共查询到18条相似文献，搜索用时 234 毫秒
1.
试验旨在克隆猪SMYD3(SET and MYND domain-containing protein 3)基因并对其进行序列分析,研究其对猪成纤维细胞增殖的影响。首先克隆猪SMYD3基因,根据其他物种SMYD3基因siRNA和shRNA序列,经同源性比对分析,获得两条猪SMYD3基因shRNA序列,分别构建pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA1/shRNA2表达载体,转染HEK293T细胞,利用实时荧光定量PCR分析干扰效率,筛选出抑制效率较好的shRNA,并构建pLVX-IRES-ZsGreen1-SMYD3及pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA真核表达载体,同时分析SMYD3基因对猪成纤维细胞的增殖作用,检测细胞Nanog、DNMT1及DNMT3a基因表达情况。结果显示,试验克隆得到1 404 bp的猪SMYD3基因编码区序列,生物信息学分析发现,德保猪SMYD3基因与野猪、山羊和野耗牛相应氨基酸序列的同源性分别为99.5%、93.8%和92.9%。shRNA1/shRNA2均能显著抑制SMYD3基因表达(P0.05),抑制效果分别是34%和54%,选择pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA2进行后续研究。通过脂质体转染法将构建的pLVX-IRES-ZsGreen1-SMYD3及pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA真核表达载体导入HEK293T细胞,均可观察到清晰的绿色荧光。慢病毒感染细胞及实时荧光定量PCR结果显示,与空白对照组及阴性对照组相比,过表达SMYD3基因促进猪成纤维细胞增殖,Nanog和DNMT1基因表达显著升高(P0.05);抑制SMYD3基因表达,细胞增殖受到抑制,Nanog、DNMT1、DNMT3a基因表达显著降低((P0.05),说明SMYD3基因的表达与猪成纤维细胞的增殖显著相关。 相似文献
2.
试验旨在筛选有效抑制猪紧密连接蛋白1 (zonula occludens-1,ZO-1)基因表达的shRNA干扰片段,为后期利用RNA干扰技术深入了解ZO-1基因在猪卵母细胞成熟过程中的功能奠定基础。本研究首先克隆了猪ZO-1基因,并构建了其真核表达载体,而后筛选了有效抑制ZO-1基因表达的shRNA干扰片段。结果表明,猪ZO-1基因编码区长度为3 036 bp,多重序列比对结果显示,猪ZO-1基因核苷酸序列与牛、羊、马和人相应序列的同源性分别为88%、88%、87%和85%。构建的pDsRed-N1-ZO-1真核蛋白融合表达载体经脂质体法转染HEK293T细胞后,可观察到清晰的RFP红色荧光蛋白表达。将靶质粒与shRNA干扰质粒共转染HEK293T细胞48 h后,与对照组相比,可观察到红色荧光表达得到抑制。实时荧光定量PCR结果显示,设计合成的2条shRNA对猪ZO-1基因表达均有抑制效果,其中ZO-1 shRNA201的抑制效果显著高于ZO-1 shRNA1276 (77.8%和67.0%,P < 0.05)。 相似文献
3.
为了构建DEPTOR基因的过表达载体和shRNA干扰慢病毒载体,并验证载体的有效性,试验采用RT-PCR方法扩增兔DEPTOR基因编码区(CDS)序列,得到DEPTOR基因片段,同时合成DEPTOR基因的shRNA干扰序列。将DEPTOR基因片段分别连接到慢病毒真核表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1和融合表达载体pEGFP-N1上,获得过表达载体pLVX-DEPTOR-IRES-ZsGreen1和pEGFP-DEPTOR;将shRNA干扰序列连接到慢病毒干扰载体pSicoR-Ef1a-mCh上,获得shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508。用过表达载体转染HEK 293T细胞,72 h后观察荧光蛋白的表达情况并收集细胞,RT-PCR检测细胞水平上DEPTOR基因的表达情况。使用多质粒共同转染法,将过表达载体pEGFP-DEPTOR与shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508按照1∶1比例转染HEK 293T细胞,72 h后观察荧光蛋白的表达情况并收集细胞,采用实时荧光定量PCR方法检测shRNA干扰序列对DEPTOR基因表达的干扰效率。结果表明：... 相似文献
4.
试验旨在克隆猪JHDM2A基因,并研究其在猪卵巢组织中的表达情况。首先克隆猪JHDM2A基因,并构建pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A真核表达载体,同时对JHDM2A基因在猪卵泡发育过程中的表达情况进行分析。结果显示,克隆得到的猪JHDM2A基因编码区长度为3 945 bp,编码1 315个氨基酸。通过多重氨基酸序列比对发现,猪JHDM2A基因与黄牛、水牛、绵羊和人相应氨基酸序列的同源性分别为93.5%、94.7%、94.7%和93.8%。蛋白质分子系统进化树分析结果表明,JHDM2A基因在物种进化过程中高度保守。通过脂质体转染法将构建的pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A真核表达载体导入HEK293T细胞,可观察到清晰的绿色荧光蛋白表达。免疫组化结果显示,JHDM2A蛋白在不同发育阶段猪卵泡中均有表达。本试验通过克隆获得猪JHDM2A基因序列,JHDM2A蛋白在猪卵巢中高度表达,表明其功能可能与猪卵泡发育密切相关。 相似文献
5.
水牛脂多糖结合蛋白基因表达载体构建及其shRNA片段的筛选 总被引：1，自引：0，他引：1
试验旨在构建水牛脂多糖结合蛋白(LBP)基因融合蛋白表达载体,探讨其在293细胞中的表达情况;筛选获得可抑制水牛LBP基因表达的shRNA干扰片段。采用RT-PCR方法,以水牛肝脏cDNA为模板,扩增水牛LBP开放阅读框(ORF),将其连接到pMD18-T载体中。序列测定并分析正确后,采用SalⅠ和BamHⅠ进行双酶切,将水牛LBP基因编码区定向克隆至pDsRed-N1载体中,构建其融合蛋白表达载体pDsRed-N1-LBP。设计2个针对LBP靶基因序列的shRNA(774-792、1212-1231),同时设计无关序列1864作为阴性对照。合成好的shRNA序列先退火连接到pUC 57载体上,再亚克隆到慢病毒表达载体pSicoR-GFP中,将重组质粒命名为pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C),采用PCR和测序方法鉴定阳性克隆。将LBP融合蛋白表达载体和其shRNA慢病毒表达载体经脂质体共转染293细胞,48 h后观测荧光蛋白表达情况。收集共转染细胞样品,采用实时定量PCR(QRT-PCR)检测LBP基因的表达,筛选有效抑制LBP基因表达的shRNA干扰序列。结果表明,成功构建水牛LBP融合蛋白表达载体pDsRed-N1-LBP,并在293细胞中瞬时表达。PCR和测序结果均证实所构建的shRNA慢病毒表达载体pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C)为阳性克隆。共转染48 h后观测,红色和绿色荧光蛋白均有表达。QRT-PCR检测结果显示,shRNA-774和shRNA-1212对293细胞中LBP基因mRNA的表达均有抑制效果,抑制效率分别为49.53%、29.27%。因此,设计合成的2条shRNA序列能有效抑制水牛LBP基因的表达,这为进一步探讨LBP基因在LPS诱导的革兰氏阴性菌跨膜机制和信号转导中的作用机理研究奠定了基础。 相似文献
6.
针对小鼠ERO1α基因构建短发卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体。根据NCBI中小鼠ERO1α基因序列,设计3条针对ERO1α的shRNA序列和1条阴性对照shRNA序列。将shRNA序列连接到慢病毒载体pCD513B-U6上,同时进行PCR鉴定及测序,分别命名为pCD513B-ERO1α-shRNA和pCD513B-NC-shRNA。将构建好的重组质粒和包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液进行浓缩,同时梯度稀释转导HEK 293T细胞,检测病毒滴度。浓缩后的慢病毒转导RAW 264.7细胞,通过RT-qPCR和Western blot技术进行有效片段的筛选。之后,将筛选的慢病毒转到多种细胞系或者原代细胞,用RT-qPCR和Western blot技术检测ERO1α基因的表达情况。PCR及测序结果表明,重组慢病毒干扰载体pCD513B-ERO1α-shRNA构建成功,所包装的慢病毒其病毒滴度为5×10~7 TU/mL～10×10~7 TU/mL。RT-qPCR和Western blot结果表明,pCD513B-ERO1α-shRNA-3抑制ERO1α表达的效果最好,干扰效率在80%左右。pCD513B-ERO1α-shRNA-3能够转导多种细胞,并显著抑制ERO1α的表达,干扰效率在70%～90%。成功构建针对小鼠ERO1α基因的shRNA重组慢病毒载体,为进一步研究ERO1α功能奠定了技术基础。 相似文献
7.
8.
以巴马小型猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)感染HEK293细胞模型(PERV-BMHEK293)为研究对象,分析PERV整合对HEK293细胞活性的影响,同时建立7种与人细胞增殖和周期调控密切相关基因的实时荧光定量PCR(q-PCR)检测方法,并对细胞感染模型中7个基因的mRNA表达情况进行分析。细胞活力分析结果显示,随着培养代次及培养时间增加,相对于母源HEK293细胞PERV感染模型的细胞活力下降;qPCR检测方法建立结果显示,所构建的cyclinD1、CDK1、CDK4、k-ras、c-myc、p53、p16基因检测方法检测各基因在1.0×10~1~1.0×10~9 copies/μL反应范围内有很好的线性关系,扩增产物熔解曲线只出现特异性单峰,各组内变异系数在0.31%~2.01%之间,组间变异系数在0.46%~2.19%之间,重复性好,可稳定地用于相关基因mRNA的定量检测。用建立的q-PCR检测方法对PERV感染模型进行细胞周期调控相关基因mRNA表达分析,结果显示,与母源细胞相比,模型细胞cyclinD1、CDK1、CDK4、k-ras、p53和p16基因的mRNA表达无明显变化,原癌基因c-myc基因表达下调,提示PERV感染可能抑制c-myc基因表达。该研究结果可为评价巴马小型猪来源PERV在人-猪异种移植中生物安全性提供参考。 相似文献
9.
《中国畜牧兽医》2017,(11)
试验旨在构建猪β_2肾上腺素能受体(β_2adrenergic receptor,β_2AR)基因及其突变体真核表达载体,并鉴定其在HEK293T细胞中的表达。通过猪基因组DNA克隆猪β_2AR基因,利用同源重组技术将其连接至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-β_2AR,加入c-myc标签后命名为myc-pcDNA3.1(+)-β_2AR。以真核表达载体为模板构建突变体myc-pcDNA3.1(+)-β_2AR-D130N、myc-pcDNA3.1(+)-β_2AR-C285S和mycpcDNA3.1(+)-β_2AR-D130N/C285S,并将构建的真核表达载体和突变体转染HEK293T细胞,利用Western blotting技术验证其表达。结果显示,猪β_2AR基因已正确重组入pcDNA3.1(+)载体中;经测序鉴定,猪β_2AR的第130位天冬氨酸成功突变为天冬酰胺,第285位半胱氨酸成功突变为丝氨酸。Western blotting检测结果证明所构建的表达载体均可在HEK293T细胞中表达。本研究成功构建了猪β_2AR野生型的真核表达载体及2个单点突变和1个双点突变的突变体,并验证其在HEK293T细胞中正常表达,为进一步研究猪β_2AR蛋白表达及其药理学活性奠定基础。 相似文献
10.
利用RNAi技术，根据牛源PRNP基因eDNA设计3段siRNA序列和1个阴性对照序列，分别将其连接到RNA干扰载体pRNAT-U6．1／Neo上构建成shRNA载体，并将shRNA载体转染牛骨髓间充质干细胞（BMSC）；通过Real-timePCR和WesternBlotting筛选抑制效果最佳的载体；并用800mg／LG418对转染最佳载体的细胞进行药物筛选。结果显示：成功构建了3个靶向shRNA载体和1个阴性对照shRNA载体；转染后48h在荧光镜下检测各组均可观察到绿色荧光的表达；Real-timePCR和WesternBlotting结果显示，3个靶向shRNA载体在不同时间段均在一定程度上下调了PRNPmRNA的表达，抑制了朊蛋白PrP^c 的生成，得到了1个最佳干扰载体sh3；通过药物筛选出了稳定转染的细胞单克隆。本研究获得了1个有效抑制朊蛋白基因表达的shRNA载体，并筛选出稳定转染的细胞单克隆，上述结果可为抗疯牛病体细胞核移植提供供体细胞。 相似文献
11.
The aim of this study was to clone the JHDM2A gene of porcine and study the expression of JHDM2A gene in porcine ovary. In this study, we cloned the porcine JHDM2A gene and constructed its eukaryotic expression vector, the expression of JHDM2A gene in porcine ovarian tissue was also analyzed. The results showed that the cloned CDS length of porcine JHDM2A gene was 3 945 bp, which encoded 1 315 amino acids. The results of multiple amino acid sequence comparison showed that the porcine JHDM2A shared 93.5%, 94.7%, 94.7% and 93.8% homologous compared with those of Bubalus bubalis, Bos taurus, Ovis aries and Homo sapiens, respectively. Phylogenetic tree analysis indicated that the JHDM2A gene was highly conservative in the evolutionary process. The pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A eukaryotic expression vector was constructed, and clear green fluorescent signal was observed when the plasmid was transfected into HEK293T cells by liposome method. The immunohistochemical results showed that the JHDM2A protein was expressed in porcine follicle of different development stages.The results showed that the porcine JHDM2A gene sequences was cloned, and the JHDM2A protein was highly expressed in porcine ovary, indicating that its function might be closely related to the development of porcine follicular. 相似文献
12.
CAO Li-hua WANG Ping HAO Wen-yan DAI Xiao-li CHEN Pei-fang SHI De-shun LI Xiang-ping 《中国畜牧兽医》2016,43(6):1405-1412
The aim of this study was to screen effective shRNA fragments targeting pig zonula occludens-1 (ZO-1) gene,which would lay foundation to further explore its function in pig oocytes in vitro maturation (IVM) by RNAi technology.Pig ZO-1 gene was cloned and its eukaryotic expression vector was constructed,its effective shRNA fragments were screened.The results showed that the CDS length of cloned pig ZO-1 gene was 3 036 bp.The results of sequence multialigned showed that the sequence of pig ZO-1 gene shared 88%,88%,87% and 85% homology with Taurus,Ovis aries, Equns caballus and Homo sapiens,respectively.Clear RFP red fluorescent was observed in transfected cells with the pDsRed-N1-ZO-1 eukaryotic expression plasmid transfected into HEK293T cells by X-tremeGENE HP DNA transfection reagent.Two shRNA fragments targeting pig ZO-1 gene were designed and synthesized,weaker RFP red fluorescent was observed in co-transfected cells with the target and interfered shRNA plasmid groups.The Real-time PCR results showed that the two designed shRNAs could effectively inhibit the expression of pig ZO-1 mRNA,shRNA201 fragment had significantly higher inhibition effect than that of shRNA1276 fragment (77.8% and 67.0%,P < 0.05). 相似文献
13.
SHI Ang SHI Qing-he LI Xin-guo WANG Yu-guo YANG Li LI Shuang-shuang CHEN Lu WANG Chuan-qing 《中国畜牧兽医》2017,44(9):2587-2592
To obtain recombinant eukaryotic expression plasmid of porcine interleukin-18(IL-18), the whole gene of porcine IL-18 gene was amplified from porcine spleen, lung and lymph nodes by RT-PCR and cloned into eukaryotic expression vector pZJ-1. The recombinant expression plasmid pZJ-IL-18 were identified by enzyme digestion and sequencing analysis, and was transfected into 293T cells.The expression of IL-18 was detected by Real-time PCR and Western blotting in both gene and protein levels. The results showed that the eukaryotic expression plasmid of porcine IL-18 was constructed and could express transiently in 293T cells. Western blotting result confirmed that porcine IL-18 polyclonal antibody could react specifically with approximately 17 ku expression products,and indicated that IL-18 could express correctly and be responsive.This study constructed the eukaryotic expression plasmid of porcine IL-18 gene which could express transiently in 293T cells, and laid the foundation for studying function of IL-18. 相似文献
14.
为获得表达猪白细胞介素18（interleukin-18,IL-18）的真核表达重组质粒,试验通过RT-PCR从猪脾脏、肺脏和淋巴结组织中扩增猪IL-18全基因并定向克隆到真核表达载体pZJ-1,测序分析和酶切鉴定正确后,转染至293T细胞中,并通过实时荧光定量PCR和Western blotting分别在基因和蛋白水平检测IL-18的表达。结果表明,试验成功构建了真核表达重组质粒pZJ-IL-18,且可以在293T细胞中表达IL-18基因。Western blotting试验证实,猪IL-18多克隆抗体能与约17 ku的表达产物发生特异性反应,表明IL-18能正确表达且具有反应原性。本试验构建了表达猪IL-18基因的真核表达质粒,并在293T细胞中瞬时表达,为进一步研究IL-18的功能奠定基础。 相似文献
15.
【目的】构建猪神经介素B受体(NMBR)基因慢病毒过表达载体,并检测其在猪Leydig细胞中的表达,为研究NMBR基因过表达在猪睾丸间质(Leydig)细胞中的功能提供参考。【方法】根据猪NMBR基因(GenBank登录号:KM058699)CDS序列设计并合成特异性酶切引物,通过RT-PCR扩增获得猪NMBR CDS全长序列,构建pMD19-T-NMBR质粒;通过Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ对pCD513B-1和pMD19-T-NMBR质粒双酶切,构建pCD513B-1-NMBR重组质粒;将pCD513B-1-NMBR重组质粒与辅助质粒共转染人胚肾细胞(HEK-293T),转染48 h后通过荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)情况,收集细胞培养液上清获得猪NMBR基因过表达慢病毒,并通过倍比稀释法测病毒效价;然后将猪NMBR基因过表达慢病毒转染猪Leydig细胞,转染48 h后观察细胞中GFP表达,收集细胞并通过实时荧光定量PCR检测NMBR mRNA的表达情况。【结果】通过RT-PCR成功扩增获得猪NMBR CDS全长序列,大小为1 173 bp;pMD19-T-NMBR重组质粒双酶切为2条特异性条带,条带大小分别与pMD19-T质粒和猪NMBR CDS序列片段大小一致,表明成功构建pMD19-T-NMBR质粒;通过双酶切获得线性化的pCD513B-1和NMBR序列;RT-PCR和测序结果表明,成功构建慢病毒过表达载体pCD513B-1-NMBR;pCD513B-1-NMBR转染48 h后,HEK-293T细胞中呈现大量绿色荧光,表明病毒包装成功,病毒效价约为4×106 TU/mL;NMBR基因慢病毒转染猪Leydig细胞48 h后,80%以上细胞有GFP表达,表明大部分细胞成功转染慢病毒;实时荧光定量PCR检测结果表明,转染慢病毒后能够极显著增加NMBR mRNA的表达(P＜0.01)。【结论】本试验成功构建了猪NMBR基因慢病毒过表达载体,并证实猪NMBR基因过表达慢病毒能够增加猪Leydig细胞NMBR基因的表达,为研究NMBR基因过表达在猪Leydig细胞中的作用奠定基础。 相似文献
16.
【目的】 扩增猪血清和糖皮质激素诱导型激酶（SGK）家族基因并进行生物信息学分析,探索其在猪脂肪组织和细胞中的表达模式。【方法】 以藏猪脂肪细胞cDNA为模板PCR扩增SGK家族基因,通过在线工具预测其编码蛋白的理化性质及亚细胞定位;用Mega X软件构建系统进化树;采集30日龄巴马猪心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、背肌、腿肌、颈部脂肪、背部脂肪、腹股沟脂肪、肾周脂肪等组织及7日龄和4月龄猪腹股沟脂肪组织,通过实时荧光定量PCR检测SGK家族基因在猪不同部位组织中的表达;采集30日龄巴马猪腹股沟脂肪组织并分离基质血管成分（SVF）细胞,诱导SVF细胞向白色脂肪细胞分化,通过实时荧光定量PCR检测SGK家族基因及脂肪分化标记基因CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）在脂肪细胞中的表达。【结果】 SGK1、SGK2和SGK3基因CDS区序列长度分别为1 296、1 104和1 473 bp,分别编码431、367和490个氨基酸;SGK1和SGK2定位于细胞质,SGK3定位于细胞核,三者均为亲水性蛋白,3个蛋白均含有相同基序,保守性高;系统进化树结果表明,猪与牛的亲缘关系最近;SGK1和SGK3基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、多种肌肉及脂肪组织广泛表达,SGK2基因在颈部、背部、腹股沟、肾周脂肪组织中均有较高表达;SGK1和SGK2基因在7日龄猪脂肪组织中表达量极显著高于4月龄猪脂肪组织（P<0.01）,SGK3基因在4月龄和7日龄的猪脂肪组织中表达量无显著差异（P>0.05）,且SGK3基因的表达量低于SGK1和SGK2基因;与未分化脂肪细胞相比,在分化后的脂肪细胞中SGK1和SGK2基因的表达量极显著上调（P<0.01）,且SGK1基因的表达量远高于SGK2基因,而SGK3基因的表达量无显著变化（P>0.05）。【结论】 SGK家族蛋白具有保守结构域,可能发挥着相似的功能,SGK1和SGK2可能参与调控猪脂肪细胞的分化过程,结果可为探究猪脂肪沉积的分子机制提供一定的理论基础。 相似文献
17.
为探索干扰素诱导跨膜蛋白1（interferon-inducible transmembrane protein 1,IFITM1）对猪源冠状病毒复制的影响,本研究选用猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）高致病毒株及其宿主细胞PK15作为研究对象。正常PK15细胞接种TGEV后,实时荧光定量PCR检测感染后不同时间点PK15细胞中一些干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes,ISGs）的mRNA表达水平;利用慢病毒表达系统构建稳定表达和稳定干扰IFITM1表达的PK15细胞系。将一段靶向干扰猪源IFITM1的shRNA序列及猪源IFITM1全长,分别插入pLKO.1-EGFP-Puro载体及pLVML-Myc-MCS-IRES-Puro载体中,分别构建出pLKO.1-IFITM1shRNA-EGFP-Puro及pLVML-Myc-IFITM1-IRES-Puro重组质粒。将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞后获得带有目的基因的重组慢病毒,慢病毒侵染PK15细胞后用嘌呤霉素进行筛选,获得稳定表达及稳定干扰IFITM1表达的PK15细胞系,分别命名为PK15-IFITM1及PK15-IFITM1-/-,并分别用实时荧光定量PCR、间接免疫荧光试验（IFA）及Western blotting检测IFITM1干扰效率及表达情况;TGEV接种PK15-IFITM1-/-和PK15-IFITM1,实时荧光定量PCR测定细胞中TGEV的拷贝数。结果显示,PK15细胞接种TGEV后的48 h内,一些ISGs的mRNA水平均有所上升;PK15-IFITM1-/-细胞系的干扰效率为70%,PK15-IFITM1细胞系表达成功;在PK15-IFITM1-/-细胞系中,IFITM1的mRNA水平显著下调,促进了TGEV的复制。反之,在PK15-IFITM1细胞系中,TGEV的复制受到了抑制。但IFITM1的表达或缺失却不影响TGEV对PK15的吸附作用。总之,IFITM1对TGEV有显著的抗病毒作用,IFITM1不影响TGEV对PK15细胞的早期吸附,这为后续IFITM1抗冠状病毒机制的研究奠定了基础。 相似文献
18.
本研究通过构建腺病毒介导的体外超表达载体，探究腺苷甲硫氨酸转移酶2A（methionine adenosyltransferase 2A，MAT2A）基因在猪肌内脂肪细胞分化中的作用。根据GenBank中猪MAT2A基因mRNA序列（登录号：NM_001167650.1）设计引物，提取猪脂肪组织细胞总RNA并反转录获得cDNA，以此为模板进行PCR扩增并连接到pAdTrack-CMV腺病毒穿梭载体中，对重组质粒pAd-MAT2A进行测序鉴定；pAd-MAT2A载体经PacⅠ限制酶酶切线性化，经质粒大片段回收纯化后转染293A细胞进行病毒包装；采用实时荧光定量PCR检测MAT2A基因表达情况，并提取蛋白进行Western blotting分析，取分化第8天的细胞进行油红O染色。结果表明，穿梭载体pAdTrack-CMV-MAT2A构建成功，并能与骨架载体pAdEasy-1实现同源重组；腺病毒载体pAd-MAT2A转染293A细胞后，病毒滴度达到1E+6 PFU/mL，可满足侵染猪肌内脂肪细胞的需要。实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示，MAT2A基因mRNA和蛋白水平均显著上调。油红O染色结果显示，过表达MAT2A基因可促进猪肌内脂肪细胞内脂滴聚积。结果表明，腺病毒介导的MAT2A基因过表达在猪肌内脂肪细胞中呈上调趋势，MAT2A基因可促进脂质积累。 相似文献