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试验旨在筛选水牛HSD17B1基因启动子活性区域及影响因素，并预测其转录结合因子，为探究该基因在水牛繁殖性能中的调控机理提供理论依据。以水牛血液基因组DNA为模板，PCR扩增得到3个HSD17B1基因启动子活性区域序列，并定向克隆至pGL3-promoter载体；将重组质粒转染到水牛卵泡颗粒细胞，通过双荧光素酶检测系统测定相对荧光素酶活性，并探究其与促黄体素（luteinizing hormone，LH）和促卵泡素（follicle stimulating hormone，FSH）的关系；利用生物信息学方法对HSD17B1基因启动子区进行转录结合因子预测。结果显示，本试验成功克隆了3个不同长度的HSD17B1基因启动子片段，并成功构建了双荧光素酶报告载体。经不同长度启动子片段的活性检测发现，pGL-pro-HSD17B1-1500活性最强，证实－866/－1 500 bp为HSD17B1基因核心启动子区域，表明该区域对HSD17B1基因转录调控有重要作用。荧光素酶活性检测结果显示，添加LH可增强HSD17B1基因启动子活性。生物信息学分析发现，HSD17B1基因启动子区存在6个转录因子结合位点：Sp1（－2 327/－2 317 bp）、HOXA4（－2 162/－2 146 bp）、Sp1（－1 409/－1 395 bp）、Sp1（－1 391/－1 380 bp）、Sp1（－1 345/－1 319 bp）和GATA1（－812/－801 bp），但无CpG岛，有1个TATA-box和2个CAAT-box。本研究成功构建了HSD17B1基因启动子荧光素酶报告载体，确定了HSD17B1基因启动子核心区域，并证明LH可增强启动子活性。 相似文献
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通过将小干扰-17β-羟基固醇脱氢酶Ⅳ（si-HSD17B4）基因转染水牛乳腺上皮细胞,检测酪蛋白、甘油三酯含量及脂肪酸相关基因的表达变化,从而揭示干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞中乳脂和酪蛋白的影响。采用实时荧光定量PCR检测HSD17B4 mRNA在水牛各个组织中的相对表达量。合成3条水牛HSD17B4小干扰RNA （siRNA）和1条对照si-HSD17B4-nc （si-nc）,并筛选干扰效果最佳的片段和时间。si-HSD17B4转染水牛乳腺上皮细胞后,通过酪蛋白试剂盒检测酪蛋白的表达情况,通过甘油三酯测定和油红O染色检测甘油三酯含量,通过实时荧光定量PCR检测干扰HSD17B4基因对甘油三酯、脂肪酸合成以及氧化相关基因表达的影响。结果表明,HSD17B4基因在水牛心脏和卵巢中相对高表达,且显著高于其他组织（P<0.05）。3条HSD17B4 siRNA片段均能有效地抑制HSD17B4基因的表达,其中si-HSD17B4-1干扰效果最佳,HSD17B4 mRNA表达量极显著低于对照组（P<0.01）;最佳干扰时间为24 h。酪蛋白检测结果显示,干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞中酪蛋白合成无影响。甘油三酯测定结果显示,干扰HSD17B4基因后细胞中甘油三酯含量上升,差异显著（P<0.05）。油红O染色结果显示,干扰HSD17B4基因后细胞中的脂滴明显增多。实时荧光定量PCR检测结果显示,干扰HSD17B4基因会使FABP3、ACSL1、DGAT1、DGAT2、PLIN2、BTN1A1基因表达量上调,分别上调9.28（P<0.01）、1.36（P<0.05）、1.17（P<0.05）、1.83（P<0.01）、1.60（P<0.01）和2.17（P<0.01）倍;同时使PPARA、SREBP1C、SCD、ACSS2、ACACA、AGPAT6、LPIN1、XDH、ABCD1、ACOX2、EHHADH、SCP2基因表达量下降,分别下调至50.55%（P>0.05）、61.15%（P<0.01）、84.91%（P<0.01）、89.34%（P<0.01）、21.88%（P<0.01）、86.48%（P<0.01）、25.35%（P<0.01）、27.24%（P<0.01）、41.74%（P<0.01）、22.17%（P<0.01）、62.70%（P<0.01）和70.33%（P<0.01）。结果表明,HSD17B4基因在水牛组织中广泛表达;si-HSD17B4高效抑制HSD17B4基因在水牛乳腺上皮细胞中的表达,未检测到干扰HSD17B4基因对乳腺上皮细胞酪蛋白的影响,干扰HSD17B4基因上调了FABP3、ACSL1、DGAT1、DGAT2基因的表达,从而促进甘油三酯的合成,同时降低ABCD1、ACOX2、EHHADH、SCP2基因的表达,减少脂肪酸β-氧化。 相似文献
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本研究旨在对广西沼泽型水牛MYF5基因进行克隆和分析,并构建其真核表达载体。应用RT-PCR方法从水牛肌肉组织中扩增MYF5基因,测序鉴定后对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,同时构建该基因真核表达载体,并在细胞水平验证所构建载体的正确性。结果表明:水牛MYF5基因编码区序列长度为768 bp,编码255个氨基酸,其核苷酸序列与牛、山羊、猪、人、猩猩和狼相应序列的相似性分别为99%、98%、94%、91%、90%和89%;水牛MYF5基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性;MYF5蛋白为膜外蛋白,具有MYOD家族标志性MYOD结构域;构建水牛MYF5基因真核表达载体pMXs-MYF5,转染HEK293T、水牛颗粒细胞后产生绿色荧光信号,表明细胞表达MYF5基因。 相似文献
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17β-雌二醇脱氢酶Ⅳ(17β-Hydroxysteroid dehydrogenaseⅣ,HSD17B4)是一种在类固醇代谢过程中发挥重要作用的酶蛋白。为了阐明HSD17B4基因对水牛繁殖性能的影响,试验以奶牛HSD17B4基因序列(登录号:NM_001007809.2)为探针设计引物,利用PT-PCR克隆水牛HSD17B4基因,并对基因的核苷酸序列和蛋白质序列特征进行生物信息学分析。结果显示,水牛HSD17B4基因mRNA序列全长2 680 bp,其中5'端长145 bp,3'端长324 bp,CDS序列长2 211 bp,编码736个氨基酸。同源序列分析显示,水牛HSD17B4基因编码序列与其他物种具有较高的同源性,证明成功克隆水牛HSD17B4,为进一步阐明该基因在水牛上的作用机制奠定基础。 相似文献
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为了阐明Smad4基因在水牛卵巢颗粒细胞增殖及胚胎发育中的分子机制,试验采用RT-PCR扩增并克隆水牛Smad4基因,对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,构建Smad4基因的真核表达载体,通过脂质体转染法转染体外培养的牛卵巢颗粒细胞。结果表明,试验克隆得到水牛Smad4基因编码序列,编码区全长为1 662 bp,编码553个氨基酸。通过BLAST对水牛Smad4基因的核苷酸序列进行同源性比对,结果显示,水牛Smad4基因与牛的同源性为99%,与绵羊、猪、马、人的同源性分别为98%、96%、96%和95%。系统进化树分析表明,Smad4基因在不同物种的进化过程中具有高度的保守性。试验成功构建了水牛Smad4基因的真核表达载体pEGFP-N1-Smad4,并在水牛卵巢颗粒细胞中表达出较强的绿色荧光蛋白Smad4-EGFP融合蛋白。本研究成功克隆了水牛Smad4基因,并成功构建了Smad4基因的真核表达载体,为进一步研究Smad4基因在水牛胚胎发育过程中的分子机制奠定基础。 相似文献
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旨在探索湖羊垂体中17β-羟类固醇脱氢酶12（HSD17B12）基因对垂体激素分泌的影响。本研究挑选体重相近（40 kg左右）且健康的性成熟湖羊公羊（9月龄）3只，采集垂体组织进行HSD17B12基因CDS区扩增及蛋白同源性分析，确定其CDS区序列。利用免疫组化分析HSD17B12在性成熟雄性湖羊垂体中的表达定位。体外分离湖羊垂体细胞，利用RNA干扰和细胞转染技术体外干扰HSD17B12，qPCR鉴定激素相关基因的表达水平，并利用流式细胞仪检测细胞增殖、凋亡、周期等的变化。结果表明，HSD17B12基因CDS区长度为939 bp，并且在物种间保守性较高。此外， HSD17B12在湖羊垂体组织大部分细胞中均呈现阳性表达。在垂体细胞干扰HSD17B12后，可以造成细胞增殖效率显著降低（P<0.05），细胞凋亡比率显著增加（P<0.05），细胞周期发生显著改变（P<0.05），且垂体促性腺激素合成相关基因FSHβ、LHβ和生长激素基因GH表达水平均显著降低（P<0.05）。结果提示，在湖羊垂体细胞中干扰HSD17B12的表达，可通过影响细胞增殖、周期和凋亡水平的变化而显著降低促性腺激素及生长激素的分泌。本研究初步证明了HSD17B12基因在湖羊垂体中的重要作用，为进一步探索其中的作用机制提供一定的基础。 相似文献
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本研究旨在克隆水牛MBD3基因,进行生物信息学分析,并构建MBD3基因的真核表达载体,为研究MBD3基因在水牛胚胎发育及诱导多能干细胞（iPSCs）中的作用奠定基础。试验从卵巢组织中提取总RNA,反转录得到cDNA,并以此为模板,应用RT-PCR克隆得到MBD3基因,测序并应用相关的生物学软件进行分析;将MBD3基因连接至真核表达载体pEGFP-C1,再将携带目的基因的重组质粒转染HEK293T细胞和水牛胎儿成纤维细胞（BFF）,利用RT-PCR及Western blotting方法分析目的基因的表达。结果表明,克隆获得了898 bp的水牛MBD3基因序列,其中编码区全长774 bp,编码257个氨基酸。通过对MBD3基因核苷酸序列的多重比对及进化树分析,MBD3基因在进化中高度保守,特别是MBD结构域,水牛与牛的同源性为100%,与人、猪、猩猩的同源性均为97%。将水牛MBD3基因真核表达载体转染HEK293T细胞和BFF,通过荧光观察、RT-PCR及Western blotting方法鉴定表明,成功构建了水牛MBD3基因的真核表达载体。本研究克隆得到了水牛的MBD3基因,并成功构建了MBD3基因的真核表达载体,为进一步研究MBD3基因在水牛胚胎发育及iPSCs诱导上的作用奠定了基础。 相似文献
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《畜牧与兽医》2015,(10):56-61
为了阐明水牛ASAH1基因在水牛卵泡发生和胚胎发生过程中的作用及分子机制,采用RT-PCR及载体构建技术对ASAH1进行了研究。结果表明:水牛ASAH1基因的编码区全长993 bp,共编码330个氨基酸。多重序列比较分析显示水牛ASAH1核苷酸序列与牛、山羊、绵羊、猪、马、人和非洲象相应序列的相似性分别为99%、97%、96%、90%、90%、89%和87%,结合系统进化树分析结果,ASAH1基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性。对ASAH1蛋白质的分析表明:该蛋白呈弱酸性,无信号肽,细胞亚定位于溶酶体,存在NAAA-beta和Ntn_AC_NAAA结构域。成功构建水牛ASAH1基因真核表达载体,转染293T和CHO细胞系后,均能够正确形成ASAH1-EGFP融合蛋白,产生绿色荧光信号。我们的结果为今后阐明ASAH1基因在水牛水牛卵泡发生和胚胎发生过程中的作用及分子机制奠定了理论基础。 相似文献
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【目的】旨在通过分析细胞色素P450家族成员11A1（CYP11A1）的生物信息功能及其在新西兰白兔卵巢颗粒细胞中对繁殖性能相关基因的调控作用，为探究其在卵泡发育过程中调控功能奠定基础。【方法】根据GenBank上兔CYP11A1基因的序列，设计特异性引物，以新西兰白兔卵巢组织cDNA为模板，PCR扩增并克隆CYP11A1基因序列，构建pcDNA3.1-CYP11A1过表达重组载体；用Mega 5.1在线软件构建系统进化树，并通过生物信息学软件对CYP11A1蛋白的氨基酸组成、理化性质、磷酸化位点、保守结构域、二级结构、三级结构、亚细胞定位、蛋白互作进行预测分析。分离新西兰白兔卵巢颗粒细胞，并通过免疫荧光法鉴定颗粒细胞特异性抗体卵泡刺激素受体（FSHR）的表达。设计3条干扰CYP11A1基因表达的引物（siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3），筛选出干扰效率最高的1条，并将其与pcDNA3.1-CYP11A1过表达重组载体转染到卵巢颗粒细胞中，用实时荧光定量PCR检测颗粒细胞中羟基类固醇17-β脱氢酶1（HSD17B1）、骨形态发生蛋白15（BMP15）和促卵泡刺激素受体（FSHR）等繁殖相关基因mRNA表达水平。【结果】成功克隆新西兰白兔CYP11A1基因，其CDS全长序列为1 557 bp，编码518个氨基酸，其中亮氨酸含量（10.6%）最高，精氨酸（7.6%）、缬氨酸（7.4%）和丙氨酸（7.2%）次之。进化树分析显示，CYP11A1蛋白序列与家鼠、人和猩猩的距离最近。生物信息学分析显示，CYP11A1蛋白理论等电点为7.4，正负电荷残基数各占50个，脂肪族氨基酸指数为82.16，不稳定性指数39.54，其中氨基酸序列中亲水性残基数量多于疏水性残基；CYP11A1蛋白具有40个潜在的磷酸化位点，其中以苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸最为丰富；CYP11A1蛋白二级结构由α-螺旋（48.31%）、无规则卷曲（40.22%）、延伸链（7.42%）和β-转角（4.04%）组成，三级结构为弯曲螺旋状。亚细胞定位预测结果显示，CYP11A1蛋白主要分布于线粒体（52.2%）、细胞质（17.4%）和细胞核（13.0%）中，还具有1个p450家族的结构域，并与多个繁殖性能相关的蛋白（STAR、CYP21A2、CYP17A1和FDX1）相互作用。分离的兔颗粒细胞表达FSHR，可以用于后续试验；CYP11A1基因在颗粒细胞中过表达后，HSD17B1和FSHR基因表达量极显著上调（P＜0.05），BMP15基因表达量显著上调（P＜0.01）；干扰CYP11A1基因表达后，BMP15和FSHR基因的表达量极显著下调（P＜0.01），HSD17B1基因表达量显著下调（P＜0.05）。【结论】CYP11A1是一个稳定、亲水、相对保守且具有抗氧化和类固醇激素合成功能的蛋白。CYP11A1基因可调控卵巢颗粒细胞中与繁殖性能相关的基因HSD17B1、BMP15、FSHR的表达，说明CYP11A1基因在母兔繁殖过程中发挥一定作用。 相似文献
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ZHU Peng PANG Chun-ying DENG Ting-xian DUAN An-qin LU Xing-rong CHEN Ming-tang YANG Bing-zhuang LIANG Xian-wei 《中国畜牧兽医》2016,43(3):559-567
In order to clarify the effect of 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenase 1 (HSD17B1) gene on the reproductive performance of buffalo,in this study,buffalo HSD17B1 gene was cloned by 3'-RACE,analyzed by bioinformatics,and studied with eukaryotic vector construction and cell transfection technology.The results showed that the coding region of buffalo HSD17B1 was 954 bp,3'-UTR was 58 bp,encoded 317 amino acids.The buffalo HSD17B1 gene shared 100%,100%,92%,94%,87%,87% and 87% of similar nucleotide sequence with that of Bos taurus,Ovis aries,Sus scrofa,Equusca ballus,Canis lupus,Loxodonta africana and Homo sapiens,respectively.Phylogenetic tree analysis showed that HSD17B1 gene was highly conserved in different species and evolution.HSD17B1 protein was weakly acidic,without signal peptide,located inthe cytoplasmic,and with the presence of type1_17beta-HSD-like_SDR_c,PRK05993,LPOR and FabG domains.The buffalo HSD17B1 eukaryotic expression vector was successfully constructed,after transfected into 293T cell lines,HSD17B1-EGFP fusion protein was detectable.In a word,the success cloning and construction of eukaryotic expression vector of buffalo HSD17B1 gene,provided an important reference for surveying the regulation mechanism of HSD17B1 gene during buffalo folliculogenesis and embryogenesis. 相似文献
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WANG Xiaodong YANG Chan LIU Qinghua LI Zhenyu WU Hao LIU Guoshi LI Xiang HE Changjiu 《中国畜牧兽医》2007,47(12):3833-3843
This study intended to construct an oocyte-specific expression vector (GDF9-ASMT) for melatonin (MLT) synthetase acetylserotonin methytransferase (ASMT),and granule (luteal) cell-specific expression vector (Cyp17-MTNR1A,MTNR1B) for MLT receptors MTNR1A and MTNR1B,the construction of the above vectors provided carrier materials for further production of transgenic sheep with high fertility.First,the goat GDF9 and Cyp17a1 promoter sequences were amplified separately.Then,the full-length CDS sequences of ASMT,MTNR1A and MTNR1B genes were amplified,and ASMT gene was connected to the downstream of GDF9 promoter by enzyme-cutting,with MTNR1A and MTNR1B respectively connected to the downstream of Cyp17a1 promoter to prepare Pro/GDF9-ASMT,Pro/Cyp17-MTNR1A and Pro/Cyp17-MTNR1B expression elements.Finally,the above-mentioned expression elements were integrated into the pcDNA3.1(+) vector by enzyme digestion,thereby constructing pcDNA3.1-Pro/GDF9-ASMT,pcDNA3.1-Pro/Cyp17-MTNR1A and pcDNA3.1-Pro/Cyp17-MTNR1B eukaryotic expression vectors.After sequencing verification,the GDF9 and Cyp17a1 promoters amplified in this study were 2 496 and 2 497 bp in length respectively,and they were 98% homologous to the 2 500 bp region upstream of the start codons of the goat GDF9 and Cyp17a1 genes in GenBank database.The amplified ASMT,MTNR1A and MTNR1B CDS sequence lengths were 1 037,1 100 and 1 130 bp,and the homology with the standard sequences submitted by GenBank were 98%,98% and 99%.The amino acid sequence homologies was 97%,98%,99% respectively.The construction of the above vectors provided references for further production of melatonin transgenic sheep with high fertility. 相似文献
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本研究旨在构建褪黑素（melatonin，MLT）合成酶乙酰血清素甲基转移酶（acetylserotonin methytransferase，ASMT）的卵母细胞特异表达载体GDF9-ASMT和MLT受体（MTNR1A与MTNR1B）的颗粒（黄体）细胞特异表达载体Cyp17-MTNR1A、MTNR1B，以期为进一步生产高繁殖力转基因山羊提供载体材料。首先，分别扩增出山羊生长分化因子9（GDF9）与细胞色素P450家族17亚家族A成员1（Cyp17a1）启动子序列备用；然后，扩增ASMT、MTNR1A及MTNR1B基因CDS全长序列，并通过酶切将ASMT连接至GDF9启动子下游，将MTNR1A和MTNR1B连接至Cyp17a1启动子下游，制备出Pro/GDF9-ASMT、Pro/Cyp17-MTNR1A与Pro/Cyp17-MTNR1B表达元件；最后通过酶切连接将上述表达元件整合至pcDNA3.1（+）载体中，从而构建出pcDNA3.1-Pro/GDF9-ASMT、pcDNA3.1-Pro/Cyp17-MTNR1A和pcDNA3.1-Pro/Cyp17-MTNR1B真核表达载体。经测序验证，本研究扩增出的GDF9和Cyp17a1启动子长度分别为2 496和2 497 bp，与GenBank数据库中山羊GDF9和Cyp17a1基因起始密码子上游2 500 bp区域的同源性均为98%；扩增出的ASMT、MTNR1A与MTNR1B的CDS序列长度分别为1 037、1 100和1 130 bp，与GenBank所递交的标准序列同源性分别为98%、98%和99%，氨基酸序列同源性分别为97%、98%和99%。上述载体的成功构建可为进一步生产褪黑素高繁殖力转基因山羊提供参考。 相似文献
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为揭示盘状结构域受体1（discoidin domain receptor1,DDR1）基因对水牛泌乳性能的影响,本研究构建了水牛DDR1基因真核表达载体,并对其最佳转染时间进行摸索,同时分析DDR1基因过表达对水牛乳腺上皮细胞的影响。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,载体片段大小与目标载体片段大小一致,均为8.8 kb,测序结果显示其与目的片段序列匹配率为100%。细胞转染试验结果显示,DDR1基因过表达最佳转染时间为48 h。细胞增殖检测结果显示,DDR1基因过表达组与对照组细胞相对荧光值差异不显著（P>0.05）。细胞凋亡检测结果显示,DDR1基因过表达对水牛乳腺上皮细胞的晚期凋亡率（19.87% VS 17.49%）无影响（P>0.05）,但极显著增加了水牛乳腺上皮细胞早期凋亡率（6.48% VS 1.35%,P<0.01）。同时,DDR1基因过表达上调了水牛乳腺上皮细胞中抑凋亡基因BCL-2和XIAP的表达,而下调了促凋亡基因P53的表达。此外,DDR1基因过表达显著提高了水牛乳腺上皮细胞的迁移率（66.26% VS 58.76%,P<0.05）。综上,试验成功构建了水牛DDR1基因真核表达载体并证明了DDR1基因过表达促进了水牛乳腺上皮细胞的早期凋亡和迁移,为今后进一步研究水牛乳腺发育和泌乳性能提供了一定理论依据。 相似文献
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YAN Sheng-fei ZHANG Xiu-fang HUANG Yue-meng ZHENG Hai-ying YANG Chun-yan QIN Guang-sheng HUANG Jia-xiang SHANG Jiang-hua 《中国畜牧兽医》2017,44(8):2369-2377
This study was aimed to elucidate the molecular mecbanisms of Smad4 gene on granulose cells proliferation and embryonic development in buffalo. The Smad4 gene was amplified by RT-PCR, analyzed by bioinformatics, studied with eukaryotic vector construction, and used liposome transfection skill to transfect into the buffalo granulose cells. The results showed that Smad4 gene was cloned, the coding region was 1 662 bp, and encoded 553 amino acids. BLAST analysis showed that the buffalo Smad4 gene shared 99% of similar nucleotide sequence with Bos taurus, and shared 98%, 96%, 96% and 95% of similar nucleotide sequence with Ovis aries, Sus scrofa, Equues caballus and Homo sapiens, respectively. Phylogenetic tree analysis showed that Smad4 gene was highly conserved in different species. The buffalo pEGFP-N1-Smad4 eukaryotic expression vector was successfully constructed, and transferred into the buffalo granulose cells, and the Smad4-EGFP fusion protein was detected in the cells. The results suggested that the success cloning and construction vector of buffalo Smad4 gene laid the foundation for the research of Smad4 gene on embryo development. 相似文献
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In this study, buffalo AQP8 gene was cloned and its eukaryotic expression vector was constructed, the expression pattern of AQP8 gene in buffalo ovary tissue was also assayed. The results showed that the CDS length of cloned buffalo AQP8 gene was 732 bp, and it shared 100% homology of amino acid sequence with cattle and mouse. AQP8 protein was detected in different developmental stages of buffalo follicles, it had significantly higher expression in the secondary follicles than that of in the primordial and the primary follicles (P＜0.05), and it mainly expressed in the granulosa cells of the secondary follicles. Clear EGFP green fluorescent was observed in transfected cell groups with transfection of the pEGFP-N1-AQP8 eukaryotic expression plasmid into HEK293T cells by LipofectamineR LTX and PLUSTM reagent. The above results lay foundation to further investigate the function of AQP8 gene in the buffalo follicle development and granulosa cell apopotosis. 相似文献