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利用RT-PCR技术从土耳其斯坦东毕吸虫（Orientobilharzia turkestanicum）成虫总RNA中扩增磷酸丙糖异构酶基因（TPI），鉴定后将目的片段与毕赤酵母表达载体pPIC9k连接，构建重组表达质粒pPIC9k-TPI，并将其电击转化到毕赤酵母GS115中，重组菌株经甲醇诱导后表达的TPI蛋白，经SDS-PAGE、Western-blotting检测，并利用葡聚糖凝胶层析柱纯化。结果显示，成功地克隆了土耳其斯坦东毕吸虫TPI；重组毕赤酵母表达了分子质量为43ku的TPI蛋白；葡聚糖凝胶层析过滤得到单一的TPI蛋白。 相似文献
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为制备MHCⅠ基因工程疫苗的基础材料,构建了鸡MHCⅠ分子重组质粒并进行原核表达,进而制备鸡MHCⅠ分子的多克隆抗体。应用PCR方法,克隆鸡MHCⅠα和β2m基因,构建重组载体pETMHCⅠα和pET-MHCⅠβ2m,经PCR、双酶切和测序鉴定后,将重组质粒在大肠埃希菌Rosetta中进行诱导表达,融合蛋白纯化后,接种昆明小鼠制备多克隆抗体,血清稀释后用免疫印迹法(Western blot)分析。结果表明,鸡MHCⅠα和β2m基因在大肠埃希菌中成功表达,融合蛋白分子质量分别约为52.1ku和33.0ku;制备的鼠抗鸡MHCⅠα和β2m链多克隆抗体,经Western blot检测证实抗体特异性较强,可进一步用于鸡MHCⅠ分子的研究。 相似文献
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本研究旨在评估巴氏杆菌糖酵解酶全部9个成员作为抗原对巴氏杆菌的免疫保护效应。通过PCR扩增出多杀性巴氏杆菌C51-17株糖酵解酶的基因并将其连接到pET-28a （+）质粒上。重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）工程菌后进行过夜诱导表达，收集菌体，超声破碎后取上清，纯化出巴氏杆菌糖酵解酶的重组蛋白。将巴氏杆菌糖酵解酶进行SDS-PAGE后转入PVDF膜上，孵育C51-17株感染康复血清，孵育二抗后进行ECL显色。将糖酵解酶免疫C57BL/6小鼠，待免疫组均产生高水平特异性抗体后使用C51-17株攻毒，比较各组存活率。测序结果显示，本研究成功将巴氏杆菌糖酵解酶全部9个成员的基因克隆到pET-28a （+）质粒上，经诱导表达和纯化成功获得了巴氏杆菌糖酵解酶的重组蛋白。Western blotting结果显示，磷酸葡萄糖异构酶（PGI）、丙糖磷酸异构酶（TPI）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GPD）、磷酸甘油激酶（PGK）、丙酮酸激酶（PYK）能与巴氏杆菌C51-17株感染康复血清反应。免疫保护力试验显示，PGI、醛缩酶（ALD）、GPD、PGK、磷酸甘油酸变位酶（PGM）、烯醇化酶（ENO）具有一定的免疫保护作用。本研究结果表明，巴氏杆菌糖酵解酶部分成员具有一定程度的免疫保护作用，为巴氏杆菌病防控研究提供了新的依据。 相似文献
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为筛选出特异的肝片吸虫诊断候选抗原,拓展诊断靶标,利用肝片吸虫阳性血清筛选肝片吸虫cDNA表达文库,获得肝片吸虫特异性抗原基因,采用RT-PCR技术扩增目的基因,连接表达载体pET-32a(+),构建重组质粒,转化入感受态细胞BL21(DE3)中,利用IPTG对重组蛋白进行诱导表达,通过SDS-PAGE及Western blot技术对蛋白表达情况进行鉴定。结果显示:经筛选获得了17个肝片吸虫免疫显性抗原基因,其中假定蛋白Fh010935为肝片吸虫特异性抗原基因;扩增得到的Fh010935核苷酸序列大小为144 bp,编码48个氨基酸,A+T含量为55.56%;Fh010935蛋白由1个α-螺旋,2个β-折叠和3个β-转角构成,具有3个抗原表位,推测该蛋白可能具有较好的抗原性;重组蛋白主要以包涵体形式表达,分子量大小约24 ku,可以被肝片吸虫感染阳性血清特异性识别,具有较好的反应原性。提示:假定蛋白Fh010935可作为肝片吸虫病诊断候选抗原,为疾病诊断制剂的开发提供前期基础。 相似文献
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亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒双拷贝VP1基因的串联表达及其免疫原性 总被引：1，自引：0，他引：1
口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因含有T细胞和B细胞表位,是口蹄疫病毒的主要免疫原性基因。作者将亚洲Ⅰ型FMDV VP1基因首尾串联构建双拷贝的VP1基因（2VP1）,实现双拷贝VP1基因的原核表达,表达的重组蛋白（GST2VP1）经Sephadex-G200分子筛层析纯化后,Western blot证实其有反应原性,动物试验表明重组蛋白在加强免疫后能够产生和灭活疫苗相当的ELISA抗体和中和抗体;本试验结果为亚洲Ⅰ型FMDV免疫原性研究及GST2VP1蛋白的进一步应用奠定了基础。 相似文献
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为筛选出特异的肝片吸虫诊断候选抗原,拓展诊断靶标,利用肝片吸虫阳性血清筛选肝片吸虫cDNA表达文库,获得肝片吸虫特异性抗原基因,采用RT-PCR技术扩增目的基因,连接表达载体pET-32a(+),构建重组质粒,转化入感受态细胞BL21(DE3)中,利用IPTG对重组蛋白进行诱导表达,通过SDS-PAGE及Western blot技术对蛋白表达情况进行鉴定。结果显示:经筛选获得了17个肝片吸虫免疫显性抗原基因,其中假定蛋白Fh010935为肝片吸虫特异性抗原基因;扩增得到的Fh010935核苷酸序列大小为144 bp,编码48个氨基酸,A+T含量为55.56%;Fh010935蛋白由1个α-螺旋,2个β-折叠和3个β-转角构成,具有3个抗原表位,推测该蛋白可能具有较好的抗原性;重组蛋白主要以包涵体形式表达,分子量大小约24 ku,可以被肝片吸虫感染阳性血清特异性识别,具有较好的反应原性。提示:假定蛋白Fh010935可作为肝片吸虫病诊断候选抗原,为疾病诊断制剂的开发提供前期基础。 相似文献
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为进一步研究MHCⅠ类分子作用机制,以及为制备MHCⅠ基因工程疫苗奠定基础,克隆鸡MHCⅠ基因,并构建MHCⅠβ2m-α融合基因进行原核表达。运用RT-PCR方法,克隆鸡MHCⅠα和β2m链基因,并通过编码连接肽（Gly4Ser）4的基因序列将两者头尾相连,构建了pET-32a-MHCⅠβ2m-α重组质粒,经PCR扩增、双酶切和测序鉴定后,重组质粒在E.coli BL21细胞进行IPTG诱导表达融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting方法分别检测表达产物。结果表明,成功克隆了MHCⅠα和β2m链基因,长度分别为1014和300 bp;构建的融合基因MHCⅠβ2m-α长度为1194 bp,经原核表达,融合蛋白分子质量约为62.0 ku,能与相应的抗体结合,具有一定的免疫学活性。 相似文献
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《畜牧与兽医》2017,(11):87-91
为了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)非结构蛋白7(Nsp7)的结构特征和免疫原性,本研究通过生物信息学分析Nsp7蛋白序列特征及空间结构,在此基础上对Nsp7进行原核表达和纯化,并制备抗Nsp7多克隆抗体。结果显示,Nsp7基因在PEDV不同毒株间高度保守,Nsp7蛋白的三级结构主要由4个α螺旋片组成。SDS-PAGE试验表明,Nsp7在大肠杆菌中获得大量表达,重组蛋白大小为9.2 ku,经纯化后得到单一条带。采用纯化的Nsp7免疫兔制备多克隆抗体,然后经Western blot和间接免疫荧光试验鉴定,多克隆抗体能够特异性识别重组Nsp7蛋白和PEDV感染细胞的Nsp7蛋白,证明Nsp7免疫原性良好,为后续研究Nsp7的功能及研制以Nsp7为检测靶标的PEDV诊断试剂盒奠定基础。 相似文献
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为了探究绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)贵州临床分离株GZ1 p109基因生物信息及重组蛋白p109的免疫原性,试验采用PCR扩增Mo p109部分基因并克隆至T克隆载体pMD-19T中,经DNA测序后进行生物信息学分析;将双酶切后的p109基因片段与原核表达载体pColdⅠ连接,然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,用IPTG诱导重组蛋白表达,然后进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。结果表明：扩增得到的Mo贵州临床分离株GZ1 p109部分基因片段大小为576 bp,编码蛋白的分子量为21.33 ku,由192个氨基酸组成;p109蛋白的二级结构主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,第1～17,24～35,52～63,72～122,138～148,150～153,161～173,182～192位的氨基酸区段抗原指数相对较高;Mo贵州临床分离株GZ1与Mo 274株(登录号为CP079199)的亲缘关系很近;试验成功构建了pColdⅠ-p109原核表达重组质粒,表达的目的蛋白大小为27 ku,该重组蛋白p109能够... 相似文献
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《中国畜牧兽医》2018,(12)
为建立检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFVp30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFVp30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀释度为1∶4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1∶1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。 相似文献
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本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus,FIPV)N蛋白,并制备抗该蛋白的多克隆抗体,用于FIPV临床抗原/抗体诊断及N蛋白功能研究。参考GenBank中FIPV的N基因序列,选择FIPV毒株N基因(登录号:KC461235.1),并对该N基因进行密码子优化、基因合成,酶切后将N基因连接至pFastBac1载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经氨苄西林抗性筛选阳性克隆,提取质粒经酶切及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后,最终成功构建重组杆状病毒质粒Bacmid-N,转染Sf9细胞包装杆状病毒,于28℃温箱培养4 d后收集感染Sf9细胞上清,并通过镍离子亲和层析纯化获得重组N蛋白。经SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明,本研究成功利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达出大小约为51 ku的FIPV重组N蛋白。将该蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合后,免疫6周龄BALB/c小鼠。用间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价可达1∶102400;利用Western blotting和间接免疫荧光试验对N蛋白多克隆抗体进行检测分析,结果表明,真核表达的重组蛋白免疫原性良好,多克隆抗体具有良好的反应原性,可特异识别FIPV感染细胞。本研究为FIPV抗原/抗体诊断试剂盒的研发奠定了基础。 相似文献
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本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达猫传染性腹膜炎病毒（Feline infectious peritonitis virus,FIPV）N蛋白,并制备抗该蛋白的多克隆抗体,用于FIPV临床抗原/抗体诊断及N蛋白功能研究。参考GenBank中FIPV的N基因序列,选择FIPV毒株N基因（登录号：KC461235.1）,并对该N基因进行密码子优化、基因合成,酶切后将N基因连接至pFastBac1载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经氨苄西林抗性筛选阳性克隆,提取质粒经酶切及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后,最终成功构建重组杆状病毒质粒Bacmid-N,转染Sf9细胞包装杆状病毒,于28 ℃温箱培养4 d后收集感染Sf9细胞上清,并通过镍离子亲和层析纯化获得重组N蛋白。经SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明,本研究成功利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达出大小约为51 ku的FIPV重组N蛋白。将该蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合后,免疫6周龄BALB/c小鼠。用间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价可达1：102 400;利用Western blotting和间接免疫荧光试验对N蛋白多克隆抗体进行检测分析,结果表明,真核表达的重组蛋白免疫原性良好,多克隆抗体具有良好的反应原性,可特异识别FIPV感染细胞。本研究为FIPV抗原/抗体诊断试剂盒的研发奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2017,(11):2131-2136
为研究维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)的免疫原性,本试验对A.veronii的OmpAⅠ基因进行克隆,构建了原核表达质粒pET-30a(+)-OmpAⅠ,并转入大肠杆菌BL21(DE3),将其表达后纯化重组蛋白,利用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。将灭活苗、弗氏佐剂(OmpAⅠ)、纯化蛋白及PBS缓冲液分别免疫鲤鱼后,检测每周各试验组鱼体血清非特异性免疫指标(酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶活力)及特异性IgM抗体水平变化情况,并于加强免疫2周后对鲤鱼进行攻毒保护性试验。结果显示:重组蛋白免疫鲤鱼后能产生明显的免疫反应,保护率在77%以上;受免鲤鱼血清中IgM抗体水平、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶及超氧化物歧化酶活力活力较对照组有显著提高。结果表明,重组蛋白OmpAⅠ具有较好的免疫原性和保护作用,为进一步研究外膜蛋白基因工程疫苗的开发奠定基础。 相似文献
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【目的】克隆大片形吸虫丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A(Ser/Thr protein phosphatases 2A,PP2A)基因并构建原核表达载体,获得原核表达蛋白,为探究PP2A基因功能及其在大片形吸虫的发育中的作用奠定基础。【方法】提取大片形吸虫成虫虫体组织总RNA,应用RT-PCR方法扩增PP2A基因的完整编码区序列,并以双酶切的方式连接pET-28a(+)载体;经酶切、测序鉴定后获得阳性质粒pET-28a-PP2A,将pET-28a-PP2A重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,并对重组蛋白的诱导条件进行优化;通过SDS-PAGE及Western blotting检测大片形吸虫PP2A基因的表达效果;应用实时荧光定量PCR检测PP2A基因在大片形吸虫虫卵、囊蚴、6周龄童虫和成虫阶段中的表达情况。【结果】克隆的大片形吸虫PP2A基因编码区序列长1 161 bp,编码386个氨基酸,分子式为C1980H3105N535O566S24,分子质... 相似文献
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为了比较鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus, DTMUV)E蛋白结构域Ⅰ-Ⅱ(EDⅠ-Ⅱ)与结构域Ⅲ(EDⅢ)的反应原性和免疫原性,试验将重组质粒pET-EDⅠ-Ⅱ[EDⅠ-Ⅱ基因插入表达载体pET-30a(+)构建的重组质粒]和pET-EDⅢ[EDⅢ基因插入表达载体pET-30a(+)构建的重组质粒]分别转化至大肠杆菌(E.coli)Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定,采用亲和层析法纯化重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ,通过Dot-blot试验和间接ELISA试验比较二者的反应原性;将重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ免疫小鼠,通过测定免疫小鼠血清中特异性抗体、病毒中和(VN)抗体和细胞因子(IL-6、IFN-γ)水平比较两者的免疫原性;将DTMUV分离株感染重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ免疫小鼠,采用实时荧光定量PCR方法检测小鼠肺脏、肝脏和脑组织中DTMUV RNA相对表达水平,比较重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ对免疫小鼠的保护力。结果表明：含重组质粒pET-EDⅠ-Ⅱ和pET-EDⅢ诱导4 h的菌体蛋... 相似文献
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《中国预防兽医学报》2018,(12)
为评价禽网状内皮组织增生病病毒(REV) env蛋白的免疫原性,本研究将env基因克隆至毕赤酵母表达载体pAO815,构建了含有两个env表达盒(已突变env基因中BglⅡ和Bam HⅠ酶切位点)的重组表达质粒pAO815-2env,并电转至毕赤酵母宿主菌GS115,构建重组酵母菌株pAO815-2env/GS115,经发酵培养得到的env蛋白(蛋白含量达到4.8 g/L)经亲和层析纯化后免疫SPF鸡,利用ELISA试剂盒和中和试验检测血清中的REV抗体。结果显示,重组酵母菌株表达的env蛋白,不仅能够诱导SPF鸡产生抗REV抗体,还能诱导其产生中和抗体,且产生的中和抗体效价较高,具有良好的免疫原性。本研究为开展禽网状内皮组织增生病亚单位疫苗的研制提供了实验依据。 相似文献
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构建大片吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶(Fg.TPx)原核表达质粒,经大肠埃希菌Rosetta表达融合蛋白(Fg.TPx/His)并对其进行纯化和初步鉴定。PCR扩增Fg.TPx的基因片段,亚克隆至pET32a(+)中构建重组表达载体pPET32a-Fg.TPx。IPTG诱导表达,经镍离子亲和层析分离纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。重组质粒经限制性内切酶双酶切和测序分析表明构建成功,表达产物以可溶性和包涵体形式存在,纯度为90%,Wsetern blot证实该蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合反应,分子质量为TPx和His分子质量之和,表明是融合蛋白。重组蛋白可以被大片吸虫感染水牛阳性血清特异性识别。免疫家兔产生的抗体效价最高可达1∶4 000。成功构建了p ET32a-Fg.TPx原核表达质粒,重组蛋白得到高浓度表达,具有抗原性,为进一步研究其在大片吸虫病诊断中的应用奠定了基础。 相似文献
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为了建立早期羊肝片吸虫病的血清学快速检测方法，本试验成功克隆并表达肝片吸虫GAPDH重组蛋白，Western blot结果显示，该重组蛋白具有良好的抗原活性。用肝片吸虫GAPDH重组抗原包被，建立肝片吸虫病血清抗体的间接ELISA方法；随后优化反应的最佳血清稀释度和抗原包被量，同时筛选其他反应条件。结果显示，间接ELISA方法批内和批间重复试验的最大变异系数均小于10%,GAPDH重组抗原与华枝睾吸虫、日本血吸虫和捻转血矛线虫阳性血清均无交叉反应。对来自黑龙江省各地区的96份羊血清进行检测，阳性率为16.67%(16/96)。结果表明本试验建立的方法具有良好的敏感性和特异性，能够为早期诊断羊肝片吸虫病提供参考。 相似文献
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用PCR从含产气荚膜松菌β毒素基因的质粒pXETB2中扩增出β毒素基因，NcoⅠ和BamHⅠ双酶切该β毒素基因，回收0.93kb的β毒素基因片段，再用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切含产气荚膜梭菌α毒素基因质粒pXETA1,与上述回收的β毒素基因片段连接，转化至受体菌BL21（DE3）中，经NcoⅠ，NotⅠ酶切反应鉴定和苷酸序列分析证实，获得的重组质粒pXCPAB1含有α－β融合基因，重组菌株BL21（CD3）（pXCPAB1)表达产物经ELISA检测和SDS－PAGE分析，表明重组菌株可以表达α－β融合蛋白。 相似文献