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1.
采用荧光定量PCR技术,检测翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)快肌和慢肌中与糖代谢相关的16个基因的表达情况,并比较其表达差异性,分析翘嘴鳜肌肉糖代谢调控特点。结果显示:在快肌和慢肌中,与葡萄糖摄取和磷酸化相关的基因存在显著性差异表达的各有4个;与糖原代谢相关的基因有显著性差异表达的有2个;PI3K、MAPK5、MAPK63个基因在快肌中的相对表达量极显著高于在慢肌中的,表明与这3个基因相关的葡萄糖的摄取和利用快肌强于慢肌;而MEF2α、PGC–1α、PGC–1β、PDK1、MAPK4、GYS1、GSK3β7个基因在慢肌中的相对表达量显著高于快肌,表明与这7个基因相关的葡萄糖的摄取和利用慢肌强于快肌。 相似文献
2.
构建硬酯酰辅酶A去饱和酶1(Stearoyl-CoA Desaturase l,SCD1)真核表达质粒pcDNA3.1(+)/SCD1,转染鹅原代肝细胞验证其对细胞中脂肪代谢的影响。根据鹅SCD1基因设计带有酶切位点引物,RT-PCR扩增SCD1基因,克隆至pMD-19T载体,亚克隆至pcDNA3.1载体,构建重组真核表达载体pCDNA3.1(+)/SCD1。酶切及序列测定测序正确后转染鹅原代培养肝细胞,荧光定量PCR检测SCD1基因的表达,并用油红O染色检测细胞中脂滴情况。结果:成功构建SCD1基因真核表达载体,转染鹅原代培养肝细胞后SCD1基因获得了表达,与脂肪代谢相关基因SREBP表达上调,同时检测到细胞中脂滴明显增多。结论:构建了重组质粒pCDNA3.1(+)/SCD1,并在鹅原代培养细胞中获得表达,为进一步研究SCD1基因在鹅肝脏脂肪代谢中的作用奠定基础。 相似文献
3.
《西南农业学报》2017,(3)
PI3K与AKT组成的PI3K-AKT信号通路在细胞的增殖以及凋亡具有重要意义,本试验旨在研究该信号通路在家兔SCs增殖过程中发挥的作用。采用siRNA介导的PIK3CA和AKT3基因进行基因的沉默表达。结果发现对处于对数生长期的细胞转染si-PIK3CA-03或si-AKT3-01后48 h,分别对靶基因和上下游基因PTEN和Fox O1进行qRT-PCR反应,并采用CCK-8试剂盒通过酶标仪检测其在转染si-PIK3CA-03或si-AKT3-01后对细胞增殖能力的影响。结果表明:在转染si-PIK3CA-03后,PIK3CA和AKT3基因的相对表达量均显著下调,PTEN和Fox O1基因的表达量均显著上调;当转染了si-AKT3-01后,PTEN和FoxO1基因表达量均显著上调。表明PTEN、Fox O1基因与PIK3CA、AKT3基因的相对表达量呈负相关。转染实验组OD值显著低于空白对照组(P0.05),说明通过转染实验下调PIK3CA和AKT3基因表达后,细胞增殖能力均有显著的下降。由此说明,分别抑制表达PIK3CA、AKT3基因后,靶基因的表达量显著下降,家兔SCs的增殖能力也显著下降,说明PIK3CA、AKT3基因能够正向调控肌细胞的增殖。 相似文献
4.
[目的]探究鸭原代肝细胞脂质含量与碳水化合物反应元件结合蛋白基因(ChREBP)表达的关联性,为深入研究ChREBP基因对畜禽脂质代谢的遗传调控机制提供参考依据.[方法]采用Ⅳ型胶原酶消化法分离孵化21 d的鸭胚原代肝细胞,以DMEM高糖培养基进行培养.利用RT-PCR扩增鸭ChREBP基因编码区(CDS)序列,构建携带His标签的真核表达载体pEGFP-N3-ChREBP-His,通过脂质体法分别转染鸭胚原代肝细胞和人前列腺癌细胞(PC3);采用His标签检测试剂盒检测ChREBP基因的表达量,以脂质指标测定试剂盒测定甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的含量,并分析鸭胚原代肝细胞和PC3细胞中ChREBP基因表达与脂质指标含量的相关性.[结果]以构建的真核表达载体pEGFP-N3-ChREBP-His转染鸭原代肝细胞和PC3细胞均能发出绿色荧光,表明携带His标签的ChREBP基因能在鸭原代肝细胞和PC3细胞中表达.ChREBP基因表达量与鸭原代肝细胞和PC3细胞中的TG、TC和HDL含量均呈极显著正相关(P<0.01,下同),与LDL含量呈极显著负相关.[结论]以构建的真核表达载体pEGFP-N3-ChREBP-His转染鸭原代肝细胞和PC3细胞后均能发出绿色荧光,说明ChREBP基因表达对鸭原代肝细胞和PC3细胞中的脂质代谢作用机理相似,可促进细胞脂质累积. 相似文献
5.
【目的】分别构建牛fabp3和fabp4基因真核表达载体,并观察载体转染小鼠成肌细胞后基因的表达以及对内源fabp3和fabp4基因表达的影响,检测肉质性状形成相关基因在转基因细胞中的表达及对内源功能基因的影响。【方法】 以pDsRED质粒为骨架载体,分别将人肌红蛋白启动子与目的基因相连、CMV启动子与红色荧光蛋白报告基因相连构建肌肉特异性表达fabp3基因的载体pDsHF3和表达fabp4基因的载体pDsHF4;用脂质体瞬时转染小鼠成肌细胞,72 h后用2%孕马血清诱导成肌细胞向肌管的分化;利用real-time PCR技术检测转染前后成肌细胞中外源牛fabp3和fabp4基因和内源小鼠fabp3和fabp4基因的表达量。【结果】与对照组相比,小鼠成肌细胞分别转染pDsHF3和pDsHF4表达载体,24 h后外源牛fabp3和fabp4基因均获得高水平的表达,48 h后有所回落;而内源小鼠fabp3和fabp4基因在成肌细胞和诱导分化的肌管细胞中的表达均受到不同程度的影响。【结论】构建的真核表达载体能在成肌细胞中高效表达,外源牛fabp3或fabp4基因的转入能够影响小鼠成肌细胞及肌管中内源fabp3和fabp4基因的表达。 相似文献
6.
为研究机体干扰素诱导基因对日本乙型脑炎(JEV)感染的作用,通过IFN-α和JEV刺激猪睾丸(ST)细胞,实时荧光定量PCR检测Mx1、Mx2、OAS1、OAS2、PKR和干扰素诱导基因-15(ISG15)表达情况,发现除PKR外,其他基因相对mRNA量都有不同程度上升,其中ISG15上升最为显著。ISG15在ST细胞中过表达,检测病毒基因组和滴度,结果表明:ISG15可显著抑制JEV增殖;shRNA靶向干扰ISG15,JEV病毒量上升,说明ISG15在体外对JEV的增殖有抑制作用。将JEV的C、M、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B基因克隆入pcDNA3.1真核表达载体,转染ST细胞后E和NS3基因引起ISG15相对mRNA量显著上升,说明JEV的E和NS3基因参与诱导ISG15的表达。 相似文献
7.
为研究FSP27基因对猪前体脂肪细胞增殖、分化和凋亡的影响,在军牧一号白猪原代前体脂肪细胞中转染siRNA-717沉默FSP27.猪前体脂肪细胞分化效果使用油红O染色试验检测,猪前体脂肪细胞增殖、分化、凋亡相关基因的表达使用荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白免疫印迹等技术检测.结果表明:猪脂肪细胞中转染 siRNA-FSP27后,PCNA,cyclin D2和 cyclin E2的 mRNA 表达水平显著升高;aP2、C/EBPα、PPARγ的mRNA表达水平显著降低;油红O检测结果显示脂滴显著降低;Bax和p53的相对mRNA水平显著降低,Bcl2显著升高.表明FSP27在体外培养的猪脂肪细胞中抑制脂肪细胞增殖,促进脂肪细胞分化和凋亡. 相似文献
8.
[目的]建立成年鸡原代肝细胞的药物代谢模型并对其进行优化。[方法]以改进的二步灌流法分离8~12周龄的雄性黄羽鸡肝细胞,比较在不同细胞基础培养液条件下鸡肝细胞体外培养的情况,利用倒置显微镜观察肝细胞的形态,利用MTT检测法绘制生长曲线,测定细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,用q PCR和Western blot测定肝细胞中CYP450酶亚型CYP1A4、CYP1A5和CYP3A37 mRNA相对表达水平和3种酶蛋白的表达量。[结果]离体灌流操作简便,获得的细胞存活率高达90%以上;用含0.5 mg·L-1牛胰岛素、10 g·L-1双抗(100 U·m L-1青霉素和链霉素)和体积分数为10%胎牛血清的DMEM基础培养液体外培养鸡肝细胞,贴壁培养时可见到肝细胞较为明显的分化过程,贴壁后呈上皮细胞样生长,多角形,胞浆内容物均匀丰富,细胞核清晰透亮,少数有双核,细胞生长状态良好。生长曲线和LDH活性测定结果显示:培养3~5 d时细胞状态稳定,并且在肝原代细胞培养的8 d内,CYP1A4、CYP1A5和CYP3A37 mRNA相对表达水平和蛋白的表达量没有显著差异。[结论]以改进的二步灌流法分离鸡肝细胞操作简便,分离的鸡肝原代细胞存活率高,用含0.5 mg·L-1胰岛素、100 U·m L-1青霉素、100μg·m L-1链霉素和10%胎牛血清的DMEM基础培养液体外培养鸡肝原代细胞效果最好,培养3~5 d是进行体外药物代谢等试验的最佳时机。 相似文献
9.
非洲绿猴肾细胞外源绿色荧光蛋白基因表达的RNA干扰 总被引：3，自引：0，他引：3
非洲绿猴肾细胞(Vero)是多种病毒的适应细胞。本研究将外源的绿色荧光蛋白(GFP)基因转染到Veto-E6中,并利用体外转录合成的绿荧光蛋白短双链干扰RNA(siGFP)其表达进行干扰。结果显示：siGFP能有效阻断外源的绿色荧光蛋白基因在Vero-E6细胞中的表达,而不相关的siRNA则对绿荧光蛋白基因的表达没有影响。这为利用RNAi技术在Vero-E6细胞中,抑制外源基因的表达以及通过RNAi技术进行抗病毒的研究奠定了一定的基础。 相似文献
10.
胶原酶二步灌流法获取原代大鼠肝细胞,用不同浓度的速眠新和保定宁处理,Western blot法测定肝细胞中细胞色素酶P450 3A1(CYP3A1)和细胞色素酶P4502E1(CYP 2E1)的表达水平.结果表明:通过胶原酶灌流法,每只大鼠可获得2～4×108个肝细胞,成活率约为95%.用速眠新、保定宁处理后,肝细胞CYP3A1和CYP2E1的表达随速眠新、保定宁浓度的增加和处理时间的延长而呈升高的趋势.原代大鼠肝细胞可用于速眠新药物代谢分子机制的研究,为其临床上合理地应用提供了理论依据. 相似文献
11.
【目的】构建转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的阳性细胞株,通过比较各细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果,筛选对猪瘟病毒增殖有明显抑制作用的细胞株,为抗猪瘟转基因猪的构建提供材料。【方法】研究设计了靶向猪Jiv基因的4个shRNA干扰片段,并构建插入干扰片段的慢病毒(P1、P2、P3、P4)。将慢病毒分别转染PK-15细胞,阳性细胞接种猪瘟病毒后72 h用实时荧光定量PCR检测猪瘟病毒RNA的量,以比较4种干扰细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果。将对猪瘟病毒增殖有较好干扰效果的P2慢病毒干扰载体转染猪胎儿成纤维细胞,获得稳定表达靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的猪胎儿成纤维细胞株,作为抗猪瘟病毒转基因猪构建的供体细胞,将细胞核移植到成熟的去核猪卵母细胞中,获得体细胞核移植胚胎,移植入受体母猪输卵管中进行转基因猪构建,对获得的转基因猪进行外源基因的鉴定。【结果】获得了4株转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的PK-15细胞株,其中转入P2干扰载体的细胞株对猪瘟病毒的增殖有明显的抑制作用,将转入P2干扰载体的猪胎儿成纤维细胞株为核供体细胞通过体细胞核移植,获得经鉴定为外源基因插入阳性的转基因猪。【结论】细胞Jiv基因的表达对猪瘟病毒的增殖有一定的影响,筛选获得的一个干扰细胞株对猪瘟病毒的增殖有明显的干扰效果;通过体细胞核移植技术获得一头转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段（P2）的转基因猪。 相似文献
12.
【目的】探究乙酰辅酶A羧化酶α(acetyl-CoA carboxylase α,ACACA)对猪原代肌肉卫星细胞（muscle satellite cells,MSCs）增殖凋亡以及成脂转分化的影响。【方法】通过体外培养MSCs模拟猪肌内脂肪的形成过程，根据ACACA基因序列构建3条小干扰RNA，采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)筛选出干扰效率最高的siRNA进行转染。成功干扰MSCs内ACACA的表达后，分别通过q RT-PCR、CCK-8细胞增殖实验、流式细胞术、油红O染色和检测甘油三酯（TG）等方法对MSCs增殖、凋亡以及转分化时期脂滴形成效果进行评估。【结果】在增殖期干扰ACACA,MSCs内细胞周期标志基因Cyclin D1(P<0.05)、Cyclin E(P<0.000 1)以及抗凋亡基因BCL-2(P<0.05)的表达量下调，促凋亡基因BAX(P<0.05)的表达量上调；在对MSCs进行成脂转分化诱导作用下，MSCs具有向脂肪细胞转分化的能力，而干扰ACACA后，MSCs中脂滴极显著减少（P<0.000 1）。【结论】干扰ACAC... 相似文献
13.
《吉林农业科学》2014,(4):50-53
为利用核移植法获取转基因克隆猪提供供体细胞,体外分离培养猪胎儿成纤维细胞并进行了绿色荧光蛋白基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养猪胎儿成纤维细胞,绿色荧光蛋白表达载体以脂质法介导转染猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,利用荧光显微镜检测荧光蛋白的表达。结果表明,组织块贴壁后9 d可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9 d即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示荧光蛋白基因整合到细胞基因组中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,为下一步通过核移植方法获得转基因猪提供了基础。 相似文献
14.
拟南芥硫苷生物合成相关基因的组织和胁迫诱导表达谱的全基因组分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】分析拟南芥中硫代葡萄糖苷（Glucosinolatcs,简称硫苷）生物合成相关基因在不同组织器官、不同发育时期及不同生物和非生物胁迫处理条件下的表达谱,为筛选控制硫苷合成的关键基因、解析硫苷的生物合成规律及其在植物抗逆胁迫过程中的作用奠定基础。【方法】利用AtGenExpress和PLEXdb中的10组表达谱芯片数据和2组转录组数据分析拟南芥中硫苷生物合成途径82个结构基因和调控基因的时空表达特性及其受生物和非生物胁迫的表达模式;采用Real-time PCR技术对10个硫苷合成途径的关键结构基因和调控基因的表达谱进行验证;并利用STRING v10软件分析硫苷生物合成途径相关基因的表达模式的相关性。【结果】组织表达特性分析结果表明,拟南芥硫苷生物合成相关基因在营养器官和生殖器官中的表达模式差异较大,相关基因在营养器官中具有较高的表达量,在生殖器官中的表达量则较低,表明硫苷主要在营养组织中合成;其中脂肪族硫苷合成相关基因在茎、叶等地上营养组织中的表达量较高,而吲哚族硫苷合成相关基因则在根、茎、叶等地上和地下组织中均有较高的表达,且基因在同一组织的不同发育时期的表达量通常具有差异,表明基因的表达还具有时空特异性;荧光定量PCR分析结果证明10个硫苷合成途径代表基因的表达谱与芯片数据的结果保持一致;胁迫表达分析结果表明,脂肪族和吲哚族硫苷合成相关基因的表达均受到部分生物和非生物胁迫因子的诱导表达,其中吲哚族硫苷合成相关基因更易受到丁香假单胞杆菌（Pseudomonas syringae）、甘蓝链格孢菌（Alternaria brassicicola）、桃蚜（Myzus persicae）等生物和低温（4℃）、高盐、高温（38℃）等非生物胁迫因子的诱导表达;共表达分析结果表明,脂肪族和吲哚族硫苷合成分支途径内相关调控基因与结构基因的表达模式的相关性较高。【结论】拟南芥硫苷生物合成相关基因主要在营养组织中高表达,在种子中低表达;植物中存在一个硫苷转运系统,负责将营养组织中合成的硫苷转运到种子中贮藏;硫苷合成相关基因的表达受到病原菌、虫害、高温等逆境因子的影响,其中吲哚族硫苷合成相关基因更易受到生物和非生物胁迫因子的诱导表达,说明吲哚族硫苷可能对植物抗性更为重要。 相似文献
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利用RT-PCR方法从低氧预处理的A549细胞中获得HIF-1α基因片段,将其定向插入pIRES-SEQ质粒NheⅠ、MLuⅠ2个酶切位点之间,得到真核表达载体pIRES-HIF-1α;采用电转化方法将其电转化入减毒沙门氏菌Ty21α中,获得重组减毒沙门氏菌菌株TPH;转染A549细胞,RT-PCR法检测HIF-1α基因表达,ELISA方法检测HIF-1α蛋白表达;TPH菌株在氨苄青霉素(+)和氨苄青霉素(-)LB培养板上分别传代40代,每10代提取质粒进行PCR及酶切鉴定.结果表明:试验成功构建了携带HIF-1α基因的重组减毒沙门氏菌TPH,其可在体外细胞中稳定表达HIF-1α基因及蛋白,TPH可稳定遗传. 相似文献
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【目的】腹脂沉积是目前家禽养殖过程中的一个普遍现象。与哺乳动物不同,家禽的脂质代谢主要发生在肝脏,前人很多研究发现叶酸和IGF2均参与调控动物的脂质代谢,因此,试验旨在建立鸡原代肝细胞培养条件,并研究叶酸对鸡原代肝细胞脂质代谢相关基因表达的影响,为体外探究叶酸调控家禽脂质代谢机制提供依据。【方法】采用胶原酶消化配合鸡淋巴细胞分离液纯化法分离得到鸡原代肝细胞,用高碘酸希夫氏染色方法进行肝细胞鉴定;同时分离得到的肝细胞用正常培养基培养36 h后,更换含不同叶酸浓度的培养基(0,1,5,10,15,和20 mg·L~(-1)),每个叶酸浓度6个重复,处理12 h后收集上清液,并收集细胞提取总RNA,用RT-q PCR法检测基因相对表达量,MTT法检测细胞增殖,商业试剂盒方法检测上清液中LDH含量。并分析基因表达之间的相关性以及叶酸剂量与基因表达之间的回归关系。【结果】采用胶原酶消化配合鸡淋巴细胞分离液纯化法可以获得分离效果好且纯度高的鸡肝细胞;不同剂量的叶酸没有影响肝细胞培养液中的LDH活性(P0.05),也没有对肝细胞的增殖产生影响(P0.05);与1 mg·L~(-1)剂量的叶酸对照组相比,10、15和20 mg·L~(-1)的叶酸显著降低了肝细胞IGF2以及与脂质合成代谢有关的ACC和FAS基因的表达(P0.05),但叶酸并没有对鸡肝细胞中与脂质分解代谢有关的CPT1和PPARα基因的表达产生影响(P0.05);并且鸡肝细胞中ACC和FAS基因的表达与IGF2存在一定的正相关(P0.05);除此之外,鸡肝细胞IGF2,FAS和ACC的表达与叶酸剂量也存在着线性和二次曲线的回归关系(P0.05)。【结论】叶酸的添加可降低鸡原代肝细胞中与脂肪酸合成相关基因的表达,并且FAS和ACC基因的表达可能与IGF2具有正相关关系;本试验中叶酸的最适剂量为15 mg·L~(-1)。 相似文献
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一氧化氮(NO)是植物逆境响应的重要信号分子,能够诱导激活丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)的活性。为了分析外源NO诱导下MAPK基因在采后柑橘果实抗绿霉病中的表达情况,以埃及糖橙(Citrus Sinensis)果实为材料,使用硝普钠(SNP)溶液处理果实,统计接种柑橘绿霉病菌后果实的发病率和病斑面积,荧光定量PCR检测果实中MAPK基因的相对表达量和变化趋势。结果表明:外源NO能够降低试验期间柑橘果实绿霉病的发病率;果皮中MAPK基因的表达受外源NO诱导;CsMAP1、CsMAP15和CsMAP13-like基因在NO处理1 h即受诱导表达,CsMAP、CsMAP9、CsMAP9-like、CsMAP13-like、CsMAP19-like和CsMAP20-like在NO处理4 h达到表达高峰,CsMAP4-like、CsMAP7和CsMAPNTF3在NO处理12 h达到表达高峰,CsMAP1、CsMAP15、CsMAPMMK1和CsMAPMMK2分别在NO处理4 h和12 h有两个表达高峰。说明外源NO提高了柑橘果实对绿霉病的抗性,果皮中MAPK基因的诱导表达可能在抗病中发挥作用。 相似文献
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《（《农业科学与技术》）编辑部》2013,(4)
[目的]研究番茄rbcS3A启动子调控的外源基因在转基因番茄中的表达模式。[方法]以PCR方法克隆番茄Rubisco小亚基启动子rbcS3A,并构建Rbcs3A-Gus嵌合表达载体p1300RG,将重组载体用农杆菌介导的方法导入到番茄中,最后通过对阳性苗进行Gus活性检测,分析rbcS3A启动子驱动的外源基因在番茄中的表达模式。[结果]试验获得15株PCR阳性苗,阳性苗的获得率为33.3%;Gus活性染色结果显示,番茄rbcS3A控制的外源基因能够在转基因番茄成熟的叶片中高效表达,在果实等生殖器官中表达较弱,在种子中不表达。[结论]调整后的试验方案更有利于获得阳性苗;证实了启动子rbcS3A能够驱动外源基因在番茄营养器官叶片中高效表达而在种子等生殖器官中不表达或表达极低。 相似文献
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黄病毒RNA复制子在病毒致病机制、新型疫苗和药物研发上应用广泛,而坦布苏病毒(Tembusu virus, TMUV)是我国新发现的以引起水禽产蛋量下降为主要特征的黄病毒属成员。为构建TMUV RNA复制子,本研究以TMUV JXSP株感染性克隆为基础,利用Overlap PCR分别对病毒基因组进行CPrME、CPrM、PrME和PrM等4种方式结构蛋白基因的缺失,并在缺失部位插入绿色荧光蛋白报告基因,报告基因下游连接口蹄疫病毒2A蛋白基因序列,获得的基因组全长PCR融合产物纯化后,体外转录成mRNA,并转染至BHK-21细胞,采用荧光显微镜观察不同时间点绿色荧光蛋白的表达;利用构建的TMUV RNA复制子,将绿色荧光蛋白基因替换为H9亚型禽流感病毒HA基因,mRNA转染细胞72 h后Western blotting检测蛋白表达。结果显示,4种TMUV RNA复制子转染细胞的胞浆和胞核内均能观察到明显的绿色荧光信号;Western blotting能检测到HA蛋白的表达。结果表明,本研究成功构建了ΔCPrME、ΔCPrM、ΔPrME和ΔPrM等4种能有效表达外源基因的TMUV RNA复... 相似文献
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克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4基因并稳定转染胎儿成纤维细胞 #br# 总被引：2，自引：1，他引：1
【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosin beta 4,Tβ4) 基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM 2 000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】 克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142 bp,其中包含135 bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β4(XM002706880.1)同源性为100%。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和Tβ4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。【结论】克隆得到内蒙古白绒山羊Tβ4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β4基因绒山羊提供了条件。 相似文献