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1.
设计了1对特异性引物,应用降落PCR法对减蛋综合症病毒(EDSV)六邻体蛋白基因进行了扩增。将扩增产物克隆至pMD18-T载体中,经酶切和PCR鉴定后,初步证明了目的片段的正确性。进一步经核苷酸序列测定表明,所扩增的基因片段长度为2.74kb,共编码910个氨基酸,与由EDSV弱毒株(AA-2)全基因组的Hind酶切片段测序所得到的六邻体结构基因推测的氨基酸序列相比,有11处氨基酸发生了变异。 相似文献
2.
减蛋综合征病毒六邻体蛋白基因的克隆与真核表达载体的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
应用降落PCR技术扩增出减蛋综合征病毒六邻体蛋白基因并将其克隆至pMDT-18载体上,酶切、PCR及测序结果表明插入的片段为目的基因.切下该目的基因定向克隆至pcDNA 3质粒构建六邻体蛋白基因真核表达载体pcDNA 3-hexon,经各种酶切、PCR鉴定及进一步测序鉴定,证明六邻体蛋白基因片段所插入的位置、大小、核苷酸序列和阅读框架正确无误,从而为下一步的转染、表达及进一步阐明EDSV六邻体基因结构与功能的关系和减蛋综合征基因工程苗的研究奠定了良好的基础. 相似文献
3.
【目的】研究减蛋综合征病毒(EDSV)河南HN03株纤维蛋白基因全序列,为进一步分析EDSV纤维蛋白基因的结构、功能以及EDSV基因工程疫苗的研究奠定基础。【方法】根据GenBank中收录的EDSV纤维蛋白基因序列(Z86065),设计并合成了1对引物,PCR扩增EDSV河南HN03株纤维蛋白基因。将扩增产物克隆入pTG19-T载体并测序。【结果】测序结果表明,HN03株纤维蛋白基因为1935 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码644个氨基酸,推导的氨基酸序列有5个潜在的N-糖基化位点,有5个与二硫键形成有关的半胱氨酸。序列分析表明,EDSV HN03株与EDSV国际标准株AV-127纤维蛋白基因核苷酸同源性为99.3%,氨基酸同源性为99.2%;与鹌鹑腺病毒QU株纤维蛋白基因核苷酸同源性为98.9%,氨基酸同源性为98.4%。【结论】腺病毒纤维蛋白基因相当保守。 相似文献
4.
种番鸭产蛋下降综合征病毒的分离及其PCR鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
从临床表现产蛋率下降、产蛋异常的种番鸭输卵管粘膜中分离到1株病毒,经血凝及血凝抑制试验鉴定为产蛋下降综合征病毒,命名为E05。参照GenBank上发表的鸭源产蛋下降综合征病毒基因组序列的保守区设计1对引物,通过PCR技术扩增出286 bp的基因片段,将扩增产物与T载体连接后,转化感受态细胞,筛选出阳性重组质粒进行测序分析。测序结果与GenBank上已发表的EDSV 100kD蛋白序列比对,扩增片段与已登陆的基因片段完全相符,同源性100%。 相似文献
5.
减蛋综合征病毒五邻体重组蛋白的原核表达及抗原性鉴定 总被引：4，自引：1，他引：3
根据减蛋综合征病毒(EDSV)AV-127株的全基因序列(GenBank序列号AC000004)设计了1对引物,采用PCR扩增出五邻体(Penton)完整基因,将其连接到克隆载体pMD18-T,经过鉴定后测序。序列分析表明,所获得的DNA片段核苷酸序列和GenBank中AV-l27株的五邻体比较有9个碱基突变,但利用DNAstar分析,两者的氨基酸完全一致。然后酶切胶回收后将目的片段连接到质粒表达载体pET-30a(+),获得的阳性克隆命名为pET-30a-Penton。将pET-30a-Penton转化E.coli Rosetta,经37℃、1.0 mmol·L-1 IPTG诱导表达5 h,SDS-PAGE分析超声裂解后的上清和沉淀,结果显示目的蛋白以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为54.0 ku。Western Blot试验结果表明目的蛋白具有较好的抗原活性。 相似文献
6.
参考GenBank上公布的禽呼肠孤病毒(ARV)和番鸭呼肠孤病毒(MDRV)σ非结构基因(σNS)序列设计合成一对引物,对番鸭源呼肠孤病毒YJL株σNS全基因进行RT-PCR扩增,克隆到pMD18-T载体中,并对克隆产物进行PCR鉴定和测序;YJL株σNS的编码基因位于S4节段,基因全长1192 bp,其5′端和3′端序列分别为5′-GCTTTT和3′-TATTCATC,具有典型的禽正呼肠孤病毒基因末端碱基序列;σNS基因只有一个有效阅读框(24-1127 bp),编码由367个氨基酸组成的σNS蛋白;σNS蛋白的分子质量约为40.57 ku,等电点(PI)为7.875.YJL株与法国MDRV-89026株σNS基因核苷酸的同源性为77.8%,推导氨基酸的同源性为90.2%;与ARV-S1133株σNS基因的同源性为99.4%,推导氨基酸的同源性为99.5%;系统进化树分析表明,YJL株σNS基因和蛋白与S1133株的亲缘关系更近,处在ARV分支上.可见,番鸭源呼肠孤病毒YJL株属于ARV,同时也表明我国发病番鸭群中存在不同基因群的呼肠孤病毒感染. 相似文献
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山东省猪瘟流行毒株E2基因主要抗原编码区序列差异分析 总被引：1，自引：0，他引：1
用RT-PCR方法对山东省猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的E2基因进行克隆,用DNAstar软件对获得的CSFV及已发表的CSFV毒株E2基因核苷酸和氨基酸序列进行了比较和分析,构建了CSFV遗传发生树.结果表明:扩增的12株猪瘟流行病毒的E2基因长度均为270bp,与预期大小一致;12株病毒株均属于1个组群中的2个亚群,其中,病毒株SDTA-1、SDTA-2属于同一个亚群,E2基因与疫苗株HCLV相比,核苷酸、氨基酸同源性分别为83.5%、88.9%,其余10株病毒株属于同一个亚群,E2基因与疫苗株HCLV相比,核苷酸、氨基酸同源性分别为80.5%～83.5%、82.2%～84.4%. 相似文献
8.
单核细胞增生性李斯特氏菌溶血素基因克隆及序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
构建单核细胞增生性李斯特氏菌 (L isteria Monocytogenes,L MO)溶血素基因重组质粒。文章采用 PCR方法扩增出 L MO 0 5 86株溶血素 (Hemolysin,hly)基因 ,将其克隆到 p MD18- T中 ,转化 E.coil TGI。经酶切及 PCR鉴定 ,而后进行测序。 hly基因体外扩增产物大小约为 16 4 6 bp。重组质粒经酶切及 PCR鉴定表明为正确重组子。核苷酸序列鉴定表明 ,其核苷酸序列与国外报道的 L MO F6 789株、L MO F2 36 5株同源性分别为 99.70 %和 99.39%。推导出的氨基酸序列与其相应菌株比较 ,同源性分别为 99.82 %和 98.90 %。在国内首次克隆到 L MO hly全基因 ,为研究hly的功能和探讨 hly蛋白作为特异性诊断靶抗原的研究奠定了基础。 相似文献
9.
水貂肠炎病毒B株全基因克隆与序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
将水貂肠炎病毒基因组分4个重叠片段进行PCR扩增,并将产物克隆到pMD18-T载体中,测定基因组近全长序列。其中编码水貂肠炎病毒非结构蛋白基因(NS1基因)全长为2 007 bp,编码668个氨基酸;编码结构蛋白基因(VP2基因)全长为1 755 bp,编码584个氨基酸。序列分析结果表明:水貂肠炎病毒B株与犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒NS1序列之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.8%～99.2%和98.8%～99.2%,与其他细小病毒毒株VP2序列之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.5%～99.8%和97.8%～99.5%,与MEVantigenic type 2株在亲缘上有着最密切关系。 相似文献
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广西猪瘟流行毒与C-株疫苗毒gp55（E2）主要抗原区DNA序列差异的比较 总被引：7，自引：1，他引：7
采用反转录 PCR(RT- PCR)和套式 PCR(nest Polym erase Chain Reaction,n PCR)扩增出 3株广西省近期 (1999～ 2 0 0 0年 )猪瘟流行野毒的 E2 基因 ,将其分别克隆于 PMD- 18T载体上并进行了核苷酸序列测定 ,根据 C株及 Brescia和 Alfort株确定起始氨基酸三联体的正确位置后进行氨基酸序列推导 ,同时进行了同源性比较及 E2 糖蛋白结构的分析。结果表明 ,所测 3株 HCV E2 基因的长度均为 1170 bp,编码的氨基酸序列均包括完整信号肽序列和部分跨膜序列 ,共由 384个氨基酸组成。3株流行毒的 E2 基因核苷酸序列同源性为 90 .10 %～ 98.5 4%,相应的氨基酸序列同源性为 89.5 9%～ 97.92 %。这 3株流行毒与 C-株兔脾组织毒 (疫苗种毒 ) E2 基因的核苷酸序列同源性为 82 .87%～ 83.99%,相应的氨基酸序列同源性为 86 .98%～ 90 .10 %,表明近期猪瘟流行毒与 C-株疫苗毒的 gp5 5蛋白之间存在一定的差异。 相似文献
11.
根据减蛋综合征病毒(EDSV-76)AV-127株的全基因序列(序列号BK000404),用Premier5.0软件设计22对引物,利用PCR方法对EDSV-76病毒NE4株的全基因组进行了分段扩增、克隆和序列测定,并用DNAStar分析软件对各片段的测序结果进行拼接,将该序列与GenBank中已登录的相应序列进行同源性分析,并用六邻体蛋白构建进化树.结果表明:NE4株基因组序列全长33214bp,GC含量为43%,与国际标准株AV-127相比,核苷酸序列同源性为99.6%.碱基的插入或缺失主要在非编码区,在100K蛋白编码区距羧基端1/10处插入了1个碱基C,其ORF编码696个氨基酸,而AV-127株100K蛋白编码709个氨基酸,预计其发挥功能的基团在N端.蛋白同源性分析表明,EDSVNE4株主要蛋白与羊腺病毒OAV(Ovine adenovirusD)、牛腺病毒BAV(Bovine adenovi-rusD)和蛇腺病毒SAV(Snake adenovirus)有较高的同源性,而与禽腺病毒Ⅰ群(CELO)的同源性较低,说明NE4株与禽腺病毒Ⅰ群亲缘关系较远,进化树分析也证实了此特性. 相似文献
12.
利用RT-PCR及Nest-PCR技术扩增出了C-株兔脾组织毒P80基因,将其克隆到PGEM-T载体中,测定了其核苷酸序列并推导出了氨基酸的序列。将C-株P80基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列与已发表的HCV Alfort株、Brescia株、C株细胞（SK6）毒P80基因核苷酸及氨基酸序列进行比较,结果表明C-株P80基因与C株SK6细胞毒P80基因的同源性最高为99%,与Alfort株P80基因的同源性最低为87%;氨基酸同源性均在98%以上。表明了中国的C-株毒与荷兰所发表的C株毒的缘源关系,同时也证实了HCV P80基因的高度保守性。核苷酸序列分析表明,P80基因可编码丝氨酸类蛋白酶及RNA解旋酶。 相似文献
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参考Gen Bank公布的NADL-2株序列,设计出1对引物,并利用该引物扩增了猪细小病毒NJ-1株VP2主要抗原基因,将其克隆到pGEM-T Easy载体上,测序获得882 bp核苷酸序列,并推导出其氨基酸序列,共编码294aa,与NADL-2株相应的序列进行比较分析,两者核苷酸同源性为99.2%,氨基酸同源性为99%;应用DNAStar软件对氨基酸的抗原表位进行了预测,共有9个抗原表位,分别在氨基酸N端的第34-40,62-70,88-92,137-157,167-181,189-200,206-219,258-272和280-294区段,此序列具有较好的免疫原性. 相似文献
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参照GenBank上登录的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)美洲型AF494042株ORF5基因序列,设计1对特异性引物,应用RT-PCR扩增出PRRSV河南09分离株(HN-09)的ORF5基因,经与pGEM-T Easy载体连接后,筛选出阳性重组质粒进行序列测定,并利用DNASTAR软件对序列进行分析.结果表... 相似文献
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[目的]了解广西猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的变异规律及其与疫苗株的基因差异,为正确选择猪瘟疫苗和防制广西猪瘟提供参考依据.[方法]以广西本地的阳性猪瘟病料为研究对象,应用RT-PCR扩增CSFV的E2基因,经克隆、测序后用DNASTAR软件对其序列进行比对分析,并绘制遗传进化树.[结果]从41份疑似猪瘟病料中共扩增出4个阳性样品的E2基因(1140 bp),经序列比对分析发现,扩增获得的4株CSFV毒株(GXGG1、GXLC1、GXLC2和GXNN1)与兔化弱毒株(HCLV)、Shimen强毒株的核苷酸同源性为82.1%~82.3%和82.9%~83.4%、其推导氨基酸同源性为88.4%~89.2%和88.9%~90.0%,4株毒株间的E2基因核苷酸及其推导氨基酸同源性分别为90.8%~99.6%和94.2%~99.5%,且均属于基因群Ⅱ;E2基因推导的氨基酸表明,E2蛋白空间结构及抗原结构的氨基酸位点693Cys、737Cys、792Cys、818Cys、828Cys、856Cys、833Pro、834Thr、837Arg均未发生变异,但其单抗识别位点G713E、N729D、K734R发生变异.[结论]近年来广西CSFV流行毒株的变异未出现较大差异.与HCLV株、Shimen强毒株亲缘关系较远,但与Paderborn株、GXWZ02株亲缘关系较近. 相似文献
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为对猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)进行分子生物学研究,将该病毒YL株基因组分为4个重叠片段进行PCR扩增,并将扩增产物克隆到pGEM-T载体中,测定病毒基因组全长序列。另外,应用其中1对引物,通过PCR方法扩增出一段包含VP2主要抗原区域的片段,构建重组质粒pET-VP2,IPTG诱导表达。序列分析结果表明,PPV YL株和国内外PPV分离毒株NS1基因核苷酸同源性为97.8%～99.4%,氨基酸同源性为96.7%～99.5%,与国内外主要毒株VP2基因核苷酸同源性为98.7%～99.7%,氨基酸同源性为97.4%～99.8%。进化树分析表明,PPV YL株与BQ株(EU790641)毒株处在同一分支上,遗传距离最近。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子质量为56ku,经Western blotting检测具有生物学活性。 相似文献