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为了研究副溶血弧菌双重PCR检测方法,试验采用tlh和toxR基因序列设计2对特异性引物进行双重PCR检测,扩增出450 bp和368 bp目的片段。结果表明:在同一PCR反应体系中仅副溶血弧菌可同时扩增出2种基因片段,4株对照菌无任何扩增条带;该双重PCR检测方法最低能检测1.660 7×103cfu/mL菌体浓度的副溶血弧菌。说明试验所建立的双重PCR检测方法特异性强、敏感性高、方法简单、用时短,可用于副溶血弧菌引起的水产动物疾病的诊断与分子流行病学调查。 相似文献
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基于tlh基因病原副溶血弧菌LAMP检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为了研究副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)的快速分子生物学检测方法,试验以副溶血弧菌特异性tlh基因为分子靶标设计引物,利用环介导恒温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立病原副溶血弧菌的快速检测方法。结果表明:特异性检测仅副溶血弧菌基因组DNA可扩增出阶梯状条带,且反应产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ后呈现明显的绿色阳性反应;而鳗弧菌、河口弧菌、美人鱼弧菌、霍乱弧菌、哈氏弧菌、鱼肠道弧菌这6种对照病原菌均未出现任何扩增条带,且反应产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ后呈现橙色阴性反应;灵敏度检测的最低检测限为42 cfu/mL;对人工染菌的9种水产品检测均可获得阳性扩增结果;该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需1 h左右,较传统方法操作简单、耗时短、不需昂贵仪器。说明该方法可用于针对副溶血弧菌的进出口检验检疫、食品安全检测及由该菌引起的水产动物疾病的诊断与分子流行病学调查。 相似文献
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为了实现副溶血弧菌的现场快速筛查,降低副溶血弧菌引起的食品安全问题,保障食品安全,试验利用副溶血弧菌tdh基因建立了可以快速检测水产品中副溶血弧菌的恒温环介导扩增(LAMP)方法,并通过添加钙黄绿素实现现场快速判定水产品中是否存在副溶血弧菌,同时利用建立的方法对螃蟹及贝类共40份水产品进行检测。结果表明:试验建立的方法具有良好的特异性,灵敏度可达7.92×10~(-3) ng/μL,实时浊度仪观察只有副溶血弧菌扩增出曲线,采用钙黄绿素法观察只有副溶血弧菌的扩增体系见到黄绿色。检测方法初步应用结果显示,从1例板蟹和1例蛤蜊中检测到副溶血弧菌核酸,证实2例水产品中存在副溶血弧菌。说明试验建立的方法可用于水产品中副溶血弧菌的现场检测。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2015,(6)
根据副溶血弧菌种特异性基因(tox R)、耐热直接溶血素基因(tdh)和相对耐热直接溶血素基因(trh)为靶基因分别设计引物,进行PCR扩增及反应条件的优化,建立了检测含有溶血素毒力基因的致病性副溶血弧菌的多重PCR方法。3对引物能分别特异性地扩增出368、269、486 bp的目的片段。副溶血弧菌均能扩增出tox R基因,不含溶血素基因的菌株(tdh-/trh-)仅扩增出1条目的片段,而含不同溶血素基因的致病性副溶血弧菌则分别扩增出2条(tdh+/trh-或tdh-/trh+)和3条(tdh+/trh+)特异性条带。检测其他非副溶血弧菌的供试菌,则不出现任何扩增条带。人工模拟样品检测结果显示对致病性副溶血弧菌的最低检测浓度为103CFU/m L。结果表明该多重PCR检测方法具有较好的特异性和灵敏性,对检测致病性副溶血弧菌有重要意义。 相似文献
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基于toxR基因的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测病原副溶血弧菌方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
基于副溶血弧菌toxR基因保守序列设计1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测副溶血弧菌的方法。常规PCR检测,副溶血弧菌扩增出大小为368bp的目的片段,其他4种病原细菌均为阴性;SYBRGreenⅠ实时定量PCR扩增曲线反映了PCR的指数增长阶段和平台阶段;在Tm为85℃,扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体;所制作的标准曲线在2.7×108～2.7×102拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.998,能对副溶血弧菌进行准确的定量分析;该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需4～5h,较传统方法敏感、操作简单,耗时短,是副溶血弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及食品中针对副溶血弧菌安全检测的有效手段。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2015,(6)
副溶血弧菌是引起细菌性食物中毒的主要食源性致病菌,耐热直接溶血毒素(theromostable direct hemolysin,TDH)是其公认的主要致病因子。本研究根据已发表基因序列(Gen Bank登录号:M10069)设计引物,以副溶血弧菌SHJLA株基因组DNA为模板,扩增编码TDH蛋白的基因,克隆至表达质粒p ET28a(+)中,重组质粒经限制性酶切鉴定后测序,结果表明插入片段长度为576 bp。重组原核表达质粒p ET28a-tdh转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经诱导可表达分子量约为27 k Da的融合蛋白,主要以包涵体形式表达。对包涵体进行复性,Western blot分析表明经过复性后的重组蛋白能够被感染副溶血弧菌SHJLA株的小鼠血清识别。重组蛋白免疫家兔,ELISA检测多抗血清效价在1:256 000以上。将该多抗初步应用于斑点-ELISA(DotELISA)方法的建立,TDH阳性的致病性副溶血弧菌检测到阳性斑点,而TDH阴性的副溶血弧菌及其他细菌未检测到特异性斑点。本研究可为深入研究TDH的蛋白功能,建立致病性副溶血弧菌免疫学快速诊断方法以及保护性疫苗的研制提供研究基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(11):1875-1881
为建立创伤弧菌和副溶血弧菌的双重环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,本试验以创伤弧菌metalloprotease基因和副溶血弧菌ompA基因为靶点设计LAMP扩增引物,并在内引物间添加不同的酶切位点,通过对反应时间和温度的优化及酶切反应,成功建立了双重LAMP检测方法,并对其检测特异性、灵敏度和实际应用性进行了研究。结果显示,62℃反应45min时可同时检测到2种弧菌的存在,通过限制性内切酶酶切,可准确区分2种弧菌。该方法比普通PCR检测方法灵敏度高102~103倍。选择17株细菌菌株作为检测模板,发现除创伤弧菌和副溶血弧菌反应结果呈阳性外,其他均为阴性。以大菱鲆作为实验动物,检测双重LAMP技术的实际应用可能,该方法可准确检测并鉴定出组织和血液中感染的细菌种类,其灵敏度可达374~410CFU/g(mL)。SYBR GreenⅠ是一种结合于DNA双链小沟中的荧光染料,反应产物加入该染料后,极易用肉眼判别。本试验成功建立了创伤弧菌和副溶血弧菌的双重LAMP检测方法,该方法可用于水产养殖中病原菌的早期诊断。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2021,(3)
为建立副溶血弧菌快速检测方法,本研究以副溶血弧菌不耐热溶血素(tlh)基因作为靶序列设计特异性引物,经反应条件优化建立了检测副溶血弧菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)方法。优化试验结果显示该方法在37℃和35 min条件下检测效果最佳;特异性试验结果显示,该方法除对副溶血弧菌的检测结果为阳性外,对其余8种常见的弧菌检测结果均为阴性,特异性较强;敏感性试验结果显示,该RPA方法对副溶血弧菌的检出限为104cfu/mL,敏感性较高。利用建立的RPA检测方法、培养法及普通PCR方法同时对采集的48份海鲜样品进行检测,结果显示:该RPA方法能够对临床样品快速检测,并且检测结果与国家标准培养法及普通PCR方法的符合率为100%,能够满足临床样品的检测需求。本研究建立了一种检测副溶血弧菌的方法,该方法具有反应快速、特异性强、敏感性高等特点,为副溶血弧菌的快速检测奠定基础。 相似文献