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1.
为提高重组外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达,试验采用毕赤酵母(Pichia pastoris)偏嗜性密码子改变抗菌肽cyclopsychotride的碱基序列,通过SOEing法合成后连接到pPICZα-C质粒上,从而获得分泌型重组酵母表达载体pPICZα-C-cyclopsychotride,再通过限制性内切酶BlnⅠ线性化,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞X-33中。结果表明:经PCR检测后及Zeocin抗性筛选,获得高拷贝转化子;通过琼脂孔穴扩散法检测,酵母表达上清液对革兰阳性菌和革兰阴性菌有抑菌活性;抗菌肽cy-clopsychotride经沸水、酸碱及胃蛋白酶处理后仍具有抗菌活性。 相似文献
2.
O型口蹄疫病毒VP1基因在毕赤酵母中的表达及免疫原性分析 总被引：3，自引：1，他引：2
利用毕赤酵母系统表达O型口蹄疫病毒VP1基因,并对表达的蛋白进行免疫原性鉴定。将VP1基因克隆入毕赤酵母分泌性表达载体pPICZα-C中,获得重组表达载体pPICZαC-VP1。将重组质粒pPICZαC-VP1线性化后,用电穿孔法转入酵母菌X-33,用Zeocin+YPDS平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物,并用酵母表达的VP1蛋白免疫小鼠,然后通过ELISA检测抗体水平。结果表明,酵母所表达的VP1蛋白能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。 相似文献
3.
利用舍有强启动子PAOX1和α-因子信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体pPICZαA，构建出舍牛白细胞介素2(BoIL-2)基因的重组质粒BoIL2-pPICZαA。线性化的重组表达栽体转化到巴斯德毕赤酵母X-33及KM71H中，筛选Zeoein高抗性酵母菌株，甲醇诱导目的蛋白表达。经SDS-PAGE和Western blot检测表明，BoIL-2以融合蛋白形式在胞内表达，但没能分泌到胞外。通过BoIL-2在巴斯德毕赤酵母中的表达，重点讨论了信号肽、基因的偏爱性等对外源基因分泌表达的影响。 相似文献
4.
以重组质粒pGEM-3-1E为模板，扩增了序列两端分别含有EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点的堆形艾美球虫（Eimeria acervulina）广东株3-1E基因（长度为529bp），将3-1E基因克隆至巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαC中，构建了酵母表达质粒pPICZαC-3-1E。转化毕赤酵母X-33得到含有3-1E基因的重组酵母，甲醇诱导产生的目的蛋白经SDS-PAGE分析和免疫印迹检测，表明毕赤酵母成功表达了3-1E基因。 相似文献
5.
以pGEMT/pIL-18为模板,应用PCR法扩增出猪IL-18基因,用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后,插入酵母表达载体pPICZαA中,经酶切、PCR扩增及序列测定,成功构建了酵母重组表达载体pPICZ/pIL-18,电击转化毕赤酵母X-33,应用Zeocin筛选获得高拷贝重组转化菌株,甲醇诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析重组pIL-18蛋白的表达,并用SephadexG200纯化表达的重组pIL-18蛋白.运用MTT法检测其生物学活性.试验结果表明,重组X-33酵母菌株能够表达分泌性pIL-18,诱导72 h表达量最高,其表达量占总蛋白表达量的38％.而且纯化的重组pIL-18蛋白具有明显促进淋巴细胞增殖的活性. 相似文献
6.
从国内分离的鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）众多流行株中获得超强毒株（vvIBDV）,应用RT-PCR方法,扩增得到IBDV主要保护性抗原VP2基因的开放编码框,克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαA,将该重组质粒pPICZαA-VP2以电转化方法转入毕赤酵母X-33感受态细胞中,通过PCR鉴定、表型筛选和抗生素浓度梯度筛选,获得高拷贝阳性重组酵母菌株X-33-pPICZαA-VP2。经摇瓶诱导表达试验获得稳定高效分泌表达的酵母工程菌,表达量为0.459mg/ml,聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、免疫印迹（Western-blot）以及动物试验表明,重组酵母工程菌表达的目的蛋白具有鸡传染性法氏囊病病毒天然蛋白的生物活性和免疫原性。 相似文献
7.
根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子的偏嗜性,通过SOEing法合成改造后的Cryptonin基因片段。基因克隆到pPICZα-C质粒中,获得分泌型重组酵母表达载体pPICZα-C-Cryptonin。pPICZα-C-Cryptonin通过限制性内切酶SacⅠ酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞X-33内。PCR检测Cryptonin基因与毕赤酵母染色体稳定结合,Zeocin抗性筛选,得到高拷贝转化子。在AOX(醇氧化酶)启动子调控下,Cryptonin蛋白获得分泌表达,其相对分子质量约为2700。表达产物耐热性强,在100℃条件下10min内抗菌活性不变,煮沸30min以上仍具有活性。琼脂糖孔穴扩散法检测显示表达产物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有很好的抑菌活性。 相似文献
8.
将编码牛白细胞介素-2(BoIL2)成熟肽的cDNA克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZB中，构建出含BoIL2基因的重组质粒BoIL2-pPICZB。将经Sac Ⅰ酶切后线性化的BoIL2-pPICZB电转化到巴斯德毕赤酵母X-33中，转化子经高浓度Zeoein抗性筛选鉴定后，用1％甲醇诱导目的蛋白表达。经SDS-PAGE及Western blotting检测，表明BoIL2在酵母中获得了胞内表达；通过金属螯合亲和层析(MCAC)获得纯化的重组蛋白；培养小鼠CTLL2细胞进行活性检测，证实所表达的重组BoIL2具有生物活性。 相似文献
9.
为了研制一种能够高效表达猪流行性腹泻病毒S1主要抗原表位基因的新型疫苗,将S1主要抗原表位基因整合到酵母表达载体pPICZαC中,构建了重组质粒pPICZαC-S1,对重组质粒经Sac Ⅰ酶切线性化后通过电转化法转化到毕赤酵母X-33中,经ZeocinTM抗性筛选后得到阳性转化子(pPICZαC-S1),转化子接种培养基后用甲醇进行诱导,并对诱导结果进行SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定。结果表明,纤突蛋白主要抗原表位在毕赤酵母中成功分泌表达,表达的蛋白分子质量为42 ku,且能够与PEDV阳性血清特异性结合。 相似文献
10.
《饲料研究》2017,(10)
Scygonadin抗菌肽是一类阴离子抗菌肽,从锯缘青蟹体内分离得到,对溶壁微球菌和嗜水气单胞菌具有较好的抑制作用。研究从锯缘青蟹c DNA文库中找出Scygonadin抗菌肽的成熟核苷酸序列和对应的氨基酸序列,并根据毕赤酵母的偏好密码子进行密码子优化,优化后的密码子经人工合成后连接到毕赤酵母表达载体p PCIZαA上,构建锯缘青蟹Scygonadin抗菌肽的真核表达载体,然后经电击转化至毕赤酵母X-33中。表达产物经镍柱纯化后进行SDS-PAGE电泳。结果表明,锯缘青蟹Scygonadin抗菌肽在毕赤酵母X-33中获得表达,且测序结果显示与最初设计的氨基酸序列一致;体外抑菌试验表明:纯化的重组多肽具有抑制溶壁微球菌及嗜水气单胞菌的作用,而且还可抑制金黄色葡萄球菌等多种革兰阳性菌,但其对革兰阴性菌的抑制作用相对较弱。 相似文献
11.
为研究鸡β干扰素（chicken interferon-β,ChIFNβ）蛋白在毕赤酵母中的表达及其抗病毒活性,将克隆的ChIFNβ基因亚克隆至酵母表达载体pPICZα-A中,构建重组质粒pPIC-ChIFNβ。将鉴定正确的质粒pPIC-ChIFNβ线性化,通过电转化整合到毕赤酵母菌株X-33基因组中,得到阳性菌株。经1.0%甲醇连续诱导4 d,表达产物利用SDS-PAGE电泳、细胞病变抑制法等进行分析。ChIFNβ在酵母中获得了分泌型表达,表达产物分子质量约为17 ku。表达产物以细胞病变抑制法检测其活性,效价为107.5 U/mL;在鸡胚中能有效抑制禽流感病毒H9N2的增殖。动物攻毒保护试验结果显示,表达的蛋白可提供70%的免疫保护。表达的ChIFNβ蛋白具有较好的抗病毒活性,本研究可为ChIFNβ的应用提供重要参考。 相似文献
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应用PCR技术从含有罗曼鸡白介素18全长基因质粒pMD18-T-ChIL-18中扩增出鸡IL-18成熟肽基因,亚克隆于毕赤酵母表达载体pPICZαA上,构建了重组质粒pPICZαA-ChIL-18。经酶切、PCR和测序鉴定正确后,电转化入毕赤酵母菌X-33,筛选多拷贝单克隆进行诱导表达,并进一步分析了培养液pH值、诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度对重组菌表达水平的影响,从而获得最优化的表达条件。结果表明,重组毕赤酵母菌能够表达鸡IL-18,且在培养液pH6.0,甲醇诱导浓度1.5%,诱导温度26℃的条件下诱导96 h,目的蛋白的表达量最高,可占菌体总蛋白的60.2%。本文为鸡IL-18的规模化发酵生产奠定了基础。 相似文献
14.
表达犬细小病毒VP2蛋白（CPV—VP2）,用于重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,并为犬细小病毒病的诊断奠定基础。采用PCR方法对CPVVP2基因进行扩增,将CPVVP2基因克隆到毕赤酵母分泌表达载体pPICZAA中,构建真核重组表达载体pPICZAA-VP2,将该重组质粒线性化后,转化巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）X-33中,甲醇诱导表达CPVVP2,SDs_PAGE和Westernblotting鉴定表达蛋白。结果,成功扩增了CPV—VP2基因,构建了真核重组表达载体pPICZAA—VP2,在毕赤酵母菌中表达出约68000蛋白。Western—blotting鉴定表明,表达蛋白为目的蛋白VP2。表达菌株扩大表达体系于培养基中培养,上清液用70％过硫酸铵4℃沉淀浓缩,采用His选择镍-亲和层析柱分离纯化获得重组的酵母表达的带组氨酸标签的VP2蛋白,表达量约3mg／L。结果表明,在毕赤酵母中成功地表达了CPV—VP2蛋白,且能被犬细小病毒VP2单克隆抗体特异识别。 相似文献
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构建表达抗菌肽Cecropin AD蛋白的真核重组表达质粒pGAPZα-A-CAD,并转化酵母菌Pichia pastoris X-33,Zeocin抗性筛选阳性重组子,通过PCR鉴定、Tricine-SDS-PAGE分析和琼脂孔穴扩散法筛选获得抗菌肽CAD组成型表达菌株,并采用pH-溶氧监控策略进行工程菌Pichia pastoris X-33/pGAPZα-A-CAD的50 L中试发酵研究。结果表明,本实验成功实现了抗菌肽CAD在毕赤酵母Pichiapastoris X-33中的组成型表达pGAPZα-A,Tricine-SDS-PAGE分析显示在4.0 kDa处有明显的目的条带,工程菌经50 L发酵罐培养48 h后收获的上清液,100℃热处理10 min后,对金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922等均有明显的抑杀作用。抗菌肽的组成型表达方法在本研究中得到了成功应用,中试研究为以后的规模化生产和应用奠定了基础。 相似文献
17.
前期采用差减杂交的方法筛选到新型欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin,其基因全长为477 bp,编码159个氨基酸,理论分子量约17.4 kDa。为了获得具活性的大量表达的抗菌肽,本研究利用毕赤酵母表达了elecilin。首先将elecilin基因克隆至酵母分泌表达载体pPICZaA,构建了重组分泌表达质粒pPICZaA-elecilin,电击转化毕赤酵母X-33。经Zeocin筛选和PCR鉴定,获得重组酵母菌,通过甲醇诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定,证实诱导后的培养基中存在与预期分子量大小相一致的蛋白,能被His-tag单克隆抗体识别,表明利用酵母成功表达了欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin。这为进一步研究该抗菌肽的功能及作为饲料添加剂的应用奠定了基础。 相似文献
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为高效表达黑曲霉糖化酶基因,根据GenBank中糖化酶的氨基酸序列(登录号:AY652617),选用毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏嗜性,全基因合成新的cDNA序列。改造后的基因克隆到pGAPZαA质粒中,获得重组分泌型酵母表达质粒pGAPZαA-EC,经限制性内切酶Bln Ⅰ酶切线性化后,电击转化入毕赤酵母细胞X33内。经高浓度博莱霉素抗性筛选,得到高拷贝转化子,PCR检测结果显示,糖化酶基因与毕赤酵母染色体稳定结合。糖化酶蛋白获得分泌表达,SDS-PAGE分析其分子质量约为80 ku,其表达量约为180 mg/L。表达产物经Starch-PAGE活性染色,显示其具有酶学活性。 相似文献