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试验旨在对基因组DNA的制备进行研究,为细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)文库的构建奠定基础。以豁眼鹅全血为试验材料,提取高质量的基因组DNA,分别采用HindⅢ、EcoRⅠ和BamHⅠ3种限制性内切酶对所提基因组DNA进行部分酶切,并利用控制酶切时间、设置不同的HindⅢ酶切浓度梯度对基因组DNA进行部分酶切。结果表明,HindⅢ为最佳限制性内切酶,并得到了最佳酶切用量(40U/μL)。该方法所制备的基因组DNA质量较好,可用于BAC文库的构建。 相似文献
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细菌人工染色体(BAC)文库是进行生物基因组学研究的一个重要手段。以家蚕微孢子虫(Nosema bomby-cis)重庆分离株为材料,在前期构建的家蚕微孢子虫基因组框架图数据基础上,对构建家蚕微孢子虫BAC文库过程中的关键技术,如脉冲胶块(plug)的制备与处理、限制性酶的筛选、DNA的部分消化、酶切片段的选择、插入DNA片段与载体的摩尔比值等进行了研究,建立了构建家蚕微孢子虫BAC文库适宜的技术体系。构建的家蚕微孢子虫BAC文库由6 478个克隆构成,克隆片段平均大小约为50 kb,相当于家蚕微孢子虫基因组(15.33 Mb)的20倍,文库空载率较低,有利于深入开展家蚕微孢子虫基因组相关方面的研究。 相似文献
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为研究云南大额牛瘤胃中丰富的降解纤维素类物质的基因,采用包埋法和脉冲场电泳技术直接从云南大额牛瘤胃内容物提取总DNA,经不完全酶切获得DNA片段,大小为23~48 kb,与pcc2 FOS vector连接,转化至E.coli EPI 300宿主细胞,构建瘤胃微生物宏基因组Fosmid文库。该文库共保存38400个克隆,平均插入片段大小约35.5 kb,空载率小于2%,库容达1363 Mb。通过对该文库进行部分纤维素酶活力筛选,获得具有羧甲基纤维素酶活性的克隆95个,木聚糖酶活性的克隆52个,同时具有这2种酶活性的克隆23个,这为进一步研究大额牛瘤胃内纤维素酶基因奠定了基础。 相似文献
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一些病毒复制过程涉及到断裂双链DNA的修复,主要有同源重组和非同源的末端连接2种修复形式。基于这种修复机制建立了构建重组杆状病毒的无缝克隆方法,采用该方法构建重组病毒的2个主要元件是:线性化的复制缺陷型杆状病毒载体和重组拯救DNA片段。杆状病毒载体经Bsu36Ⅰ酶切后产生2个末端,即切短了的orf1629 3'末端和细菌人工染色体(BAC)末端。其中,含克隆目的基因的重组拯救DNA片段通过同源臂同源重组修复病毒载体orf1629缺失的3'端序列,并通过细胞内的非同源末端连接修复细菌人工染色体片段(BAC)Kanr末端,从而使载体环化产生重组杆状病毒。应用该方法构建重组杆状病毒无需构建重组载体,无需进行重组后筛选,具有成本低、效率高的特点。 相似文献
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从临床病鸭中分离并鉴定了1型鸭疫里默氏杆菌,并在提取鸭疫里默氏杆菌的基因组DNA后,用Sau3A I酶切,回收大小为0．07～4 kb的片段;将酶切片段与酶切的质粒载体pRSET连接后,电转化大肠杆菌Rosetta,成功构建了1型鸭疫里默氏杆菌的基因组文库,经检测库容量约为40000个。随机筛选30个单菌落,用pRSET通用引物进行PCR鉴定,统计结果显示插入片段的大小93．3％在1～3 kb范围内,成功构建了鸭疫里默氏杆菌基因组文库,为鸭疫里默氏杆菌功能基因的克隆及鉴定奠定了基础。 相似文献
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以临床分离的鸭圆环病毒（duck circovirus）（GenBank登录号：GU168779）阳性病料为材料,根据GenBank中所登录的鸭圆环病毒基困序列设计引物并对设计的引物5′末端进行磷酸化处理,通过引物设计替换碱基,以突变形成EcoRⅠ酶切位点。利用PCR方法扩增鸭圆环病毒的基因,经胶回收后,用T4 DNA连接酶进行环化,以获得鸭圆环病毒具有感染性的核酸。在含有分子标记的两端设计引物,进行PCR扩增,对PCR产物进行胶回收,连接T载体后测序,对胶回收产物进行EcoRⅠ酶切鉴定,均证明在第587位成功插入EcoRⅠ酶切位点。结果表明,本试验已成功构建带有分子标记的鸭圆环病毒的感染性核酸,为进一步开展该病毒的分子调控机制、致病性和开发基因工程疫苗研究奠定基础。 相似文献
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简要介绍了细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome,BAC）载体及其修饰技术,重点综述了BAC在马立克氏病病毒基因功能、疫苗研究中的应用。细菌人工染色体是近十几年发展起来的一种新型DNA克隆载体系统,具有操作简单、遗传稳定、容量大等明显的优势,主要用于构建基因组文库、转基因动物模型、分子克隆化病毒等。 相似文献
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本试验旨在探讨培养时间和表皮生长因子(EGF)对兔卵母细胞体外成熟及受精的影响。分别用切割法和针刺挤压法取经超排后母兔卵巢表面的卵母细胞颗粒细胞复合体(COCs),将COCs分别在不同时间(24、30、36及40h)和在基础培养液中添加不同浓度表皮生长因子(0、50、100ng/mL)进行体外成熟培养并观察其第一极体排出率。结果表明:①针刺挤压法获得COCs数明显高于切割法(P0.05);②体外成熟培养时间30(36)h的第一极体排出率高于24(40)h(P0.05);③添加50和100ng/mLEGF组卵母细胞第一极体排出率明显高于对照组(P0.05)。因此,①兔卵巢卵母细胞的获得方法以针刺挤压法较好;②兔卵母细胞成熟时间以30～36h为宜;③EGF对兔卵母细胞体外成熟有促进作用,在基础培养液中添加100ng/mLEGF为宜。 相似文献
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T-RFLP快速鉴定生鲜肉中牛羊成分的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
试验旨在建立快速检测生鲜肉中牛、羊成分的定性分析方法。通过T-RFLP法,上游引物的5′端用6-FAM进行荧光标记,下游引物5′端用ROX进行荧光标记,PCR结束后选择限制性内切酶HinfⅠ、BlnⅠ进行酶切消化,在测序仪上通过毛细管电泳即可检测荧光标记的两个末端的限制性片段。利用不同物种产生的不同峰谱达到对物种快速定性的目的。该法能够对生鲜肉中牛、羊肉进行定性鉴定分析,不同物种产生不同峰谱,限制性内切酶HinfⅠ酶切牛肉样品所产生的限制性末端片段长度为46和373 bp,限制性内切酶BlnⅠ酶切羊肉样品所产生的限制性末端片段长度为203和515 bp。 相似文献
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本研究根据GenBank中登录的剂量敏感的性别反转－先天性肾上腺发育不良基因1(dosage-sensitive sex reversal, adrenal hypoplasia critical region, on chromosome X, gene 1,DAX1)设计引物,构建包含DAX1基因cDNA片段的质粒,作为中国荷斯坦牛DAX1基因mRNA定量检测的标准品,建立了DAX1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法特异性好,检测灵敏度达102拷贝,线性范围为102～106拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值间有着良好的线性关系(r=0.99975),扩增效率高(E=100%),可以作为检测牛DAX1基因mRNA定量检测方法。 相似文献
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利什曼原虫实时荧光定量PCR方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
以利什曼原虫的小环状动基体DNA(Leishmaniak DNA)为靶基因,建立实时荧光定量PCR检测利什曼原虫的方法。根据GenBank报道的利什曼原虫小环状动基体DNA保守序列设计合成特异性引物,经PCR扩增后与pMD18-T载体连接,转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑选阳性克隆重组质粒经鉴定正确后,作为模板建立SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线。结果构建的标准曲线线性关系良好,相关系数为0.996,而且特异性强,重复性好。本研究成功建立了实时荧光定量PCR检测利什曼原虫的方法,该方法可用于利氏曼原虫病的诊断、流行病学监测和科学研究。 相似文献
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为探索以减毒胞内侵袭菌介导的黏膜免疫对宿主动物胃肠道微生态的影响,本试验以白色瘤胃球菌、黄化瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌3种主要瘤胃纤维分解菌16S rRNA分别设计引物,以山羊瘤胃液提取细菌总DNA,分别扩增3种纤维分解菌目的DNA片段,并连接至pMD-18 T Vector上,经PCR和测序鉴定后,以不同稀释度的重组质粒为模板进行荧光定量PCR反应。结果显示,扩增得到的3种瘤胃纤维分解菌目的片段与已知菌种相应片段的同源性大于99%;以不同稀释度重组pMD-18 T为模板建立的荧光定量PCR扩增曲线差异明显,绘制标准曲线的相关系数均接近1,熔解曲线均呈单一峰值。因此,本试验成功建立了3种瘤胃主要纤维分解菌的实时定量PCR方法,为减毒胞内侵袭菌介导的黏膜免疫研究奠定了基础。瘤胃纤维分解菌;Real-time PCR;标准曲线; 相似文献
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C. Schelling A. Billault B. Colomb B. Pineroli K. Guziewicz A. Piasecka A. Gmür J. Klukowska C. Gaillard G. Stranzinger G. Dolf 《Zeitschrift für Tierzüchtung und Züchtungsbiologie》2004,121(5):345-349
An existing canine genomic bacterial artificial chromosome (BAC) library was expanded by adding 115 200 clones with insert lengths not yet represented or under‐represented. The final version of the library consists of 211 968 clones with an estimated average insert size of 110 000 base pairs. Clones were grown individually and glycerol permanents were arrayed in 2208 96‐well microtitre plates. DNA of each clone was prepared by microwave treatment and organized in a three‐dimensional DNA pooling system (92 superpools) allowing for rapid screening by polymerase chain reaction (PCR). Screening of the library for 111 microsatellite loci representing all canine chromosomes revealed a recovery rate of 93% and a fourfold genome coverage. In addition, 50 BAC clones containing microsatellites or genes related to ongoing projects in the laboratories of the authors and eight other research groups were successfully recovered. The present library is the first canine BAC library amenable to PCR screening and is an invaluable tool for cloning candidate loci and developing genetic markers in specific chromosomal regions. This library will also enhance mapping efforts in related canid species and is an important source for geneticists studying inherited diseases common to both dog and humans. Interested researchers can access the library following the instructions at http://www.dogmap.ch . 相似文献