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为研究草鱼(Ctenopharyngodon idella)miR-33在固醇调节元件结合蛋白-1(Sterol regulatory element binding protein 1,SREBP-1)调节脂代谢中的作用,构建了草鱼SREBP-1基因3'端非翻译区(Untranslated region,UTR)含miR-33靶序列的双荧光素酶报告基因载体。首先用PCR法获得SREBP-1 mRNA含miR-33结合位点的3'UTR序列(379 bp),与双荧光素酶报告载体pmir GLO重组后转染DH5α感受态细胞。然后经筛选和双酶切鉴定,获得含有SREBP-1基因3'-UTR的双荧光素酶报告载体:pmir GLO-SREBP-1-3'-UTR。最后在草鱼肝细胞L8824共转染miR-33mimics和pmir GLO-SREBP-1-3'-UTR,明确miR-33与SREBP-1基因3'UTR区的靶向关系。结果表明,含有SREBP-1基因3'-UTR序列的双荧光素酶报告基因载体构建成功,PCR、双酶切和基因测序证明序列与目标一致;转染pmir GLO-SREBP-1-3'-UTR的L8824细胞可表达荧光素酶,单独转染载体组的荧光素酶活性显著高于共转染载体和miR-33 mimics组(P0.05)。本研究证实草鱼SREBP-1是miR-33的直接靶基因,miR-33通过和SREBP-1 mRNA 3'UTR结合,调控SREBP-1基因的转录后表达。 相似文献
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生物信息学预测猪Smad3为miR-23a的靶基因,为了研究猪Smad3与miR-23a之间的调节关系,人工合成miR-23a双链序列及Smad3基因3'UTR中mR-23a的结合位点序列,分别与带荧光的慢病毒质粒pshRNA-copGFP Lentivector及萤光素酶质粒pPGL3-control连接,构建重组质粒LV-shRNA-miR-23a和pPGL3-control-Smad3-3'UTR.将两重组质粒共转CHO细胞,以慢病毒空质粒与pPGL3-control-Smad3-3'UTR共转作为对照,48 h后收集细胞裂解液检测荧光素酶活性变化,提取细胞总RNA实时荧光定量检测荧光素酶基因mRNA表达变化.结果显示,试验成功构建了重组质粒LV-shRNA-miR-23a和pPGL3-control-Smad3-3'UTR.miR-23a能够显著抑制荧光素酶基因mRNA表达(P＜0.05),并能通过抑制Smad3结合位点序列抑制其上游荧光素酶的活性(P＜0.05).初步证明,猪Smad3与miR-23a有直接的靶向关系. 相似文献
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鸡miR-133a靶向调控BIRC5基因的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】研究miR-133a在鸡不同组织中的表达情况,对baculoviral IAP repeat containing 5（BIRC5）进行靶基因的试验验证,探讨鸡miR-133a对BIRC5的靶向调控作用。【方法】采用生物信息学方法对miR-133a靶基因进行预测,并用双荧光素酶报告系统及点突变试验对BIRC5进行靶基因验证,同时运用实时荧光定量PCR检测miR-133a在鸡不同组织中的表达量。【结果】在鸡3′UTR数据库的11 891个基因中预测到287个miR-133a的靶基因;miR-133a在鸡的组织表达谱中显示其在肌肉中的表达量较高,尤其是在骨骼肌中表达量最高;报告基因试验显示BIRC5是miR-133a的靶基因,点突变试验证实了miR-133a在BIRC5上结合的靶位点。【结论】miR-133a是与鸡骨骼肌发育高度相关的miRNA,且鸡BIRC5基因是miR-133a的靶基因。 相似文献
4.
[目的]本文旨在探究热应激对羊成肌细胞部分miRNA的影响,并对miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p进行生物信息学分析与靶基因预测,揭示热应激下miRNA影响骨骼肌发育的调控机制。[方法]通过RT-qPCR技术研究热应激对羊成肌细胞miRNA表达量的影响;利用miRBase数据库获取不同物种中miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p的前体序列和成熟序列,并利用MEGA X软件构建系统进化树进行相似性分析;通过TargetScan、miRDB、RNA22、miRWalk对上述miRNA进行靶基因预测,使用DAVID对预测出的共同靶基因进行GO功能与KEGG通路富集分析,最后进行miRNA、共同靶基因与KEGG通路的关联分析。[结果]热应激显著下调羊成肌细胞在增殖阶段与分化阶段miRNA的表达。miR-23a、miR-24、miR-27a和miR-30a在不同物种间的保守性较高,除了牛的miR-24以外,成熟序列基本相同,种子序列完全一致。预测出的共同靶基因主要富集在细胞增殖、分化、周期、凋亡、迁移等GO条目,以及mTOR... 相似文献
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为筛选和验证辽宁绒山羊粗型和细型个体羊绒细度相关候选基因ALX4、NT-3、POLD2和AKT1表达调控潜在靶标miRNAs及其表达差异,提取辽宁绒山羊细型和粗型皮肤组织DNA和RNA,先采集辽宁绒山羊粗型和细型肩胛部皮肤组织,根据NCBI上的序列克隆获得ALX4、NT-3、POLD2和AKT1基因的3'UTR,利用Primer 5.0设计并合成功能引物,通过常规PCR扩增ALX4、NT-3、POLD2和AKT1基因的3'UTR序列,在miRBase数据库中,筛选羊绒细度候选靶基因3'UTR靶标miRNAs,然后与辽宁绒山羊(LCG)和内蒙古绒山羊(MCG)品种间皮肤miRNAs高通量测序结果共聚焦,筛选和验证羊绒细度相关候选基因表达调控潜在靶标miRNAs,在NCBI中检索到miRNAs的前体序列,应用RNAfold获得二级结构图及势能图,通过qPCR验证细型辽宁绒山羊(Fine type LCG)和粗型辽宁绒山羊(Coarse type LCG)皮肤组织中羊绒细度候选基因ALX4、NT-3、POLD2和AKT1靶标miRNAs的表达量。结果表明:通过miRBase数据库预测,羊绒细度候选基因ALX4、NT-3、POLD2和AKT1分别获得104,27,19和32个靶标miRNAs,与绒山羊品种间皮肤miRNAs高通量测序结果聚焦分析,ALX4基因聚焦到3个靶标miR-m13,miR-433-5p和miR-671,其表达量是56,2和27;NT-3基因聚焦到1个靶标miR-1296,表达量是41;POLD2基因聚焦到1个靶标miR-130b,表达量是177;AKT1基因聚焦到2个靶标miR-345-3p和miR-2331-3p,其表达量是52和5。其中前体序列的二级结构表明miR-2331-3p的结构最不稳定,miR-1296最小自由能的绝对值最大,结构最为稳定。用qPCR验证miR-m13,miR-433-5p,miR-671,miR-1296,miR-345-3p和miR-2331-3p在辽宁绒山羊细型皮肤中的表达量都显著高于粗型皮肤中的表达量,可能对羊绒细度候选基因发挥重要的正调控作用,而miR-130b在LCG粗型的表达量高于LCG细型表达量,可能miR-130b对羊绒细度相关候选基因起负调控作用。 相似文献
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《浙江农林大学学报》2017,(3)
网格蛋白介导的胞吞是病毒侵入细胞的重要途径,网格蛋白重链(clathrin heavy chain,CLTC)是形成网格蛋白小窝结构的重要组成部分。针对CLTC基因的转录后调控特别是调控猪Sus scrofa CLTC的miRNA目前还不太清楚。本研究旨在筛选出调控猪CLTC基因的miRNA。利用生物信息学方法预测出6个靶向猪CLTC基因的miRNA,将猪CLTC基因3′UTR克隆至双荧光素酶报告基因载体psi CHECK2中获得双荧光素酶报告基因重组载体psi CHECK2-CLTC-3′UTR。将预测得到的miRNA分别和重组载体psi CHECK2-CLTC-3′UTR共转染到细胞中,以乱序序列作为阴性对照(NC),检测miRNA对重组质粒荧光素酶活性的影响。结果发现miR-205,miR-1,miR-129-5p和miR-206均能够显著抑制荧光素酶活性(P0.05)。在猪肾上皮细胞系PK15细胞中超表达miR-1和miR-129-5p后,定量PCR(q-PCR)结果显示:猪CLTC基因的表达量显著下调。突变了psi CHECK2-CLTC-3′UTR载体中这4个miRNA的种子序列的结合位点发现:miR-1对突变质粒中的荧光素酶无显著抑制作用。表明miR-1与猪CLTC基因有直接的靶向关系,并通过其种子序列抑制CLTC基因的表达。 相似文献
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采用生物信息软件系统分析miR-151-3p的保守性,并筛选出与小鼠肌肉发育和肿瘤发生相关靶基因:蛋白激酶3(serine/threonine kinase 3,Akt 3),Twist碱性螺旋-环-螺旋转录因子(twist basic helix-loophelix 1,Twist 1)和T型电压依赖性钙通道α1g亚基(calcium channel,voltage-dependent,T type,alpha 1g subunit,Cacna1g)。采用实时定量PCR及双荧光素酶报告基因检测技术对以上靶基因进行初步验证,结果表明,超表达miR-151-3p显著抑制Akt 3mRNA表达,而Twist 1和Cacna1g mRNA表达变化不显著;双荧光素酶报告系统分析发现,miR-151-3p显著抑制野生型Akt 3报告载体相对荧光素酶活性,突变Akt 3 3′UTR与miR-151-3p结合的位点后,相对荧光素酶活性得到恢复,而Twist 1和Cacna1g基因双荧光素酶报告载体无此现象,结果证实Akt 3是miR-151-3p的靶基因。 相似文献
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《新疆农业大学学报》2018,(4)
为了确定宿主miR-142a-3p是否参与猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)感染致神经损伤的过程,本研究利用实时荧光定量PCR方法对不同时间点感染PHEV的N2a细胞和BALB/c小鼠脑组织中miR-142a-3p的表达情况进行了检测。结果显示,在PHEV的体内外感染模型中,miR-142a-3p的表达量均明显上调。进而通过生物信息学软件预测分析,筛选出跨膜蛋白59(Tmem59)可能是miR-142a-3p的靶基因,并利用双荧光素酶报告系统对该靶基因进行验证。结果表明,宿主感染PHEV后,体内的miR-142a-3p表达明显上调,并筛选出与机制相关的靶基因Tmem59。 相似文献
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为了检测miR-222-3p在填饲鹅不同组织中的表达情况，并对其靶基因进行预测和验证，探讨miR-222-3p在鹅肥肝形成中的功能。运用实时荧光定量 PCR技术检测miR-222-3p 在填饲鹅肝脏、胸肌和腹脂中的表达量；采用生物信息学方法对鹅miR-222-3p的靶基因进行预测，荧光定量PCR技术检测预测靶基因在肝脏中的表达量，并利用双荧光素酶基因报告系统验证其靶向关系。结果显示：相比对照组，miR-222-3p 在填饲鹅肝脏和腹脂中的表达量均显著升高；生物信息学预测结果显示MARF1和B4GALNT3基因在3’UTR区域存在miR-222-3p的潜在结合位点，且这两个基因在鹅肥肝中均显著下调，而双荧光素酶基因报告系统显示只有MARF1基因与鹅 miR-222-3p存在靶向关系。结果表明，miR-222-3p在鹅肥肝中表达量显著上调，且可能通过其靶基因MARF1对鹅肥肝的形成发挥调控作用。 相似文献
11.
为探究miR-142-3p在MCF-7细胞中作用机理,采用RNA免疫共沉淀技术和双荧光素酶报告基因技术筛选及验证miR-142-3p作用靶基因;蛋白质免疫印迹技术验证靶基因及其介导的PI3K-AKT-mTOR信号通路蛋白表达量及通路活性;应用实时荧光定量PCR验证靶基因PTEN对miR-142-3p调节关系。结果表明,miR-142-3p靶向调节AKT和PTEN表达;miR-142-3p过表达组中PI3K-AKT-mTOR通路活性显著降低;miR-142-3p抑制组中PI3K-AKT-mTOR通路活性显著上升;抑制PTEN表达显著提高miR-142-3p表达量。因此miR-142-3p靶向调节AKT和PTEN表达继而抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路活性,PTEN与miR-142-3p存在调节关系。 相似文献
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《江苏农业学报》2016,(1)
为了研究家蚕bmo-miR-34(一类高度保守的miRNA)对E74基因(BmE74)的表达调控作用,首先利用生物信息学软件RNAhybrid和RNA22进行结合位点预测,然后从家蚕丝腺组织中克隆了bmo-miR-34前体序列,分别构建bmo-miR-34表达载体和靶基因BmE74 3'UTR重组表达载体,利用双报告基因荧光检测系统在细胞水平研究bmo-miR-34对BmE74基因的转录后调控作用。生物信息学预测结果表明,BmE74 3'UTR具有bmo-miR-34潜在结合位点;体外转染试验结果显示,与对照相比,转染bmo-miR-34重组质粒的细胞荧光素酶活性极显著下调(P0.01),但是当加入人工合成的bmo-miR-34抑制物后荧光素酶活性显著上调(P0.01)。说明bmo-miR-34对BmE74的转录后表达具有抑制作用。 相似文献
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[目的]明确猪miR-124与其靶基因IQGAP2间的表达调控关系,以及miR-124表达水平与猪巨噬细胞内沙门氏菌数量的关联,为揭示沙门氏菌在感染细胞内存活与增殖的机制提供理论依据.[方法]通过荧光素酶报告基因系统验证miR-124与IQGAP2基因的作用位点;再以GM-CSF诱导的猪巨噬细胞和鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)为试验材料,通过实时荧光定量PCR和流式细胞术测定沙门氏菌感染猪巨噬细胞中miR-124和IQGAP2基因的表达及巨噬细胞内沙门氏菌的增殖情况.[结果]miR-124结合位点野生型载体转染的荧光报告信号显著低于miR-124结合位点突变载体(P<0.05,下同),但共转染anti-miR-124序列后能显著增强miR-124结合位点野生型载体的荧光报告信号.经沙门氏菌感染后,猪巨噬细胞中的miR-124表达被激活,感染12、24和48 h后的相对表达量均显著高于沙门氏菌感染前(0 h),而IQGAP2基因表达水平呈显著下调趋势;在沙门氏菌感染猪巨噬细胞内,miR-124表达水平与IQGAP2基因表达水平呈明显负相关(r=-0.92).miR-124高表达组细胞内的沙门氏菌数量显著高于正常巨噬细胞,但miR-124敲低表达组细胞内的沙门氏菌数量显著低于正常巨噬细胞;IQGAP2基因敲低表达组细胞内的沙门氏菌数量显著高于正常巨噬细胞;此外,miR-124高表达+IQGAP2基因敲低表达组细胞内的沙门氏菌数量与IQGAP2基因敲低表达处理组相比无显著差异(P>0.05),但显著高于miR-124高表达组细胞.[结论]沙门氏菌感染猪巨噬细胞中的miR-124表达水平与IQGAP2基因表达水平及胞内沙门氏菌数量呈负相关,即沙门氏菌可通过上调miR-124表达靶向抑制IQGAP2基因表达,从而调节其在猪巨噬细胞内的增殖. 相似文献
14.
microRNA为短链非编码RNA,通过与靶基因3'UTR序列互补在转录后水平发挥作用。已有研究表明,microRNA在心脏发育过程中起着重要的调控作用。南极冰鱼因体内缺乏功能性血红细胞,其心脏出现了补偿性增生。前期的研究提示,独角雪冰鱼心脏中特异表达的microRNAs可能与冰鱼心脏的补偿性增生相关。本研究针对南极冰鱼心脏中高表达的miR-210-5p,运用斑马鱼显微注射、靶基因预测等手段研究了miR-210-5p对心脏发育的作用机制。结果表明:斑马鱼胚胎注射miR-210-5p后,出现心包膜水肿,心脏发育畸形等现象。qRT-PCR分析显示,过表达miR-210-5p的斑马鱼胚胎中,心脏发育相关的标志性基因bmp4、smad1、gata6以及tbx2b的表达水平下调。Western blotting分析发现,bmp/smad通路中的BMP2、BMP4、SMAD1、GATA6以及TBX2B的蛋白表达水平也显著下调。通过对tbx20基因3'UTR的靶基因生物信息学预测,以及对其进行GFP荧光表达分析,发现tbx20基因可能是miR-210-5p的一个靶基因。由此推测,miR-210-5p可能通过抑制tbx20基因的表达,并调控bmp/smad通路以抑制冰鱼心脏发育。 相似文献
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miR-200b对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
为探索miR-200b对奶牛乳腺上皮细胞泌乳能力的影响,以奶牛乳腺上皮细胞为体外研究模型,利用miR-200b mimics转染进行miR-200b过表达;应用生物信息学软件分析预测miR-200b靶基因,qRT-PCR检测miR-200b过表达后预测靶基因及乳成分合成相关信号通路关键基因mRNA表达的变化;通过CASY细胞活力分析仪及5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(Ed U)标记法分别检测miR-200b过表达对细胞活力及增殖的影响;应用CSN2(β-酪蛋白)试剂盒、TG试剂盒及乳糖试剂盒检测细胞胞外分泌β-酪蛋白、甘油三酯及乳糖含量的变化。生物信息学分析显示,miR-200b与乳腺泌乳功能基因Pten、Dnmt3a、Dnmt3b的3'UTR区序列具有互补结合的位点;qRT-PCR分析结果显示,与对照组相比,过表达miR-200b后的奶牛乳腺上皮细胞中Pten mRNA的表达量显著降低,而乳成分合成相关信号通路关键基因Akt、Srebp1、Csn2、Glut1 mRNA的表达量显著上调;miR-200b过表达能够提高奶牛乳腺上皮细胞活力,促进奶牛乳腺上皮细胞增殖及β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖的合成分泌。综上,miR-200b能够负调控靶基因Pten的表达进而在奶牛乳腺泌乳过程中发挥重要的正调控作用。 相似文献
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为研究鸡miR-1749功能及其前体rs15860000(C>T)不同基因型对成熟miRNA生成的影响,采用Mfold软件预测C>T突变对miR-1749前体二级结构能值的影响;选用pcDNA3.1-EG-FP质粒,构建miR-1749前体不同等位基因的真核表达载体并转染DF1细胞,检测成熟miR-1749的表达;利用 TargetScan 和 miRDB 软件预测 miR -1749的靶基因,并将靶基因的并集在DAVID数据库进行GO功能富集和KEGG信号转导通路分析。 Mfold预测结果显示,miR-1749前体C>T突变影响其前体二级结构自由能值;成功构建pcDNA3.1-EGFP-pre-miR-1749-C和pcDNA3.1-EGFP-pre-miR-1749-T真核表达载体,转染DF1细胞后,不同基因型重组质粒miR-1749的表达量均显著高于空质粒组( P<0.01), T等位基因成熟miR-1749的表达量显著高于C等位基因(P<0.05)。2个软件预测结果显示,miR-1749靶基因的并集有250个基因,这些基因显著富集于Ras蛋白信号转导调控、GTPase介导信号转导调控、细胞稳态及胚后发育的生物学过程和GnRH、MAPK及细胞黏附分子的信号转导通路。 相似文献
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猪miR-22前体上游序列片段突变可能对miR-22的表达起到重要调控作用,为进一步探究其功能,基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过针对猪miR-22前体上游序列片段设计2个靶标sgRNAs(short guide RNAs),构建重组表达载体pX459-sgRNA1和pX459-sgRNA2;随后将重组质粒转染猪肾上皮细胞系(PK15),经嘌呤霉素初步筛选后,提取基因组DNA,通过PCR及测序鉴定编辑效果;最后,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测编辑前后miR-22相对表达量的变化。结果显示,81个阳性克隆中,共产生6种突变类型,突变率达60.49%;qRT-PCR检测显示,编辑后miR-22的表达量显著下调约50%。本研究成功获得了miR-22前体上游序列突变的猪PK15细胞模型,为今后猪miR-22的功能研究提供了新的可应用研究对象。 相似文献
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《吉林农业》2014,(4)
目的:构建携带增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和miR-505基因的慢病毒载体。方法:采用PCR方法从pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-505表达载体质粒扩增出miR-505 shRNA基因编码区173bp、175、171bp片段,通过限制性酶切、T4DNA连接酶连接,分别将miR-505 shRNA基因插入慢病毒表达载体FUGW与L26Fsy(1.1)GW中,构建成重组载体FUGW-miR-505-3p/5p/nc与Fsy-miR-505-3p/5p/nc。脂质体介导下将慢病毒重组载体转染至HEK 293T细胞,通过EGFP观察转染效率,RT-PCR方法检测miR-505的表达量。结果:荧光显微镜下观测到HEK 293T细胞转染后有较强绿色荧光;RT-PCR显示转染FUGW-miR-505-3p/5p与Fsy-miR-505-3p/5p的HEK 293T细胞中对应miR-505-3p/5p明显升高。结论:成功构建带有EGFP和miR-505-3p/5p/nc shRNA基因的慢病毒表达载体。 相似文献
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为探究miR-19a对民猪脂肪细胞分化过程的调控机制，研究采用双荧光素酶报告载体、实时荧光定量PCR构建组织表达谱、过表达和抑制miR-19a后对成脂标志基因和脂肪酸代谢标志基因的影响，油红O染色等生物学技术分析miR-19a对前脂肪细胞成脂的影响。结果表明，miR-19a与KLF13呈靶向关系，过表达miR-19a抑制成脂标志基因表达，促进脂肪酸代谢标志基因表达，抑制脂滴形成。抑制miR-19a可促进成脂标志基因表达，抑制脂肪酸代谢标志基因表达，促进脂滴形成。综上，试验验证miR-19a可抑制前脂肪细胞成脂分化，确定KLF13为miR-19a靶基因，为进一步研究microRNA对民猪前脂肪细胞分化的调控机制提供参考。 相似文献