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1.
猪SP-A基因荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
SP-A(surfactant protein-A)mRNA的表达对肺的发育、成熟均起关键作用,并且与肺部疾病的发生相关。为了建立荧光定量PCR技术检测猪SP-A表达量的方法,根据猪SP-A基因的mRNA序列(EU622632)设计引物,从纯化模板、PCR程序设计等方面进行了优化,建立了基于SYBR Green I染料技术的Power SYBR(Green荧光定量PCR方法。结果表明,所建立的Power SYBR(Green荧光定量PCR方法检测猪SP-A基因具有特异性好、简便、可靠等特点,为猪SP-A基因定量分析奠定了基础。 相似文献
2.
采用荧光SYBR Green I建立小鼠细胞因子mRNA实时定量PCR的检测方法;并利用建立的实时定量PCR的检测方法时感染H5N1禽流感病毒的BALB/c小鼠不同时间采集的肺脏组织中几种重要致炎细胞因子及趋化因子mRNA表达水平进行了检测.对HSN1禽流感病毒感染的BALB/c小鼠肺脏细胞因子的检测具有高度的特异性,检测的灵敏度为10~1～10~2拷贝数.H5N1禽流感病毒感染BALB/c小鼠后,小鼠肺脏中IL-1β、IL-6、TNFα、MIG、IP-10、RANTES、MIF和HMGB1细胞因子mRNA表达水平与时照组小鼠相比均有明显差异.建立的实时定量PCR能在基因转录水平敏感和特异地反应细胞因子的表达水平,该技术在基础和临床免疫研究中,具有良好的应用价值. 相似文献
3.
《中国兽医杂志》2015,(12)
为了建立非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型小鼠肝组织中CYP2A5表达的实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)方法。高脂饮食诱导小鼠至8周,采用qRT-PCR方法检测小鼠肝脏中CYP2A5的表达水平,同时评价该方法的特异性。建立了小鼠肝组织中CYP2A5的SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法,结果显示,该方法的溶解曲线为单峰,同时核酸电泳显示一条特异性条带。检测结果表明,高脂诱导的NAFLD小鼠肝组织中CYP2A5的表达水平极明显高于正常对照组(P0.01)。表明该实时荧光定量PCR方法,特异性好、灵敏度强,为进一步研究小鼠CYP2A5的表达提供了试验基础。 相似文献
4.
试验旨在探讨不同发育时期卵泡上四跨膜蛋白CD9的表达,以及体外成熟和超低温冷冻对绵羊卵母细胞CD9的影响。采用免疫组织化学技术检测CD9蛋白在卵泡上的表达部位,实时荧光定量PCR技术检测CD9 mRNA的表达量,Western blotting技术检测CD9蛋白的含量。免疫组织化学结果发现,在绵羊原始卵泡上就开始检测到CD9荧光信号,且随着卵泡的成熟荧光信号逐渐增强,成熟卵泡时荧光信号达到最强;实时荧光定量PCR检测新鲜MⅡ期卵母细胞中CD9 mRNA的表达量显著增高（P<0.05）,冷冻GV期卵母细胞CD9 mRNA的表达量最少;Western blotting检测得出新鲜MⅡ期卵母细胞中CD9蛋白表达最多,冷冻GV期卵母细胞上表达最少,与实时荧光定量PCR结果一致。卵母细胞的冷冻保存要比胚胎保存应用前景广泛,而四跨膜蛋白CD9在精卵融合中更有着重要的作用,以上结果均显示,冷冻保存降低卵母细胞四跨膜蛋白CD9含量,而CD9的损伤是受精率下降的重要原因之一。 相似文献
5.
为探讨羊痘病毒感染后机体的凋亡细胞因子mRNA表达水平的变化,深入探讨羊痘病毒免疫机制,本研究设计针对羊凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFR1和TNF-α特异性引物,建立羊凋亡细胞因子实时荧光定量方法。分别建立荧光定量PCR反应体系并进行优化。结果表明:Fas、FasL、TNFR1和TNF-α的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR各基因的溶解曲线均呈单一溶解峰。组内变异系数均小于2.00%。本研究建立的羊凋亡细胞因子SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法为凋亡细胞因子mRNA表达水平提供了技术平台。 相似文献
6.
鸭IFN-γ mRNA实时荧光定量RT-PCR方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立检测鸭IFN-γmRNA表达的实时荧光定量RT-PCR方法,根据GenBank中鸭IFN-γ基因序列,在保守区域设计并合成一对引物,采用SYBR Green I染料,建立检测鸭IFN-γmRNA的实时荧光定量RT-PCR方法(real-ti me RT-PCR)。试验以PCR产物为标准品,建立标准曲线,随后进行熔解曲线分析和稳定性研究。结果Ct值线性范围为12.0~33.0,相关系数为0.997;熔解曲线显示产物为单特异峰,Tm为82.5±0℃;组内变异系数(CV%)为4.26%;组间试验无显著差异(P>0.05)。建立的检测鸭IFN-γmRNA的Real-ti me RT-PCR方法具有检测范围广、扩增效率高、特异性好、重复性和稳定性良好等特点。 相似文献
7.
本研究旨在建立定量分析鸡生长激素(Growth hormone,GH)基因mRNA表达水平的实时荧光定量PCR方法,为鸡GH基因mRNA表达水平的定量分析及探讨其与马立克氏病遗传抗性间关系奠定基础。根据GenBank数据库中鸡的GH基因序列,使用Oligo7软件在该基因保守区域设计合成一对引物并扩增GH基因片段,经回收纯化后连接到pGM-T载体,成功构建了含有GH基因片段的pGM-T-GH标准质粒。在此基础上,通过SYBR GreenⅠ染料法建立了pGM-T-GH重组质粒的实时荧光定量PCR标准曲线及其回归方程,成功建立了实时荧光定量PCR检测鸡GH基因的方法。 相似文献
8.
本研究旨在分析KDM2B在小鼠卵母细胞和早期胚胎中的表达规律,为KDM2B在卵母细胞减数分裂及胚胎发育过程中的生物学作用奠定基础。选择20只6～8周龄小鼠为试验动物,收集GV期、MⅡ期卵母细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞、囊胚各阶段胚胎,根据GenBank上已公布的小鼠(Mus musculus)KDM2B序列设计引物,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测KDM2B在胚胎各阶段mRNA的表达水平;通过免疫荧光染色定位KDM2B蛋白在胚胎各阶段的分布。结果显示,GV期卵母细胞KDM2B mRNA的表达量极显著高于MⅡ期(P<0.01);在2-细胞、4-细胞和8-细胞mRNA表达量较低,囊胚期其表达量极显著升高(P<0.01);卵母细胞成熟过程中,KDM2B在GV期主要表达于细胞核中,MⅡ期卵母细胞核中的荧光信号极显著减弱(P<0.01),早期胚胎发育过程中,KDM2B蛋白在2-细胞、4-细胞、8-细胞胚胎中均不表达,囊胚期重新表达于细胞核。综上表明,本研究成功建立KDM2B在小鼠卵母细胞及胚胎细胞中的时空及时序表达模式,关于KDM2B参与调控减数分裂与胚胎发育过程具体的作用机制有待进一步研究。 相似文献
9.
设计1对引物,建立RT-PCR方法对β1基因mRNA进行鉴定;以GAPDH基因为内参,建立检测鸡β1基因表达水平的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并用此方法测定120日龄雏鸡不同肠段组织β1基因表达水平。结果显示,从鸡肠组织成功鉴定出β1基因mRNA;检测内参基因GAPDH和目的基因β1的实时荧光定量PCR方法扩增效率一致(扩增曲线斜率差<0.1),满足使用比较Ct值法对β1基因mRNA进行相对定量分析的前提;扩增曲线、熔解曲线及凝胶电泳结果提示该方法特异性好。实时荧光定量PCR检测结果表明,1日龄雏鸡十二指肠和盲肠、10日龄雏鸡空肠和直肠、5日龄雏鸡回肠组织中β1基因相对表达量最高。结果表明,鸡肠组织中存在β1基因表达,并在不同日龄不同肠段表达水平存在差异。 相似文献
10.
《中国兽医杂志》2019,(1)
根据GenBank羊炎性细胞因子(IL-1β和IL-8)和Mx1保守序列,设计特异性引物,利用SYBR Green I染料法建立实时荧光定量检测方法。将羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子基因保守区域克隆到pMD18-T载体,构建标准质粒。分别以标准质粒为模板建立荧光定量PCR反应的标准曲线、熔解曲线。结果表明,羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子实时荧光定量检测方法Ct值与标准品呈良好的线性关系,R~2均大于0.990,所有稀释度标准品模板出现特异性熔解峰。应用所建立的方法对山羊痘病毒AV41感染山羊外周血淋巴细胞中IL-1β、IL-8和Mx1 mRNA表达水平进行检测,山羊痘病毒AV41可以刺激机体产生较高的炎性细胞因子。建立的羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子荧光定量检测方法,可以为山羊痘病毒感染后分子免疫机制研究奠定基础。 相似文献
11.
试验旨在研究G蛋白偶联受体50（G protein-coupled receptor 50,GPR50）在牦牛卵母细胞体外成熟过程中的表达与定位规律,为进一步解析卵母细胞成熟的分子机制及理解牦牛繁殖的特异性提供依据。通过牦牛卵母细胞体外成熟培养,利用免疫荧光染色监测不同时间点（0~24 h）纺锤丝形态和核相的变化,确定牦牛卵母细胞减数分裂4个时期,包括生发泡期（germinal vesicle,GV）、生发泡破裂期（germinal vesicle break down,GVBD）、第一次减数分裂中期（metaphase Ⅰ,MⅠ）与第二次减数分裂中期（metaphase Ⅱ,MⅡ）的时间点。在此基础上,通过实时荧光定量PCR检测GPR50基因在牦牛卵母细胞成熟过程中的动态表达量,免疫荧光染色检测GPR50蛋白在卵母细胞成熟过程中的的亚细胞动态定位情况。结果表明,牦牛卵母细胞体外成熟0 h时90%处于GV期,6 h时94%处于GVBD期,16 h时92%细胞处于MⅠ期,24 h时94%处于MⅡ期。实时荧光定量PCR结果表明,GPR50基因在牦牛卵母细胞GV期即有表达,并在GVBD、MⅠ、MⅡ期成熟过程中逐渐升高,在MⅡ期达到顶峰,且极显著高于GV与GVBD期（P<0.01）。GPR50蛋白在牦牛卵母细胞GV期时集中在膜上表达,并随着成熟进程的发展在细胞质和细胞膜均大量表达,在MⅡ期高亮度弥散表达。以上结果表明,GPR50基因参与牦牛卵母细胞减数分裂过程并发挥重要作用,为研究GPR50在牦牛卵母细胞成熟过程中的作用及机制提供了依据。 相似文献
12.
为建立鸽白细胞介素8（interleukin-8,IL-8）基因实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank上公布的鸽IL-8基因序列,在保守区域设计1对特异性引物,以鸽子淋巴细胞提取的核酸为模板扩增鸽IL-8基因部分片段并克隆到pMD18-T载体上。提取重组质粒通过系列制备标准品,建立鸽IL-8基因SYBR GreenⅠ染料法实时荧光定量PCR标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,实时荧光定量PCR熔解曲线呈单一熔解峰,试验线性相关系数为1.0,IL-8基因的扩增效率为103%。敏感性结果显示最低可检测到16个拷贝数;用该方法检测其他鸽白细胞介素细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-18）和双蒸水的结果均为阴性。批间、批内变异系数均≤1.52%。因此,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法可用于鸽IL-8 mRNA的检测,为病毒感染宿主细胞后细胞因子表达的定量分析奠定基础。 相似文献
13.
《动物医学进展》2015,(10)
为建立膜连蛋白A2(AnxA2)基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,根据GenBank中公布的AnxA2基因序列设计并合成引物,经过条件优化,建立了AnxA2SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。该方法线性关系较好,以质粒标准品构建的标准曲线相关系数R2为0.999;灵敏性好,比普通PCR灵敏100倍。应用建立的方法对随机选取的几种哺乳动物细胞进行检测。结果表明,建立的方法能成功检出不同细胞中AnxA2含量。表明本研究建立的AnxA2SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法灵敏性高,重复性好,可用于AnxA2的检测及定量分析。 相似文献
14.
小鼠β-actin mRNA荧光定量PCR方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究旨在建立定量检测小鼠β-actin mRNA表达水平的实时荧光定量PCR方法,为小鼠相关基因表达水平的分析提供方法。根据GenBank中登录的小鼠β-actin mRNA序列,针对保守区域设计并合成1对引物,建立了基于SYBR Green Ⅰ技术的小鼠β-actin mRNA荧光定量PCR方法。结果表明,该方法扩增效率高(97.7%),定量线性范围广(9.3×102~9.3×107拷贝/反应),可重复性强,无非特异性扩增和引物二聚体,最小检出量为9.3拷贝/反应。试验结果为β-actin作为内参基因用于小鼠相关基因转录水平分析提供了基础。 相似文献
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SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测鉴定狮制品 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立SYBR Green I实时荧光PCR检测鉴定狮（Panthera Leo）制品的方法,本文在豹属动物线粒体细胞色素b基因上设计狮特异性引物,建立并优化了SYBR Green I实时荧光PCR检测鉴定体系,采用17种血液、组织和骨粉类样品的DNA,通过扩增曲线和融解曲线分析检测的特异性和灵敏度,并用狮肉粉和牛肉骨粉系列百分比混合物进行抗干扰能力分析。结果显示,狮血液和组织DNA样品均出现特异性的实时扩增曲线,平均熔解温度在84±0.2℃。虎、豹、熊等14种哺乳动物DNA样本的检测结果均为阴性。灵敏度检测显示,本实验所建立的SYBRGreen I实时荧光PCR方法能够检测出10 pg/μL的狮组分DNA。抗干扰能力显示在骨粉中狮的成分最低检出含量为0.1%。这些结果说明,本文建立的SYBR Green I实时定量PCR方法具有方便、经济、灵敏度高和重复好等特性,可用于狮源性制品的检测鉴定。 相似文献
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为建立一种灵敏、可快速检测猪圆环病毒4型（PCV4）的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,根据PCV4 Rep基因的保守区域设计引物,建立针对PCV4的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显示,该检测方法的Ct值与标准品在5.64×102~5.64×109 copies/μL范围内呈良好的线性关系,R2为0.999,斜率为-3.638,检测下限为5.64×102 copies/μL,且无非特异性扩增。利用该方法对56份临床样品进行检测,发现PCV4核酸阳性率为3.57%,比普通PCR更灵敏可靠。结果表明,本试验建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法可用于PCV4的快速诊断。 相似文献
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鸡β-actin基因实时荧光定量PCR方法的建立 总被引：11，自引：1，他引：11
根据GenBank上鸡β-actin基因的序列，在保守区域设计并合成一对引物，采用SYBR Green I染料建立了荧光定量PCR法（real-time PCR）。以常规PCR产物为标准品，建立了标准曲线，并进行了熔解曲线分析。结果表明，标准曲线Ct值检测范围为12~31,扩增效率为95.1%；熔解曲线分析结果显示产物特异的单个峰，其Tm为88±0℃，检测周期从RNA提取到荧光定量PCR结束只需4 h。本试验建立的鸡β-actin基因实时荧光定量PCR法扩增效率高、检测范围广、检测周期短，为β-actin基因作为内参基因进行鸡功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础。 相似文献
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根据GenBank中鸭IFN-α基因(GenBank登录号:JF894229)序列设计并合成引物,并以鸭β-actin基因(GenBank登录号:GU564232)为内参,采用SYBR Green I染料法,建立检测鸭IFN-αmRNA的实时荧光定量Real-time PCR方法(RT-PCR)。将IFN-α和β-actin基因分别克隆至pMD18-T载体上,鉴定出阳性重组质粒为标准品(p-IFN-α和p-β-actin),分别建立番鸭IFN-α和β-actin实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,Ct值在13.27~27.54与11.86~25.32范围内呈现良好的线性关系,相关系数均大于0.99(r>0.99),扩增产物的熔解曲线分析均各自只出现1个特异性单峰,无引物二聚体,Tm值分别为(93.6±0.26)℃和(85.3±0.15)℃,最低检测限分别为9.37×102copies/μL和3.71×101copies/μL,检测周期从样品的处理到荧光定量PCR结束仅需4 h左右。本研究建立的鸭IFN-α基因实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性强、检测周期短,为番鸭IFN-αmRNA的定量分析奠定了基础。 相似文献
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本试验旨在建立一种用SYBR GreenⅠ荧光染料检测HeLa细胞Ⅰ型干扰素效应因子ISG15、ISG56、Mx1、OAS和PKR mRNA表达水平的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并在口蹄疫病毒(FMDV)L蛋白抑制Ⅰ型IFN发挥效应的信号通路中进行初步应用。利用TRIzol法提取总RNA,经Oligo d(T)15进行反转录,利用PCR扩增各段目的基因,并克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,经鉴定为阳性的重组质粒作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR标准曲线和熔解曲线,并进行灵敏性、特异性和重复性试验。根据建立的实时荧光定量RT-PCR方法,检测FMDV L蛋白对Ⅰ型IFN效应因子的抑制效果。HeLa细胞在转染FMDV L蛋白真核表达质粒,并受到Ⅰ型IFN刺激后ISG15、ISG56、Mx1、OAS和PKR的相对表达量较转染空载体或表达GST的真核表达质粒明显降低。本试验建立了HeLa细胞Ⅰ型IFN效应因子的实时荧光定量RT-PCR检测方法,为在mRNA水平上对HeLa细胞Ⅰ型IFN效应因子的定量分析奠定了基础,并成功地初步应用于FMDV L蛋白抑制Ⅰ型IFN发挥效应的信号通路的研究中。 相似文献