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1.
[目的]研究细菌过氧化酶基因的克隆方法。[方法]培养扩增E.coli W3110,提取其基因组DNA,采用限制性内切酶Sau3A I对其进行部分酶切,分离纯化1.5 kb以上的DNA片段。将经BamH I酶切的大肠杆菌质粒pUC18与经Sau3A I部分酶切的不同片段用T4连接酶进行连接,并转化大肠杆菌DH5α。通过BHI-单宁酸培养介质,筛选出含有活性过氧化氢酶基因的重组子。[结果]经酶切和PCR鉴定,证实所克隆的过氧化氢酶基因是正确的,与理论相符。[结论]该研究结果为快速简便地克隆筛选活性细菌过氧化氢酶基因奠定了基础。 相似文献
2.
首先将多杀性巴氏杆菌谷氨酸脱氢酶的基因gdhA启动子及鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因插入pMD18-T质粒载体的多克隆位点中构建巴氏杆菌表达质粒pMD18T-PGDH-VP2,用该质粒转化禽多杀性巴氏杆菌G190E40株。为了解重组质粒在巴氏杆菌中传代的稳定性以判断其作为重组活疫苗的可能性,将转化菌种在含氨苄青霉素及血清的平板固体培养基上连续传代至第9代,肉眼观察下的菌落形态和显微镜下见到菌体形态与原始菌种无明显差异;每隔3代提取质粒DNA用限制性内切酶切割检查,酶切图谱没有改变;用扩增PGDH的引物,将提取3、6、9代质粒进行PCR检查,均可见约300bp的PGDH基因片段。结果表明,pMD18-T中的大肠杆菌复制子能在巴氏杆菌中稳定传递至少9代,这为构建能在禽巴氏杆菌和大肠杆菌中复制和表达外源基因的穿梭表达质粒打下了基础。 相似文献
3.
[目的]建立重复性好的感受态细胞的快速制备方法和质粒转化方法。[方法]采用改进的氯化钙法制备感受态细胞后,将带有目标片段的质粒转入感受态细胞,使工程菌DH5α转化成具有抗氨苄青霉素的大肠杆菌,接种于添加氨苄青霉素的LB培养基上,并通过蓝白斑筛选和菌落PCR进行检测。[结果]制备的感受态细菌在不加Amp的LB平板上能较好生长,表明感受态细菌具有较强活性。感受态细菌在添加Amp的平板上不能生长,表明感受态细菌未被杂菌污染。转化后获得白色菌落1 410个,转化率为1.41×105cfu/μg。菌落PCR表明获得的白色菌斑为带有目标片段的阳性菌斑。[结论]该方法十分简便,是一种适于实验室操作的高效感受态细胞的制备方法。 相似文献
4.
[目的]构建重组人表皮生长因子的植物用表达载体,为应用花生毛状根表达系统表达人表皮生长因子(hEGF)奠定基础。[方法]在GenBank中找到hEGF基因序列,并人工合成;将含hEGF基因与绿色荧光蛋白(GFP)的基因连接,用加相应接头的引物扩增得到这2个基因的片段,然后用Sal I和EcoR I的进行双酶切并回收;提取质粒pRI 101 AN DNA,并用Sal I和EcoR I对其进行双酶切并回收,再次将经过双酶切的2个DNA片段连接,将连接产物转化大肠杆菌XL10-Gold,再提取得到的发荧光重组子质粒的DNA,用酶切图谱和PCR进行鉴定,将验证正确的重组子中的质粒DNA命名为pBZG101。[结果]hEGF和GFP连接成功,并成功地将这2个基因连接的片段连接至质粒pRI 101 AN DNA上,得到了重组人表皮生长因子的植物用表达载体pBZG101。[结论]该研究成功构建了重组人表皮生长因子的植物用表达载体pBZG101。 相似文献
5.
[目的]扩增烟草NtKRP基因尾部含T1083替换的片段,将其克隆入pGBKT7载体中。[方法]以pBI121KE质粒为模板进行PCR反应,将得到的PCR产物凝胶回收后等摩尔混合,取适量作为模板,得到含定点突变的尾部片段。将该PCR产物克隆入SmaI线性化的pUC19载体,构建含T1083替换的重组子pUC19Ts。通过蓝白斑筛选得到的重组子进行BamHI -SmaI双酶切鉴定,将筛选出的正确重组子送交联合基因测序。将pGBKT7和测序正确的pUC19Ts质粒均用BamHI -SmaI双酶切,分别回收1 320 bp的融合片段和7.3 kb的载体片段进行连接,转化并筛选得到重组子,任意挑取2个单菌培养后提取质粒进行BamHI -SmaI双酶切鉴定。[结果]成功构建了NtKRP尾部含T1083替换的BD融合质粒载体pGBKT7-TS。[结论]为进一步研究NtKRP尾部T替换对NtKRP与靶物质结合的影响奠定了实验基础。 相似文献
6.
[目的]用克隆载体pUC19构建乳杆菌自杀质粒及乳杆菌基因缺失工程菌[方法]在质粒pUC19的多克隆位点插入氯霉素抗性基因构建pUC19-CM载体;在pUC19-CM载体氯霉素抗性基因的两侧均添加1个用于同源重组的同源臂,再构建成自杀质粒pUC19-CM-D。将自杀质粒pUC19-CM-D转化乳杆菌进行抗性筛选即可得到目标基因被抗性基因替换的突变株。[结论]pUC19-CM-D质粒的构建及应用为乳杆菌基因缺失工程菌的构建提供了一个快速有效的手段,也为乳杆菌基因功能研究奠定了基础。 相似文献
7.
研究了质粒载体和外源DNA的浓度、酶切体系的酶切时间以及酶切产物的链接时间对转化效率的影响。结果表明,当pUC19质粒载体的浓度为25ng/μL,外源基因λDNA的浓度为100ng/μL,酶切时间3h,且连接时间为14h时,构建出的重组质粒转化大肠杆菌DH5α效率最高。 相似文献
8.
本文描述了一种构建与PCR产物直接连接的克隆载体的方法。以高拷贝克隆载体 pUC118为骨架载体,在 pUC118质粒Ampr 基因的Eam110 5I酶切位点上,以点突变的方式封闭Eam110 5I酶切位点。经转化大肠杆菌JM 10 9证实,该改造过的pUC118质粒,可使宿主细胞具有氨苄抗性,仍可作为氨苄选择标记的克隆载体。将一人工合成的具有两个Eam110 5I酶切位点的互补寡聚核苷酸链(两端具有BamHI接头)插入已封闭Eam110 5I酶切位点的pUC118 载体的BamHI位点,构成新的克隆载体,此质粒命名为pUC118E。该载体经Eam110 5I酶切后,可产生 3 端突出一个T碱基的T -vector,能与PCR产物直接连接。 相似文献
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一种用高拷贝质粒载体制备BAC载体基本功能基因的新方法 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]简便有效地解决BAC载体序列因单一拷贝数带来的制备以及下游亚克隆操作的困难。[方法]选择适当的单一酶切位点,将单拷贝BAC载体质粒序列全部插入高拷贝质粒pUC119载体的适当位点。[结果]BAC载体基本功能基因序列在新质粒pUC119-BAC中失去了单一拷贝数控制功能,以高拷贝形式进行复制,利用单一酶切,可将BAC载体基本功能基因序列完整切下来,自连后重新恢复严格的单拷贝控制功能。[结论]利用高拷贝pUC119-BAC质粒,实现了BAC载体的基本功能基因序列高拷贝的复制和扩增,可以方便地用于分子克隆化重组病毒转移载体的构建或BAC文库的构建。 相似文献
10.
[目的]构建以pUC19质粒为基础可利用XcmⅠ内切酶制备的T载体。[方法]化学合成2条含有双XcmI酶切位点的互补寡聚核苷酸链,经过变性、复性后克隆入pUC19质粒的HindⅢ和BamHⅠ位点之间,通过XcmI酶切后得到一个线性化的带有3末端突出一个T碱基的T载体。[结果]经TA克隆验证,制备的pUC19-HB-T载体对PCR产物的克隆率达到95%以上。[结论]所构建的pUC19-HB-T载体可用于PCR产物的克隆、测序及后续分子生物学操作。 相似文献
11.
[目的]获得研究鸡CD8分子的单克隆抗体。[方法]用自行设计的引物PCR扩增鸡CD8分子α链部分基因片段,构建2个原核重组质粒,该片段经原核表达和纯化后免疫BALb/c小鼠,最后将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,细胞上清液用ELISA检测。[结果]PCR扩增获得大小约为510 bp的基因片段。构建的pET-32a-CD8α导入大肠杆菌,诱导表达获得了大小为39 kD的融合蛋白H is-CD8α。融合细胞经亚克隆,其上清液用ELISA检测和筛选,获得1株稳定传代和分泌抗CD8α的抗体的杂交瘤细胞株。该株细胞被命名为C11。上清液的ELISA抗体效价达1：600。[结论]该研究以原核表达的CD8α为抗原制备了1株单克隆抗体。 相似文献
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13.
[目的]提高大肠杆菌感受态细胞的转化效率。[方法]根据普通实验室的试验条件,总结出1种少量制备大肠杆菌感受态细胞并高效率转化质粒的方法。[结果]利用该方法少量制备大肠杆菌感受态细胞,在OD600nm值为0.3～0.6时均可达到高转化率的效果。与常用的大量制备法相比,该方法的转化率提高100～300倍。[结论]该方法简单方便、重复性好、转化效率高、成本低,能够满足基因库的构建、分子克隆等研究的要求,是从事基因克隆研究方面的科研人员的良好选择。 相似文献
14.
[目的]构建河南华溪蟹（Sinopotamon henanense）金属硫蛋白（MT）的原核表达载体。[方法]以大肠杆菌DH-5α中的pGEM-MT质粒为模板,PCR扩增目的片段并连接至pGEM-T载体。然后,亚克隆至pQE31表达载体,转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞。[结果]PCR扩增目的片段产物大小约为220 bp,与预期大小一致。重组质粒pQE31-MT双酶切鉴定结果也与预期相符。[结论]成功构建了MT原核表达载体,为今后表达并纯化MT提供了材料。 相似文献
15.
[目的]筛选出目的蛋白能够高效表达的重组质粒。[方法]利用原核表达载体pET-32a(+)和pET-28a(+)成功构建了番茄黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus,TYLCV)外壳蛋白(Coat Protein,CP)基因的重组质粒p32a-CP和p28a-CP,并通过PCR和双酶切鉴定了序列连接的正确性;再分别将2个载体转化至BL21(DE3)中,采用不同浓度的IPTG对其进行诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳检测。[结果]测序结果显示TYLCV-CP基因已定向插入p32a-CP和p28a-CP中;SDS-PAGE电泳结果显示分子量约为50 kD的目的蛋白在重组载体p32a-CP中得到了高效表达,而在重组载体p28a-CP中未表达。[结论]为下一步的抗体制备及TYLCV的免疫学检测奠定了基础。 相似文献
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[目的]明确Osdg中T-DNA插入位点的基因是否为引起突变表型的基因。[方法]采用OsWRKY10基因5’端、不含WRKY保守域的长300 bp的cDNA片段,构建抑制OsWRKY10基因表达的特异性dsRNA干涉重组表达载体pCam-35SWInW。采用冻溶法将pCam-35SWInW载体导入根癌农杆菌超毒力菌株EHA105,对其进行PCR检测。[结果]该研究成功构建了重组表达载体pCam-35SWInW。采用相应限制性内切酶对重组表达载体进行酶切鉴定,其中以XhoⅠ消解重组质粒,可获得1 kb左右的DNA片段。在抑制基因表达方面,发卡结构比反义结构更为有效。[结论]该研究成功构建了抑制OsWRKY10表达的特异性dsRNA干涉载体,可用于进一步的基因功能研究。 相似文献
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[目的]为了获得桉树4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)基因,构建植物反义表达载体,研究4CL基因对木质素的调控机理。[方法]从尾叶桉U6幼茎组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到1.4 kb cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-T Easy。[结果]测序结果表明,该基因1413 bp,编码471个氨基酸。克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pBI121上,构建成4CL反义基因表达载体。通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒导转入根癌农杆菌EHA105,得到完整的Ti质粒表达载体系统。[结论]为该基因转化桉树的主栽品种尾叶桉U6以降低其木质素含量奠定了基础。 相似文献