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为调查造成中国西北某虹鳟Oncorhynchus mykiss养殖场幼鱼出现持续性死亡的病因,采用组织病理切片观察及分子鉴定的方法对患病虹鳟进行了鲑鳟常见病毒筛查,同时采用系统发育分析、电镜观察、滴度测定及人工回归感染等方法对分离获得的毒株进行了基因型分析、显微结构观察及毒力特性分析等研究.结果表明:患病虹鳟的肝、脾及肾组织细胞发生广泛性坏死,并伴随空泡化及溶解等现象;由病鱼内脏组织制备的组织匀浆悬液均能够感染CHSE-214细胞并产生典型细胞病变(CPE);从该养殖场的不同养殖区域共分离到3株传染性胰脏坏死病毒(infectious pancreatic necrosis virus,IPNV),其中IPNV-F1和IPNV-W2属于基因组Ⅰ型,分别与IPNV中国分离株WZ2016(KX355401)和ChRtm213(KX234591)同源性最高,VP2基因片段序列一致性分别为100％和98.5％,IPNV-W1属于基因组Ⅴ型,与意大利毒株IPNV/O.mykiss/I/PN/208/Mar88(MG543567)同源性最高,二者的VP2基因片段序列一致性为99.1％;接种病毒后的CHSE-214细胞内存在大量呈晶格状排列的无囊膜病毒粒子,3株IPNV分离株在CHSE-214细胞上的平均滴度分别为107.43 TCID50/0.1 mL(IPNV-F1)、107.30 TCID50/0.1 mL(IPNV-W1)和107.29 TCID50/0.1 mL(IPNV-W2);分别以0.1 mL/尾的剂量向健康虹鳟幼鱼腹腔注射各IPNV分离株,在攻毒后60 d内虹鳟未出现死亡,攻毒后30 d时,病毒在组织中的平均滴度分别为104.50 TCID50/0.1 g组织(IPNV-F1)、105.38 TCID50/0.1 g组织(IPNV-W1)和104.13 TCID50/0.1 g组织(IPNV-W2),攻毒后60 d时,病毒在组织中的平均滴度下降为103.43 TCID50/0.1 g组织(IPNV-F1)、104.50 TCID50/0.1 g组织(IPNV-W1)和103.21 TCID50/0.1 g组织(IPNV-W2).研究表明,该发病养殖场同时存在基因组Ⅰ型和Ⅴ型的IPNV,本研究首次从同一养殖场分离到两种基因型的IPNV,可为中国传染性胰脏坏死病(IPN)的防控提供参考. 相似文献
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将狂犬病病毒Flury株(LEP)通过乳鼠脑和BHK-21细胞系交叉传代10代,并对交叉传代获得的各代毒种进行对细胞的适应性、病毒含量、毒力的测定。结果表明:病毒经乳鼠脑内传代后,能很好的在BHK-21细胞上增殖,各代次病毒含量均在10-6.0TCID50/0.1 mL以上,平均达到10-6.75TCID50/0.1 mL;对3～5日龄乳鼠平均LD50达到10-5.5/0.03 mL,对11～13g小鼠平均LD50达到10-4.6/0.03 mL;毒力试验证明,交叉传代的细胞毒对犬和家兔无致病性。 相似文献
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通过半数荧光灶形成量(FFD50)试验、小鼠半数致死量(LD50)试验、免疫组织化学试验,对10个培养代次的狂犬病病毒SRV9亲本毒株和rSRV9减毒株的病毒滴度、毒力及其致病性等病毒生物学特性进行检测,以鉴定拯救狂犬病rSRV9减毒株与亲本SRV9毒株病毒滴度及毒力的差异性。试验结果显示,10个培养代次的狂犬病病毒rSRV9减毒株FFD50值为5.44～7.46logFFD50/0.1mL,LD50值为2.47～2.68logLD50/0.03mL;亲本SRV9毒株FFD50值为6.36～6.79logFFD50/0.1mL;LD50值为5.56～5.79logLD50/0.03mL,通过免疫组织化学试验,检测出脑内注射SRV9毒株和rSRV9减毒株死亡小鼠脑神经细胞内的狂犬病病毒。 相似文献
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[目的]明确猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)JS2008株的序列特征及其连续传代后的序列变化规律,为筛选出新的疫苗候选毒株提供参考依据.[方法]将分离自华东地区某发病猪场的PEDV JS2008株在Vero细胞系上传代培养至100代,选取部分代次进行病毒滴度测定;每隔10代提取病毒RNA,采用RT-PCR对各代次病毒的S基因、ORF3基因和N基因进行扩增,并与PEDV经典和流行参考毒株进行序列比对及遗传变异分析.[结果]PEDV JS2008株经连续传代至100代,其病毒滴度由105.5 TCID50/0.1 mL上升至107.5 TCID50/0.1 mL.JS2008株在传代过程中共有11处碱基发生突变,其中9处发生在传代培养的第10~20代,变异主要位于S基因上(7/11);同时发现JS2008株及其传代株与attenuated DR13株的相似性最高.基于S基因和N基因序列构建的PEDV系统发育进化树均表明JS2008株各代次与attenuated DR13株同处于Group 3进化群;基于ORF3基因序列构建的PEDV系统发育进化树则显示,JS2008株各代次与attenuated DR13株均处于同一进化群(Group 2).[结论]PEDV JS2008株通过Vero细胞系进行体外连续传代至100代,其碱基突变主要发生在病毒传代培养的第10~20代,病毒滴度明显提高,抗原量增加,为研制新型PEDV疫苗提供可能,同时推测病毒传代培养10~20代是病毒发生变异以适应细胞培养的活跃期. 相似文献
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《天津农学院学报》2017,(2)
为了解PEDV YL112株与其他不同来源PEDV毒株之间在分子生物学上的差异,对PEDV YL112株的M基因进行了扩增和序列分析。结果表明:PEDV YL112株与参考株的M基因核苷酸同源性在97.9%~99.8%之间,显示出高度保守性。系统进化树分析表明,PEDV YL112株与经典株CV777的亲缘关系较远,而与我国地方流行毒株HLJBY分离株以及HN-XYYYP-2007的亲缘关系较近。为进一步了解该毒株的复制特征,采用Vero细胞对PEDV YL112株进行体外细胞传代适应性研究。结果表明:经过连续传代培养后,PEDV YL112株对Vero细胞的适应性显著增强,其滴度从第5代的104.8 TCID50/0.1m L提高至第40代的10~(7.6) TCID_(50)/0.1m L。本研究对于分析PEDV的遗传变异规律、了解病毒的致病特征及开发新型疫苗等均具有重要理论和现实意义。 相似文献
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猪细小病毒X株在不同细胞上增殖效果比较 总被引：2，自引：0，他引：2
为选择猪细小病毒X株增殖的细胞系,对猪细小病毒X株在ST、PK-15、CEF、Vero细胞系上增殖情况进行比较,观察病变时间和病变情况,并分别测定其TCID50和血凝价。结果表明,猪细小病毒X株在这4种细胞上都能产生细胞病变,在ST、PK-15、CEF、Vero细胞上最先开始出现病变的时间分别为24、36、72和48 h,测其在以上4种细胞上的TCID50分别为10-6.4/0.1 mL、10-5.8/0.1 mL、10-2.1/0.1 mL和10-3.2/0.1 mL,HA分别为1 210、1 28、1 23、1 25,因此,建议选用ST细胞作为猪细小病毒X株的增殖细胞系。 相似文献
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《江苏农业科学》2018,(23)
为获得肠炎型犬细小病毒分离株,采集犬细小病毒胶体金初检阳性的3份粪便,采用同步接毒法分别接种猫肾细胞(F81)和犬肾细胞(MDCK)进行分离培养,F81盲传至第2代出现细胞病变,MDCK盲传至第3代出现细胞病变,2种细胞均仅从病料3中分离出1株病毒。采用PCR方法鉴定该分离株为犬细小病毒并命名为CPV3。根据VP2基因核苷酸序列绘制的系统进化树及其推导氨基酸序列的分析,确定CPV3属于CPV-2a亚型。测定CPV3在MDCK中72 h时的组织细胞半数感染量(TCID50),第5代次(CPV-M-5)和第10代次(CPV-M-10)的TCID50数值分别为10-4. 83/0. 1 mL和10-5. 50/0. 1 mL,这为后续测定重组犬干扰素活性试验提供了材料。 相似文献
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【目的】明确猪流行性腹泻病毒（PEDV）变异株的遗传进化关系及变异株各亚型间的抗原性差异位点,为PEDV新型疫苗及诊断试剂盒的研发打下基础。【方法】将采集的3份PEDV阳性仔猪肠道组织样品接种至非洲绿猴肾细胞（Vero）上进行PEDV分离,分别采用间接免疫荧光试验（IFA）、 Western blotting、 RT-PCR和电镜观察进行鉴定,通过TCID50测定病毒滴度及绘制病毒体外增殖动态曲线;将分离毒株基因组分成33段进行RT-PCR扩增,使用Lasergene中的SeqMan拼接序列,然后以MEGA 7.0进行遗传进化分析,并以Protean中的Jameson-Wolf算法进行抗原性分析。【结果】其中1份PEDV阳性仔猪肠道组织样品在Vero细胞上盲传至第6代时出现典型的细胞病变,将其命名为CH-HK-2021毒株; IFA和Western blotting鉴定结果表明CH-HK-2021毒株能与小鼠抗PEDV N蛋白单克隆抗体发生特异性反应,且RT-PCR能扩增获得预期的目的条带,证实分离毒株即为PEDV。CH-HK-2021毒株的直径在80~120 nm,且病毒粒子表面带有刺突样的形状,属于冠状病毒;其在Vero细胞上能稳定传代,目前已传至100代。CH-HK-2021毒株在感染Vero细胞24 h后,其病毒滴度达最高值,为105.6 TCID50/mL。CH-HK-2021毒株全基因组除去poly （A）尾结构为28034 bp,与PEDV参考株在全基因组水平上的核苷酸序列相似性为96.0%~98.9%,与参考毒株S基因核苷酸序列的相似性为93.1%~99.0%,其中与变异株CH/JX/01（KX058031）的核苷酸序列相似性最高,与经典毒株AVCT12（LC053455）的核苷酸序列相似性最低。CH-HK-2021毒株属于G2a变异株,为我国当前的流行毒株。G2a毒株与G2b变异株在S基因上存在42个核苷酸差异位点,在S蛋白上则存在6处抗原性差异位点,且主要的差异位点位于S2亚基上。【结论】分离获得的CH-HK-2021毒株属于PEDV G2a变异株,为我国当前的流行毒株,与PEDV经典毒株的亲缘关系相对较远。G2a毒株和G2b变异株在S2亚基上存在多处抗原性差异位点,故推测S2亚基是导致G2a毒株与G2b变异株抗原性差异的主要原因。 相似文献
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【目的】分离并鉴定陕西省牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)。【方法】采集腹泻犊牛的肠系膜淋巴结,处理后接种于MDBK细胞,盲传,逐日观察是否有细胞病变产生。采用病毒蚀斑技术对病毒克隆纯化后,提取其RNA,进行RT-PCR鉴定。将扩增的NS5b基因克隆入pMD18-T载体中,采用碱裂解法小量提取质粒,并对质粒进行EcoRⅠ和SalⅠ双酶切、SalⅠ单酶切及PCR鉴定,对阳性克隆进行核苷酸序列测定及分析。采用病毒蚀斑试验测定分离毒株的半数组织培养感染量(TCID50)。【结果】盲传4代后细胞出现典型、规律的细胞病变。RT-PCR扩增出预期长度(360 bp)的基因片段,核苷酸序列分析结果表明,所扩增的基因为牛病毒性腹泻黏膜病病毒NS5b基因,其与BVDV VEDEVAC株NS5b基因核苷酸序列有99%同源性。BVDV陕西株的半数组织培养感染量(TCID50)为3.6。【结论】成功分离了牛病毒性腹泻病毒陕西株,为陕西省BVDV的防治提供了理论依据。 相似文献
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牛伪狂犬病病毒(闽A株)能通过鸡胚卵黄囊、尿囊腔、尿囊膜感染和繁殖,并出现不同程度的病变,经卵黄囊、尿囊腔接种的鸡胚,均于48～72小时死亡,死亡率达100％。经卵黄囊接种的鸡胚其羊水含毒量最高,对H.K细胞半数感染量(TCID_(50))达10~7/0.1ml,胚胎为10~6/0.1ml,尿囊液为10~2/0.1ml;经尿囊腔接种的鸡胚,其尿囊液及羊水均为10~5/0.1ml,胚胎为10~3/0.1ml。 该毒株对H.K、M.K等15种单层细胞均可引起细胞致病作用,其病变可分为二种类型:于单层肾细胞上形成聚融合和萎缩圆形坏死,在鸡胚等细胞上形成萎缩圆形坏死。 病毒在H.K细胞上生长繁殖后,经测定在上清液、细胞质、细胞核质中均含有10~6TCID50/0.1ml的毒价。 牛伪狂犬病病毒经H.K细胞连续传代后,对H.K细胞的毒力可达10~8TCID_(50)/0.1ml,出现细胞病变的时间由原来的24小时缩短为3小时。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒FJ07A株的分离及其结构蛋白基因的序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
从福建某猪场发生疑似"高热病"死亡的小猪病料中分离到1株病毒,该病毒在Marc-145细胞上增殖致细胞病变。对分离病毒的TCID50、动物回归试验、RT-PCR鉴定及对病毒株的结构蛋白基因进行了测定与分析。结果表明:分离毒株为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(命名为PRRSV-FJ07A),TCID50为10-6.5.mL-1,对35日仔猪具有致病性,结构蛋白基因与美洲型代表株VR-2332核苷酸同源性为89.2%～95.8%,氨基酸同源性为88.1%～96.2%;与国内PRRSV-HUN4株的核苷酸同源性为90.1%～99.7%,氨基酸同源性为88.3%～100.0%;与欧洲代表株LV的核苷酸同源性为63.7%～70.0%,氨基酸同源性为59.6%～78.9%。PRRSV-FJ07A序列已登陆Genbank,登录号为GI:283100314。 相似文献
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塞内卡病毒是新发现的一种小RNA病毒,能使猪产生类似水疱样病变,并引起仔猪死亡。塞内卡病毒作为外来病原,近几年呈现蔓延趋势。从广东阳江地区某猪场采集病变组织和血清进行检测分析,针对塞内卡病毒VP1-2A基因进行RT-PCR扩增,得到特异性的单一条带。对PCR产物序列分析表明,与2015年美国毒株USA/GBI29/2015的同源性最高、为99.2%,而与我国2017年毒株CH-HN-2017的同源性为97.1%。将水泡皮处理后接种PK-15细胞,盲传4代产生显著病变,滴度可达107TCID50/0.1mL。对采集的16份血清进行抗体中和试验表明,发病种猪的抗体效价最高达到1︰4096,9头种猪全部感染SVA,发病率为66.7%,总感染率为68.8%。 相似文献
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目的探讨A/swine/heBei/012/2008/(H9N2)猪源性流感病毒(H9N2-SIV)对C57BL/6近交系小鼠的致病特征,为进一步利用该品系瞬时电位受体M2基因(transient receptor potential melastatin 2,TRPM2)敲除小鼠模型研究H9N2-SIV致血管内皮细胞损伤的作用机制奠定基础。方法经鼻腔接种途径感染C57BL/6小鼠,观测临床症状、采食量及体质量变化、死亡率、组织病理学变化;测定病毒在组织内的复制滴度及半数致死量(50%lethal dose,LD50)。结果感染后2~8d,感染小鼠精神高度沉郁,采食量降低、体质量严重下降并出现严重的呼吸困难。5~8d内60%小鼠死亡;肺脏严重水肿、出血;病理组织学变化以肺严重水肿、出血、坏死和炎性细胞渗出为主;病毒分离显示包括脑在内的所有肺外器官均分离出H9N2病毒,但肺组织病毒滴度最高,第3天和第7天分别为5.2log2和8.1log2;该毒株的LD50为10-2.5/0.1mL。结论H9N2-SIV在未经预先适应的情况下能够引起C57BL/6小鼠以肺部损伤为主的致死性全身感染,证实以C57BL/6小鼠为基础构建TRPM2基因敲除模型可作为进一步研究H9N2-SIV致血管内皮细胞损伤作用机制的动物模型。 相似文献
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为了研究河南省当前犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)的流行情况,收集经CPV胶体金试纸检测阳性的病犬血便病料,对其处理后进行特异性PCR扩增,然后将粪便处理物经滤器过滤后接种于F81细胞,进行细胞盲传并观察细胞的病变情况,同时对病毒进行理化性质及血凝试验等检测,最后对病毒的全基因组进行测序。结果表明,该病毒经特异性PCR扩增初步鉴定为CPV,接种于F81细胞盲传2代后,出现明显细胞病变。全基因组测序显示,该病毒分离株基因组全长5 052 bp,其中包含U型发卡结构188 bp,Y型发卡结构120 bp。此外,其ORF1全长2 007 bp,能够编码非结构蛋白NS1,ORF2全长2 257 bp,能够编码结构蛋白VP1、VP2。经VP2氨基酸序列分析,鉴定其为New CPV-2b亚型,命名为CPV/HN1,该病毒分离株TCID_(50)为10~(-4.85)/0.1 mL,血凝效价为1∶256。与国内的17株参考毒株全基因组序列核苷酸同源性为96.4%～99.9%,其中与北京分离毒株同源性为99.9%。 相似文献
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通过病毒分离培养技术,从牦牛血清中分离获得一株致细胞病变的牛病毒性腹泻病毒(BVDV),命名为GSTZ毒株。经电镜观察,GSTZ毒株的直径在50~60 nm。按Karber法测算,该病毒滴度为5.0×106.5 mL-1[以组织半数感染量(TCID50)计]。利用反转录PCR(RT-PCR)测定GSTZ毒株的完整开放阅读框(ORF),全长11 691 nt,将其与参考毒株ORF在核酸序列和同义密码子使用模式等方面进行分析,确定GSTZ毒株在遗传学特性上属于基因1型家族成员。在GSTZ毒株的完整ORF中,A+U的出现频率要高于G+C,而且,病毒同义密码子的使用模式体现出对U/A结尾同义密码子使用偏嗜性高的遗传学特征。GSTZ毒株明显降低了使用含有CpG二联核苷酸的同义密码子的频率。这有助于降低病毒对宿主细胞免疫系统的刺激强度,从而促进病毒的复制增殖。研究成果可为进一步研究BVDV的相关分子机制提供试验材料,并为BVDV不同基因型的抗原关系分析与BVDV疫苗的研制奠定基础。 相似文献
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【目的】探究猪细小病毒HNLY201301株的遗传特性及其对小鼠的致病性。【方法】对HNLY201301株进行遗传学分析、生物学分析以及小鼠攻毒试验。【结果】HNLY201301株属于经典猪细小病毒1型（PPV1），具有强毒株的遗传特性。该毒株可在猪肾（PK-15）细胞上复制，其滴度最高可达10-8.45TCID50/mL。该毒株的血凝谱广，能凝集小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、鸭和猪的红细胞。该毒株可通过静脉注射和阴道灌注感染小鼠，主要引起小鼠子宫损伤。【结论】细小病毒仍在我国猪场间流行，且具有较强致病性，对该病的防控应引起重视。 相似文献