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1.
为方便HAL1转基因大豆的研究和检测,以转HAL1基因大豆T3代基因组DNA为模板,使用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法分离其外源基因插入位点的侧翼序列,获得了插入片段DNA序列(T-DNA)的左翼序列和右翼序列。通过比对大豆基因组序列确定其整合位点,确定了HAL1基因的T-DNA在大豆基因组1号染色体非编码区49468395位点以单拷贝插入,转基因事件不影响大豆基因组功能基因的正常表达,而且在200 mmol·L~(-1)NaCl盐胁迫下转基因植株生长力明显强于对照材料。蛋白定量检测结果表明,在叶片中蛋白含量最高可达0.03 mg·g~(-1),在根茎花中也有表达,但是含量较低。根据整合位点处的左右侧翼序列设计两对特异性PCR检测引物,PCR检测结果显示只有转HAL1基因大豆阳性材料才能扩增出926和816 bp DNA片段。本研究建立的转HAL1基因大豆特异性定性检测方法,对转基因大豆的研究具有重要的意义,也为大豆转基因受体材料的管理与检测提供参考。 相似文献
2.
采用TAIL-PCR方法研究转基因大豆外源基因LEC1插入位点序列特征,并根据此特征建立了LEC1转化事件特异性检测方法。依据正义表达载体上T-DNA区段侧翼序列设计特异性引物和简并引物,获得4个同源序列。对获得的序列进行Blastn分析发现,p69、p148、p225均为载体T-DNA区段一部分,未见大豆基因组序列;P217插入片段的序列分析表明,该序列长863 bp,其中T-DNA左边界序列长143 bp,720 bp为大豆基因组片段,与大豆光系统II类囊体膜蛋白(Thylakoid membrane proteins)的206-926区段同源性为99%,这表明,外源DNA插入了大豆基因组中类囊体膜蛋白编码区的206位。根据分离的序列建立事件特异性定性检测方法,扩增片段大小为277 bp。该事件特异性检测方法具有高度的特异性和良好的灵敏性,为转基因大豆品种LEC1的身份识别提供了有效的方法。 相似文献
3.
东方百合T-DNA插入突变株侧翼序列的分离及分析 总被引：1，自引：0，他引：1
采用反向PCR技术对东方百合(Oriental hybrid lily)T-DNA插入突变株的侧翼序列进行扩增并进行序列分析。结果表明:6个突变表型的植株都有T-DNA插入。扩增到的10个序列长度大都在500～900 bp左右。回收其中的8条亮带,克隆测序后,经NCBI BLASTx比对发现,除了B2序列因为太短没有显著的同源性以外,有1个是未知功能的蛋白。B1是Lys家族转录调节因子;CM1是C类细胞色素生成蛋白;CM2是糖转运跨膜蛋白;D1是特有的解旋酶家族;F1是rRNA小亚基甲基转移酶;G1是Arac家族转录调节因子。表明这些基因可能与这些突变表型有关。 相似文献
4.
以稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B2510为材料,通过分析T-DNA插入位点的侧翼序列和突变基因,分离出在稻曲病菌致病过程中起作用的基因。通过测定突变菌株B2510的生长速率、产孢能力及致病力发现,与野生型菌株P1相比,B2510田间接种表现为致病性减弱;在MM培养基上生长速率下降,而在PSA和TB3培养基中生长速率与野生型没有显著差异,但丧失产孢能力。Southern杂交显示T-DNA在突变菌株B2510中以双拷贝形式插入,利用TAIL-PCR技术扩增紧邻T-DNA两侧的侧翼序列,经过比对分析发现,T-DNA分别插在基因UV8b_1412的启动子区域和UV8b_1386的下游3′端,且稻曲菌基因组序列均未丢失,T-DNA上只有几个碱基发生变化。半定量RT-PCR分析基因的表达情况,显示两个基因在突变体B2510的表达量较P1均显著下降,推测T-DNA插入位点处的基因与稻曲病菌致病性相关,可能在某一阶段参与调控稻曲病菌在水稻上的致病过程。 相似文献
5.
小球藻紫外线诱变及高含油藻株筛选 总被引：2，自引：0，他引：2
采用反向 PCR 技术对东方百合（Oriental hybrid lily）T-DNA 插入突变株的侧翼序列进行扩增并进行序列分析。 结果表明： 6 个突变表型的植株都有 T-DNA 插入。 扩增到的 10 个序列长度大都在 500～900 bp 左右。 回收其中的 8 条亮带, 克隆测序后, 经 NCBI BLASTx 比对发现, 除了 B2 序列因为太短没有显著的同源性以外, 有 1个是未知功能的蛋白。 B1 是 Lys 家族转录调节因子; CM1 是 C 类细胞色素生成蛋白; CM2 是糖转运跨膜蛋白;D1 是特有的解旋酶家族; F1 是 rRNA 小亚基甲基转移酶; G1 是 Arac 家族转录调节因子。 表明这些基因可能与这些突变表型有关。 相似文献
6.
转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。 相似文献
7.
为明确转cry2Ab4基因抗虫棉（L280）与转cry2Ab4、vip3Aa11基因双价抗虫棉（L282）在棉花基因组中的插入位点。通过融合引物与巢式聚合酶链式反应（Fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR）的方法获取T-DNA的侧翼序列。分析表明,它们分别位于棉花D13染色体61 309 969-61 309 997 bp区间和D11染色体11 069 019-11 069 039 bp区间。同时,为了获得侧翼序列,分别在棉花基因组和T-DNA上设计特异性引物进行PCR扩增,确认2种转基因抗虫棉中T-DNA在基因组上的位置。通过FPNI-PCR方法成功地分离到了转基因抗虫棉的侧翼序列,明确了T-DNA在2种抗虫棉基因组中的插入位置,也为转基因抗虫棉的后续研究及安全评价提供了重要的技术支持。 相似文献
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为明确转cry2Ab4基因抗虫棉（L280）与转cry2Ab4、vip3Aa11基因双价抗虫棉（L282）在棉花基因组中的插入位点。通过融合引物与巢式聚合酶链式反应（Fusion primer and nested integrated PCR，FPNI-PCR）的方法获取T-DNA的侧翼序列。分析表明，它们分别位于棉花D13染色体61 309 969-61 309 997 bp区间和D11染色体11 069 019-11 069 039 bp区间。同时，为了获得侧翼序列，分别在棉花基因组和T-DNA上设计特异性引物进行PCR扩增，确认2种转基因抗虫棉中T-DNA在基因组上的位置。通过FPNI-PCR方法成功地分离到了转基因抗虫棉的侧翼序列，明确了T-DNA在2种抗虫棉基因组中的插入位置，也为转基因抗虫棉的后续研究及安全评价提供了重要的技术支持。 相似文献
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马铃薯薯形突变体T-DNA插入侧翼序列分析 总被引：1，自引：1，他引：0
以‘鄂马铃薯3号’为材料,通过试管薯快速转基因技术获得一个编号为pCL2b-2薯形突变系,本研究通过表型鉴定、侧翼序列扩增和生物信息学等方法对其进行了研究,目的是分析该突变株表型变化控制机制。结果表明,该突变体的试管薯和温室收获块茎长宽比在p<0.05水平均显著大于野生型受体薯,其中试管薯长宽比为1.78,野生型试管薯长宽比为1.33;温室收获块茎长宽比为1.50,野生型块茎为1.29;利用hiTAIL-PCR技术对T-DNA插入位点两侧的侧翼序列分析表明,T-DNA插入编码异戊烯基转移酶(IPT)基因内部,该基因为细胞分裂素合成酶基因(StIPT),暗示StIPT基因可能参与马铃薯薯形发育。 相似文献
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《中国油料作物学报》2015,(6)
利用油体蛋白融合技术,为实现oleosin-b FGF油体蛋白在转基因红花中表达奠定基础,通过农杆菌介导法将含有Ca MV35S启动子和oleosin-b FGF融合基因的T-DNA转入到红花基因组中,对潮霉素抗性红花植株的基因组进行PCR检测,提取抗性植株叶片总蛋白进行SDS-PAGE分析和Western blotting检测。PCR检测结果表明,目的基因已经转入到红花基因组,蛋白检测结果证明oleosin-b FGF融合蛋白在转基因红花叶片中有表达,但融合蛋白不稳定,发生降解。 相似文献
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橡胶树胶孢炭疽菌T-DNA标记基因Lv1初步分析 总被引：1，自引：0，他引：1
通过对实验室已构建的胶孢炭疽菌T-DNA突变体库中各突变体致病力的测定,获得致病力丧失突变菌株T-900,利用TAIL-PCR克隆标记基因侧翼序列,进行比对和序列分析,获取假设基因Lv1的全序列,采用生物信息学方法进行Lv1基因预测及功能分析,最后通过敲除野生型菌株RC178中的基因Lv1进行功能分析。结果表明,获取的假定基因Lv1全序列共4 450 bp,基因预测显示T-DNA侧翼序列位于预测基因的1 727 bp处,正好处于预测基因的第1个外显子内;并且推测该基因为组蛋白H3基因,含有2个内含子,3个外显子;功能验证结果发现敲除突变体△T-900-16与T-900致病力表现一致,推测Lv1基因与RC178的致病力相关。 相似文献
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水稻小粒矮突变性状与T-DNA插入标签的共分离检测 总被引：2，自引：0，他引：2
从T-DNA水稻标签系中发现1个标签系中出现了小粒矮(sgd)突变性状的分离。为克隆该突变基因和进行基因功能研究,对该突变体进行了遗传分析。该标签系存在多个插入事件,且T3代发现目标突变性状分离系中,另一个非目标插入事件已经纯合,故特异PCR检测不能确认小粒矮突变性状与T-NA插入共分离。但通过TAIL-CR方法,获得了插入点侧翼的水稻基因组序列,并证实该侧翼序列与小粒矮突变性状共分离。 相似文献
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为了验证大豆子房滴注转化方法的可重复性与遗传稳定性,将由报告基因GUS、表达调控序列(35S肩动子,NOS终止子)和T-DNA边界序列3部分组成的基因表达框转入大豆.对T0代转化材料进行GUS组织化学染色分析和PCR检测.结果表明:在检测的340个幼胚中有12个呈GUS阳性,且在180个转化植株中有6个呈PCR阳性同时其叶片也呈GUS阳性,转化率分别为3.53%和3.33%.Smthern杂交表明外源GUS基因表达框以低拷贝的形式整合到大豆基因组中对转基因后代叶片GUS染色、PCR分析及Northern blot检测结果表明外源基因已遗传给了后代,其中S2株系符合盂德尔分离规律. 相似文献
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利用REF启动子构建橡胶树乳管特异表达载体及GUS基因的瞬时表达 总被引：1，自引：1，他引：0
采用SDS法提取橡胶树基因组DNA,用2套引物进行PCR扩增,得到2条REF条带,它们与NCBI报道的REF序列间的同源性分别是98.9%,98.4%.用克隆得到的REF片段分别替换载体质粒pBI121中的CaMv35S启动子,得到利用橡胶内源性启动子构建的橡胶树REF启动子瞬时表达载体（pBIR1和pBIR2）.用基因枪法转化橡胶树组培苗叶片后,Gus组织化学检测显示叶脉为Gus染色阳性.研究中发现,长度为306bp的REF启动子片段可以实现REF启动子的全部功能.从而成功地构建了橡胶树乳管瞬时表达载体,为外源基因的橡胶树乳管特异表达载体的构建打下了基础. 相似文献