高灵敏核酸扩增技术,本研究利用该技术建立金黄色葡萄球菌LAMP检测方法。基于金黄色葡萄球菌高度保守的Sa442基因序列,设计4条特异性LAMP扩增引物,两条外引物F3和B3及两条内引物FIP和BIP,在BstDNAPolymerase作用下,65℃恒温水浴中,对26个种类共45株细菌进行扩增,所试的20株金黄色葡萄球菌均为LAMP阳性,说明所设计的LAMP引物具有高度特异性。【结果】本LAMP方法对纯培养的金黄色葡萄球菌检测灵敏度为25CFU/mL,对污染食品中金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为42CFU/g,40—60min内即可完成检测。检验检疫实践证明,利用本LAMP方法对958份肉类、蛋奶及其制品、人工污染样品等进行检测,检出115份LAMP阳性,与国标法(GB)检测结果一致。【结论】本LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。 相似文献
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为研究食源性金黄色葡萄球菌中MRSA及对氨基糖苷类庆大霉素、卡那霉素抗生素的耐药性情况,并建立快速检测鉴定金黄色葡萄球菌耐药性多重PCR方法。对金黄色葡萄球菌进行增菌培养,并提取DNA作为模板,以nuc基因作为菌属鉴定基因,mecA基因作为MRSA检测基因,aac(6')-aph(2')及aph(3')-Ⅲa基因作为耐氨基糖苷类庆大霉素、卡那霉素和妥布霉素的检测目的基因,建立四重PCR检测方法并进行特异性及灵敏度评价;利用所建立的方法检测19株金黄色葡萄球菌的分离株。结果表明:对19株金黄色葡萄球菌分离株的PCR检测结果与纸片扩散法的检测结果一致。所建立的多重PCR方法灵敏度高、特异性好,可以快速检测出MRSA,并对氨基糖苷类庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素耐药菌株检测具有较高的准确率。 相似文献
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Detection of Staphylococcus aureus in Dairy Products by Polymerase Chain Reaction Assay 总被引：1，自引：0，他引：1
YANG Yang SU Xu-dong YUAN Yao-wu KANG Chun-yu LI Ying-jun ZHANG wei ZHONG Xiao-ying 《中国农业科学(英文版)》2007,6(7):857-862
A polymerase chain reaction （PCR） assay was employed for direct detection of Staphylococcus aureus without enrichment in dairy products. A solvent extraction procedure was successfully modified for the extraction of Staphylococcus aureus DNA from artificially contaminated whole milk, skim milk, and cheese. A primer targeting the thermostable nuclease gene （nuc） was used in the PCR. A DNA fragment of 279 bp was amplified. The PCR product was confirmed by DNA sequencing. In this study, the PCR, GB-4789.10-94, Perifilm RSA.Count Plate, and Baird-Parker ＋ RPF Agar were compared. The sensitivity of the PCR was 10 CFU mL^-1 of whole milk, skim milk, and 55 CFU g^-1 of cheese. The developed methodology allowed for detection of Staphylococcus aureus in dairy products in less than 6 h. The time taken for the development of this PCR assay was 12-24 h, less than the time taken by the general PCR assay using the enrichment method, and the coincidence rate of this developed PCR was 94.3%, the sensitivity was 100%. It was a rapid, sensitive, and effective method for PCR to detect Staphylococcus aureus in milk and milk products. 相似文献
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PCR法检测水中金黄色葡萄球菌肠毒素A基因 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]建立一种快速准确检测水中金黄色葡萄球菌肠毒素A的方法。[方法]将金黄色葡萄球菌模拟污染的水增菌后提取菌体DNA,以沙门氏菌、大肠杆菌DNA和空白作对照,用PCR法扩增金黄色葡萄球菌肠毒素A基因。[结果]金黄色葡萄球菌DNA的检测结果呈阳性,检测底限达100 cfu/L,而大肠杆菌和沙门氏菌及空白对照均未出现特异性片段,整个检测过程只需要24 h。[结论]试验建立的PCR方法可检测水及类似食品中的金黄色葡萄球菌SEA基因,并具有特异性强、灵敏度高、速度快和易操作的特点。 相似文献
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新疆牛源金黄色葡萄球菌抗菌素敏感性调查 总被引：2，自引：0，他引：2
[目的]了解新疆奶牛乳房炎中金黄色葡萄球菌的药物敏感性情况,为该病治疗的临床用药提供参考。[方法]2009年以来对乌鲁木齐市、昌吉、呼图壁、奎屯、伊犁和库尔勒6地区16个奶牛养殖场乳房炎奶样分离金黄色葡萄球菌,用纸片扩散法进行抗菌素敏感性检测。[结果]共分离143株金黄色葡萄球菌,临床药敏试验显示,新疆70%以上分离株对红霉素、青霉素、复方新诺明、多西环素、四环素耐药,40%的菌株对氯霉素、环丙沙星和庆大霉素耐药;并且67.1%菌株同时对5种以上抗菌素耐药,10.5%的菌株对所测试的10种抗菌素耐药。此外,发现了19.6%的牛源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。[结论]新疆奶牛乳房炎病例中的金黄色葡萄球菌对当前临床上允许使用的多种类型的抗菌素呈现严重的多重耐药,使用抗菌素进行奶牛乳房炎的防治难以取得理想的疗效。这类菌株的存在和蔓延将对新疆奶牛养殖业的健康发展和奶制品的安全构成威胁,建议在选择奶牛乳房炎治疗的抗生素时,应以流行菌株的耐药性为依据。 相似文献
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【目的】空肠弯曲菌是一种重要的人畜共患病致病菌,主要经被污染的水源、乳制品、生禽肉进行传播,建立快速、准确的诊断方法是防控空肠弯曲菌感染的重要措施。【方法】本文引入一种新型的核酸检测技术--DNA环介导恒温扩增 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP),以空肠弯曲菌ORF-C序列为检测靶基因,建立了空肠弯曲菌LAMP快速检测方法。【结果】利用本LAMP方法对21种病原菌进行检测,仅空肠弯曲菌为阳性结果,说明该方法具有高度的特异性。该LAMP方法对空肠弯曲菌纯培养菌的检测灵敏度达6CFU/反应管,对污染材料中空肠弯曲菌的检测灵敏度为9CFU/反应管。【结论】本研究建立的空肠弯曲菌LAMP检测方法操作简便、检测快速,具有良好的实用性。 相似文献
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食品中4种肉类成分多重PCR的快速鉴别方法 总被引：12，自引：2，他引：10
【目的】建立快速可靠的用于食品中4种肉类（猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉）成分快速鉴别的通用引物多重PCR（universal primers-multiplex PCR,UP-M-PCR）方法。【方法】使用DNeasy试剂盒提取法、SDS-蛋白酶K法和CTAB-蛋白酶K法分别提取肉类中总DNA,通过比较提取效率和纯度,确定提取肉类中总DNA的方法;基于动物线粒体细胞色素b基因的差异性位点,设计两组各5条长度不同的多重PCR引物,建立并优化多重PCR反应体系,通过电泳检测扩增产物分子量差异实现4种肉类的快速鉴别;应用优化的多重PCR方法对80份市售食品样本进行盲样检测,验证鉴别方法的准确性。【结果】SDS-蛋白酶K法与DNeasy试剂盒提取法的DNA效率显著优于CTAB-蛋白酶K法;在优化的反应条件下,选择特异性高、序列较长的多重PCR引物可有效地进行食品中猪、牛、羊和鸡源性成分的快速鉴定,检测灵敏度达到皮克级DNA;对市售食品样本的鉴别验证了方法的实用价值。【结论】多重PCR方法精确稳定,可用于食品中多种动物源性成分的快速鉴别。 相似文献