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1.
《中国预防兽医学报》2016,(11)
为真核表达梅花鹿干扰素β1(IFN-β1)并检测其抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)活性,本研究以梅花鹿肝脏基因组为模板,通过PCR扩增出IFN-β1的编码区序列,克隆于真核表达载体pVAX1中,构建重组真核表达质粒pVAX1-IFNβ1,并转染MDBK细胞进行表达。结果显示,将pVAX1-IFNβ1转染MDBK细胞后经western blot和间接免疫荧光法检测和鉴定证实,转染的重组质粒能够在MDBK细胞中正确表达目的蛋白,表达的重组蛋白约为25 ku。此外,采用细胞病变抑制法检测表明转染后重组细胞表达的IFN-β1具有抗BVDV活性。本研究为梅花鹿IFN-β1蛋白抗病毒分子机制的研究及抗病毒药物的开发奠定了基础。 相似文献
2.
荷斯坦奶牛IFN-α基因的克隆表达和抗病毒活性分析 总被引：6，自引：0，他引：6
本研究通过 PCR从荷斯坦奶牛基因组 DNA中克隆了 IFN- α(Bo IFN- α)基因 ,PCR产物双酶切后与载体 PQE30连接 ,构建重组质粒 PQE30 /Bo IFN- α,进行测序和诱导表达。测序结果表明 ,荷斯坦奶牛 IFN- α基因全长为 4 98个核苷酸 ,含一个ORF,编码 16 6个氨基酸的成熟蛋白 ,与所报道的 Bo IFN- αA亚型只存在一个点变异。表达产物经 SDS- PAGE和 Western blot分析 ,表达出 2 0 KD的融合蛋白 ,表达量占菌体总蛋白的 2 2 % ,表达产物以包涵体形式存在 ,约占沉淀蛋白的 32 %。包涵体提取物经尿素变性、透析复性后初步纯化 ,重组牛 IFN- α(r Bo IFN- α)初提物在牛肾细胞 (MDBK) /水泡性口炎病毒 (VSV)和鸡胚成纤维细胞 (CEF) /VSV细胞系上的活性分别为和 1.0～ 2 .3× 10 6 U/mg和 1.3～ 2 .6× 10 5U/mg,对传染性牛鼻气管炎病毒 (IBRV)感染有一定的抑制作用 ,抗病毒活性为 7.8× 10 5U /mg。结果显示大肠杆菌可以高效表达具有生物学活性的 r Bo IFN-α。 相似文献
3.
为在大肠杆菌表达系统中高效表达牛α-干扰素(bovine interferon-α,Bo IFN-α),将经密码子优化后的牛α-干扰素成熟蛋白基因合成并克隆到表达载体p Cold II中,转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,获得可溶性的表达蛋白。对重组菌表达条件进行优化,结果显示在IPTG浓度为0.64 mmol/L,诱导温度为15℃,诱导时间为9 h的条件下,可溶性目的蛋白的表达量最高。重组蛋白经镍柱纯化后的纯度为99.2%,表达量为36 mg/L菌液。重组蛋白在MDBK细胞上抗水泡性口炎病毒的活性为1×106U/mg。 相似文献
4.
《蚕业科学》2015,(4)
将优化合成的猫ω型干扰素基因Fe IFN-ω2和Fe IFN-ω9克隆到杆状病毒转移载体p VL1393的多角体蛋白基因启动子下游,与orf1629基因缺损的家蚕杆状病毒Bm-Bacmid DNA共转染Bm N细胞进行同源重组,将获得的重组病毒感染家蚕5龄幼虫,利用家蚕生物反应器表达猫ω型干扰素。采用微量细胞病变抑制法在CRFK细胞/VSV*GFP系统上检测家蚕幼虫血淋巴中表达的重组猫ω型干扰素具有抗病毒活性,其中表达产物重组Fe IFN-ω2的抗病毒活性可达6.3×105U/m L,而重组Fe IFN-ω9的抗病毒活性较低。研究结果为利用家蚕生物反应器生产重组猫ω型干扰素生物制剂奠定了一定的试验基础。 相似文献
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为表达具有抗病毒活性的梅花鹿干扰素β1(IFN-β1),本研究通过PCR扩增梅花鹿IFN-β1基因,将其克隆至原核表达载体p ET-28a中,构建重组质粒p ET-IFNβ1,并将其转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后,得到高效表达。SDS-PAGE与western blot分析结果表明,梅花鹿IFN-β1重组蛋白的分子量大小约为24 ku,表达产物主要为不溶性的包涵体,表达量占菌体总蛋白的59.02%。将Ni柱纯化的p ET-IFNβ1诱导表达产物复性后,细胞病变抑制法检测表明表达产物具有抗病毒活性,其抗病毒活性可以达到10×53.81U/0.1 m L。梅花鹿INF-β1的表达为梅花鹿INF-β1的应用奠定了基础。 相似文献
6.
为进一步探究羊干扰素α和γ的抗病毒活性效果，根据GenBank羊IFN-α和IFN-γ基因序列，使用Linker连接合成目的序列，成功构建了3种重组表达质粒pET28a-OviIFN-γ、pET28a-OviIFN-α、pET28a-OviIFN-γ/α并进行原核表达。用细胞病变抑制法和RT-qPCR测定重组蛋白rOviIFN-α、rOviIFN-γ和rOviIFN-α/γ的抗病毒活性。结果表明，rOviIFN-α、rOviIFN-γ和rOviIFN-α/γ在牛肾细胞(MDBK)以及非洲绿猴肾细胞(Vero)细胞中有抗病毒活性，且rOviIFN-α/γ的抗病毒效果最优；rOviIFN-α、rOviIFN-γ和rOviIFN-α/γ能够显著上调MDBK以及Vero细胞中4种干扰素刺激基因(IFN stimulated genes, ISGs)的mRNA转录水平，且rOviIFN-α/γ对干扰素刺激基因的上调水平最显著。综上所述，本试验表达的重组蛋白都具有抗病毒作用，其中串联表达的重组蛋白抗病毒活性以及干扰素刺激基因转录水平较高。 相似文献
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应用RT-PCR技术从多聚肌苷酸多聚胞苷酸(poly(I∶C))刺激的ST细胞中扩增猪干扰素-λ3(PoIFN-λ3)基因。基因序列分析表明,PoIFN-λ3基因全长为588bp,与绵羊IFN-λ3基因(XM_004015683)的同源性最高(87.6%);分子遗传进化树分析表明猪IFN-λ3与牛、绵羊亲缘关系最近,与马、人、黑猩猩和鸡的亲缘关系次之。将PoIFN-λ3成熟肽序列定向插入pET-32a载体,转化宿主菌Rosetta gami B,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测分析表明,PoIFN-λ3基因获得表达,重组蛋白大小为32 000,以包涵体形式存在。重组蛋白经变性、纯化、复性后,用细胞病变抑制法在MDBK/VSV系统上进行抗病毒活性的测定。结果显示,复性后重组蛋白的含量约为1g/L,抗水泡性口炎病毒(VSV)活性达到2×103 U/mg,表明重组poIFN-λ3具有较高的抗病毒作用。 相似文献
9.
《中国预防兽医学报》2015,(9)
为研究ISG15蛋白与猪源牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV-2)相互作用关系,本研究通过RT-PCR扩增ISG15基因并克隆于真核表达载体p EC129中,转染于MDBK细胞,经G418筛选获得稳定表达ISG15蛋白的细胞系E53。将猪源BVDV-2分别感染E53细胞和MDBK细胞,收集不同时间点的细胞培养液并测定病毒的TCID50。结果显示ISG15蛋白对猪源BVDV-2复制具有明显抑制作用。利用荧光定量PCR检测猪源BVDV-2感染E53细胞内ISG15基因表达的变化,结果表明,病毒感染的E53细胞内ISG15基因的表达量明显高于对照组,表明猪源BVDV-2感染能够显著提高ISG15基因的表达。此外,利用荧光定量PCR检测经poly I:C处理后感染SH-28株的MDBK和E53细胞内IFN-α和IFN-β表达情况。结果表明MDBK细胞内IFN-α和IFN-β表达量分别下降约2.49倍和3.31倍,而在E53细胞中,IFN-α和IFN-β的表达量分别下降约6.29倍和9.71倍,表明过量表达ISG15蛋白能够促进猪源BVDV-2对Ⅰ型IFN的抑制作用。本实验为进一步研究猪源BVDV-2逃逸细胞先天免疫机制奠定了基础。 相似文献
10.
《中国动物传染病学报》2019,(5)
为了解猪源IFN-λ3的体外抗病毒活性,本研究利用RT-PCR技术从猪肺巨噬细胞(CRL2845)中扩增获得猪源IFN-λ3基因(pIFN-λ3),并将pIFN-λ3基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pCDNA3.1-pIFN-λ3,利用脂质体转染293细胞。48 h后通过Western blot分析p IFN-λ3瞬时表达情况,取转染后上清分别作用于PK15、MDCK细胞进行p IFN-λ3抗病毒活性分析。结果显示,本研究成功扩增获得pIFN-λ3基因,并在293细胞内成功表达;瞬时表达能够抑制表达绿色荧光蛋白的重组水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus-green fluorescent protein,VSVG)在PK15、MDCK细胞上的增殖。本研究结果为深入研究猪源IFN-λ3在宿主抗病毒免疫和黏膜免疫中的作用机理及其应用提供参考和依据。 相似文献
11.
《中国动物传染病学报》2016,(3)
采用PCR方法扩增犬瘟热病毒N基因,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建犬瘟热N基因原核表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达重组N蛋白。从包涵体中纯化重组蛋白,制备多克隆抗体,采用Western blot检测其特异性。结果显示PCR扩增得到犬瘟热N基因,重组N蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到表达,制备的多克隆抗体能与N蛋白特异性反应。 相似文献
12.
《中国动物传染病学报》2015,(2)
本研究利用人重组干扰素IFNα-2A刺激牛肾细胞(Mardin-Darby bovine kidney cells,MDBK),并提取细胞总RNA。RT-PCR扩增牛源干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15,ISG 15),将其克隆入p Cold-TF表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达后,获得约70 k Da可溶性ISG15重组蛋白。用试剂盒对重组蛋白ISG15进行纯化回收,经BCA法测定其蛋白浓度为1 mg/m L。用纯化的ISG15重组蛋白免疫ICR小鼠,制备多克隆抗体血清,用间接ELISA方法测定多抗血清效价为1:102 400。利用Western blot进一步鉴定ISG15多抗血清,结果发现其与纯化的ISG15重组蛋白能发生特异性反应,可用于后续研究。 相似文献
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14.
为构建从江香猪源干扰素γ(IFNγ)植物表达载体,通过农杆菌真空渗透法在新鲜生菜中实现瞬时表达。参考GenBank登录的猪IFNγ基因序列设计1对特异性IFNγ引物,采用RT-PCR方法从贵州从江香猪源肝脏组织扩增IFNγ基因序列,将其克隆至植物表达载体PBI121,转化根癌农杆菌LBA4404,筛选阳性菌株提取质粒,对重组质粒进行PCR扩增、双酶切及测序鉴定;携带重组质粒根癌农杆菌真空渗透法感染生菜,GUS染色检测感染的生菜叶片,ELISA检测感染生菜叶片中从江香猪源IFNγ蛋白,分析重组质粒在生菜中表达效果;采用细胞病变抑制实验检测生菜中从江香猪源IFNγ蛋白抗病毒活性。结果表明:本研究成功地从贵州从江香猪源肝脏组织扩增获得IFNγ基因序列并构建了从江香猪源IFNγ植物表达载体PBI121-IFNγ;GUS染色感染的生菜叶片可见蓝色物质;ELISA检测感染生菜叶片中从江香猪源IFNγ蛋白含量为169.397、170.657、170.37 pg/mL;生菜中表达从江香猪源IFNγ经4^-6稀释在Marc145细胞上仍能够抑制100 TCID50的PRRSV的致细胞病变作用。本实验成功构建从江香猪源IFNγ植物表达载体PBI121-IFNγ,生菜中瞬时表达蛋白具有免疫反应性和抗病毒活性,为从江香猪源IFNγ药用植物蛋白的研究开发提供参考依据。 相似文献
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鸡γ-干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达及多克隆抗体的制备 总被引：5，自引：0，他引：5
将克隆得到的鸡 IFN- γ基因亚克隆到大肠杆菌原核表达载体 p PROEXTMHT的 Pst 和 Kpn 位点上 ,构建了重组表达质粒 p PROEXTMHT- IFN -γ,经序列分析鉴定 ,确证目的基因克隆入载体的预期位点。将重组质粒转化大肠杆菌 DH5 α,于 37℃不同时间诱导培养 ,SDS- PAGE电泳表明 ,该基因在大肠杆菌中发生高水平表达 ,表达的鸡 IFN- γ融合蛋白相对分子质量约为 2 2 0 0 0。重组蛋白占菌体总蛋白的 33%。经 Western blot鉴定 ,该重组蛋白质具有生物学活性。包涵体被 6 mol/ L 盐酸胍裂解后 ,通过镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡 IFN- γ融合蛋白及其纯化产物经 3次肌肉注射于新西兰白兔 ,制备了兔抗鸡 IFN- γ多克隆抗体。琼脂扩散结果表明 ,多克隆抗体可与纯化的鸡IFN -γ重组蛋白发生特异性反应 相似文献
16.
《中国兽医学报》2016,(12):2049-2053
采用基因工程技术克隆出梅花鹿α干扰素(IFN-α)成熟肽基因序列,并将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.0(+),经酶切、PCR及测序鉴定,成功构建了pcDNA3.0-IFN-α真核重组表达质粒。将鉴定正确的阳性重组质粒经非脂质体法转染至MDBK细胞,间接免疫荧光试验检测其具有较高转染效率;Western blot法检测IFN-α蛋白在MDBK细胞中得到有效表达;病变抑制试验检测转染后的MDBK细胞具有明显抗BVDV活性;抗BVDV活性的定量试验表明转染pcDNA3.0-IFN-α质粒的MDBK细胞与感染未转染的MDBK细胞相比抗BVDV活力提高了66192倍。本试验在MDBK细胞中成功表达了梅花鹿IFN-α,并检测出其具有明显抗BVDV作用,这为梅花鹿IFN-α活性机理研究以及开发更高效的抗梅花鹿病毒性疾病干扰素制剂提供物质和理论基础。 相似文献
17.
提取经植物血凝素诱导培养的我国健康奶牛外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出奶牛α-干扰素(BoIFN-α)成熟蛋白基因并将其克隆到pMD18-T载体上,测序结果表明,扩增片段为牛α-干扰素成熟蛋白序列,与GenBank上发表的干扰素序列同源性为100%。将其重组到原核表达载体pET32a(+)上,并在大肠杆菌BL21中实现了高效表达,表达产物以His-Tag融合蛋白的形式存在。用镍亲和层析法对蛋白进行纯化,并利用VSV-MDBK/IBRV细胞系统分析其生物活性。重组奶牛α-干扰素对VSV的抗病毒活性为4.26×105U/mL,对IBRV的抗病毒活性为8.91×104U/mL。结果表明,重组奶牛α-干扰素特异性好,而且抗病毒活性比较稳定。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2016,(10)
根据GenBank中公布的犬α-干扰素(CaIFN-α)基因核酸序列,去掉信号肽后设计并合成1对引物,引入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点。以提取的犬肝脏DNA为模板,利用PCR技术扩增CaIFN-α基因,并分别克隆至表达载体pBV220、pET-32a(His标签)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)原核表达系统。重组融合蛋白经SDS-PAGE及Western blotting鉴定。纯化目的蛋白,并采用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测其抗病毒活性。试验结果表明,与pBV220载体连接的目的基因表达的蛋白活性较低,而与pET-32a(His标签)连接的目的基因表达的蛋白活性较高,达2.56×106 U/mL。通过分析不同载体对IFN-α的表达情况,为生产高活性的IFN奠定基础。 相似文献
19.
本研究将人工合成的犬干扰素α2成熟区序列插入原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组表达质粒p ET-28a-Ca IFN-α2;然后将该质粒转化至大肠杆菌Rosetta感受态中进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定,分子量约为23 k Da的目的蛋白表达,表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,表达量约占菌体总蛋白的52.5%。包涵体蛋白经变性、复性和纯化处理后,获得的重组Ca IFN-α2纯度为92%;用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测重组蛋白的抗病毒活性为3.16×106/m L。本研究结果为进一步研制新型犬用干扰素制品奠定了物质基础。 相似文献
20.
《畜牧与兽医》2016,(9):11-15
为了制备高质量高效价抗牛γ干扰素(Bo IFN-γ)的单克隆抗体,本研究将Bo IFN-γ基因克隆到His标签的大肠杆菌表达载体p ET32a+中,诱导表达并纯化蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体。结果筛选到9株单抗,分别命名为Bo IFN-γ-1E10、Bo IFN-γ-3C2、Bo IFN-γ-3E1、Bo IFN-γ-6C6、Bo IFN-γ-6H9、Bo IFN-γ-6B6、Bo IFN-γ-6E5、Bo IFN-γ-2A10和Bo IFN-γ-2G10。ELISA、Western blot和间接免疫荧光试验结果显示,制备的单克隆抗体与原核、真核表达的Bo IFN-γ都具有良好的反应性。本研究制备获得的针对牛γ干扰素的单克隆抗体为建立检测天然Bo IFN-γ的方法提供了重要的生物材料。 相似文献