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1.
利用前期构建的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株与各自母株之间的抑制性消减文库而获得的ESTs序列,选择其中一个差异表达的EST序列（克隆号为M20）,采用RACE技术,以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA为模板,扩增获得了该基因的全长cDNA序列,命名为M20,该基因全长847 bp,包括一个525 bp的开放阅读框,编码174个氨基酸,预测理论分子量约为19 ku。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在敏感株中表达量高于地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株;在不同发育阶段中,未孢子化卵囊表达量高于孢子化卵囊、子孢子以及裂殖子阶段虫体。将该基因克隆于原核表达质粒pET28b中,构建重组质粒pET28b-M20,转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经IPTG诱导表达获得了重组蛋白,分子量约约为23 ku,该蛋白以包涵体形式存在,在IPTG诱导8 h后表达稳定,Western blot检测表明,其具有较好的免疫原性。 相似文献
2.
银染mRNA差异显示法克隆柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)抗药性相关基因 总被引：5，自引：0，他引：5
以柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）敏感株、地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株孢子化卵囊为材料，用银染mRNA差异显示方法筛选和克隆与球虫抗药性相关的基因。首先提取这3个虫株孢子化卵囊的总RNA为模板．用Oligo（dT）12GG为锚定引物和2个10碱基随机引物组合进行RTPCR，产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染。分别切取5务差异条带，进行2次PCR扩增，产物回收后与PGEM—T—easy Vector连接转化。经PCR鉴定正确后，再进行斑点杂交试验、序列分析和同源性比较。结果发现，地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株分离的差异片段中都有2个cDNA片段（可能为新的基因片段），这为克隆全长cDNA和探索球虫抗药性产生的分子机理奠定了一定的基础。 相似文献
3.
为克隆和研究柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)新基因,本研究在所获得的ESTs序列的基础上,应用RACE技术克隆获得了1个在子孢子阶段高表达新基因的全长cDNA序列(GU553107),命名为ZB7-C11,该基因全长1439bp,ORF为525bp,编码174个氨基酸,预测表达蛋白的分子量约为18.7ku。Real-timePCR对E.tenella不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)表达量进行分析显示,该基因在子孢子阶段的表达高于其它阶段。另外,将ZB7-C11克隆于pGEX-4T中构建重组质粒pGEX-4T-C11,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达6h后其表达量最高,并且重组蛋白分子量约44.7ku大部分以可溶性存在。Westernblot分析显示该重组蛋白可被抗E.tenella的多克隆抗血清识别,表明该蛋白具有较好的反应原性。该结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。 相似文献
4.
鸡球虫病是由艾美耳球虫引起的一种危害严重的肠道寄生虫病,每年都会给世界各地的养禽业带来巨大的经济损失。目前,该病主要依靠抗球虫药物进行防治,但由于药物的长期及不合理使用导致鸡球虫几乎对所有使用过的抗球虫药均产生耐药性。为研究球虫耐药性产生的分子机制,本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株以及敏感株进行了转录组测序并获得了敏感株与耐药株的差异表达基因,发现柔嫩艾美耳球虫含HD域蛋白（EtHDCP）在耐药株中上调表达。本研究以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA第一链为模板,成功克隆出EtHDCP基因,构建了原核表达重组质粒pGEX-4T-EtHDCP,并成功诱导表达了重组蛋白rEtHDCP。利用qRT-PCR和Western blot对柔嫩艾美耳球虫敏感株不同发育阶段的转录和翻译水平进行分析,结果显示,EtHDCP在第二代裂殖子的转录和翻译水平高于其他三个阶段（未孢子化卵囊、孢子化卵囊和子孢子）。同时利用Western blot分析了EtHDCP在柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株中的翻译水平,结果显示,EtHDCP在耐药株中的蛋白翻译水平显著高于敏感株。间接免疫荧光定位结果显示,该蛋白主要定位在子孢子和裂殖子的表面以及裂殖子的胞质内。入侵抑制试验表明,抗rEtHDCP多克隆抗体可有效抑制子孢子对宿主细胞的入侵。这些结果说明该蛋白可能参与了虫体在宿主细胞内的生长发育、耐药性的产生以及子孢子入侵宿主细胞的过程。 相似文献
5.
为了研究鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因原核表达重组蛋白的免疫效力,分析其在鸡抗柔嫩艾美耳球虫感染中对鸡平均增重、抗球虫指数(ACI)、减少盲肠病变和卵囊数量中的作用,从柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊中提取总RNA作为模板,用RT-PCR扩增出SO7基因片段,再应用DNA重组技术将SO7基因克隆到原核表达载体pET32a(+)中并用IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果显示,pET32a(+)-SO7表达的目的蛋白约为40ku,主要以包涵体形式存在。用纯化的重组蛋白进行动物免疫试验显示,SO7重组蛋白在鸡抗柔嫩艾美耳球虫感染中有较好的免疫保护作用,能够显著提高鸡柔嫩艾美耳球虫感染鸡的平均增重和抗球虫指数(ACI),对减少盲肠病变和卵囊数量也有部分作用。 相似文献
6.
利用本实验室前期获得的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）孢子化卵囊和未孢子化卵囊差异表达ESTs序列,选取编号为BW4-C03的孢子化卵囊,采用RACE技术,获得该基因全长序列。经BLAST分析,该序列与柔嫩艾美耳球虫表面抗原有72%以上的同源性,命名为EtSAG。利用荧光定量PCR（Real-time PCR）检测发现该基因在孢子化卵囊的转录拷贝数最高,且随着孢子化时间的延长,转录拷贝数逐渐增加。采用原核表达载体pET-28C表达该基因,得到的融合蛋白大小约为36 kDa,符合预期大小。经Western blot分析,该重组蛋白可被兔抗柔嫩艾美耳球虫的多克隆抗血清识别,表明该蛋白具有较好的反应原性。本研究结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。 相似文献
7.
《中国动物传染病学报》2016,(6)
为检测实验室长期保存的柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素抗药株和地克珠利抗药株的遗传稳定性,采用鸡体试验法,以抗球虫指数、最适抗球虫活性百分率、病变记分减少率和相对卵囊产量4项指标,评价2个抗药株对地克珠利、癸氧喹酯、马杜拉霉素等3种抗球虫药物的抗药性,并以柔嫩艾美耳球虫敏感株为对照。结果显示,柔嫩艾美耳球虫敏感株对3种抗球虫药物均无抗药性,4项指标全部阴性。柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素抗药株对马杜拉霉素为完全耐药,4项指标全部阳性;对地克珠利、癸氧喹酯则表现为无抗药性,4项指标全部阴性。柔嫩艾美耳球虫地克珠利抗药株对地克珠利表现为完全耐药,4项指标全部阳性;对马杜拉霉素表现为中度耐药,2项指标阳性;对癸氧喹酯则表现为无抗药性,4项指标全部阴性。结果表明,在实验室已繁殖保存10余年的柔嫩艾美耳球虫2个抗药虫株对其诱导药物具有明显抗药性,实验室保种繁殖方法可行,虫株遗传稳定性良好,为利用该虫株进行球虫抗药性机制等相关研究奠定了基础。 相似文献
8.
为探讨抗球虫药物地克珠利和马杜拉霉素对柔嫩艾美球虫18SrDNA的影响，分别对人工诱导的柔嫩艾美球虫地克珠利抗药株（ETAD）、马杜拉霉素抗药株（ETAM）和药物敏感株（ETDS）孢子化卵囊的18SrDNA基因进行了克隆测序，并通过生物信息软件进行对比差异分析。结果显示，ETAM株有3个碱基发生突变（T170突变为C，T646突变为C，G694突变为C）；ETAD株有1个碱基发生突变（T646突变为C）。经进一步分析比较，发现ETAM株18SrRNA的二级结构与ETDS株的差异很大，而ETAD株18SrRNA的二级结构则与ETDS株的完全相同。这些碱基的突变有可能是导致E．tenella产生抗药性的原因之一。 相似文献
9.
柔嫩艾美球虫抗药株第二代裂殖子的双向电泳图谱比较 总被引：8，自引：0，他引：8
对实验室诱导的柔嫩艾美球虫马杜拉霉素、地克珠利抗药株及其同母源敏感株第二代裂殖子的蛋白质进行双向电泳，构建了稳定的双向电泳图谱。经Imagemaster 2D Elite软件分析，敏感株和抗药株平均可分离900个点；以敏感株平均胶作为参考胶，抗药株平均胶与之比较，得到差异蛋白质斑点，其中地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株各有4个表达差异点。这些差异表达的蛋白质可能参与了球虫抗药性产生的过程。 相似文献
10.
本研究扩增和克隆了堆形艾美耳球虫巨噬细胞移动抑制因子,并在大肠杆菌中表达出MIF重组蛋白。根据GenBank中的MIF mRNA序列,设计特异引物,采用PCR方法以堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库为模板扩增获得MIF基因,将MIF基因片段连接到原核表达载体pET-28a（＋）,构建重组表达质粒pET28a—MIF,并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,对表达产物进行Western blot分析。结果从堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库中扩增出MIF基因片段,长度为709bp;经序列分析,扩增片段的核苷酸序列与GenBank中登录的MIF序列的同源性为99．5％;经SDS-PAGE检测表明重组质粒pET（28a）-MIF在大肠杆菌中以包涵体形式表达;Western blot分析证明堆形艾美耳球虫抗血清可与重组表达蛋白特异性结合。本研究结果为进一步研究该基因的功能奠定了基础。 相似文献