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利用基因重组技术,以油松PAL基因(TaPAL) CDS区(2 157 bp)作为外源基因的同源重组片段,构建了pET-28a-TaPAL重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中融合表达并进行分析.经SDS-PAGE电泳检测,在分子量80 KD处获得一条特异蛋白的表达条带,且其大小与预期相符.在温度28℃,IPTG浓度1.5 mmol· L-1,时间3h条件下,重组质粒的表达量最大.可溶性分析表明,在最佳诱导条件下,该蛋白主要以包涵体形式存在.粗酶活性测定表明,粗酶(在20℃、IPTG浓度1 mm01·L-1条件下诱导10 h)比活力为55.3μmol·min-1·gpro-1,即55.3U·g-1.构建的pET-28a-TaPAL重组载体能够在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出具有生物活性的融合蛋白. 相似文献
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[目的]克隆卡拉库尔羊TNF-α基因,在大肠杆菌中表达、纯化,并对TNF-α蛋白的抗原性进行分析.[方法]采用PCR技术扩增TNF-α基因核酸片段,并克隆入pET-28b表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)株中表达.用电洗脱法纯化目的蛋白,并用免疫印迹法分析纯化蛋白的抗原特异性.[结果]重组质粒在BI21 (DE3)菌株中经IPTG诱导表达一个相对分子质量约为49 KD的融合重组蛋白,原核表达质粒pET-28b-TNF-α表达的目的融合蛋白是以可溶的形式存在.用纯化的pET-28b-TNF-α免疫家兔,在免疫后的第45 d,Westem-blotting和琼脂糖扩散试验分析表明,表达的pET-28b-TNF-α能被家兔的阳性血清所识别.[结论]表达蛋白pET-28b-TNF-α具有较好的反应原性和免疫原性. 相似文献
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为了确定重组鸭α-干扰素(DuIFN-α)基因工程菌BL21(DE3)/pET32a+-DuIFN-α的最佳表达条件,对影响原核表达的主要因素:IPTG浓度、诱导时期、收获时间、培养诱导温度、葡萄糖浓度及培养基进行了优化;并利用抗性筛选对表达质粒的稳定性进行了研究。结果显示,诱导基因工程菌BL21(DE3)/pET32a+-DuIFN-α表达DuIFN-α的最佳条件为:以TB+5 g/L葡萄糖培养基37℃培养至菌体OD600=0.8~1.1时,加入IPTG至终浓度0.2 mmol/L,30℃诱导培养4~5 h。在最佳表达条件下,DuIFN-α的相对含量为34.1%,总含量(终菌体浓度×相对含量)达79.9;各种优化条件对表达质粒的稳定性未见明显影响。 相似文献
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为研究L蛋白在乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus,SHVV)增殖过程中发挥的作用,扩增SHVV L基因的前900个碱基,将其克隆到载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET32a-L,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞.设置不同温度、IPTG浓度及诱导时间,选择最佳的表达条件... 相似文献
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K+通道蛋白在维持细胞离子平衡等生命活动中发挥重要的作用.利用真核或原核表达系统高效表达K+通道蛋白是深入研究其生化特征及生理功能的基础和前提.该研究在成功克隆巴西橡胶树Hevea brasiliensis)K+通道蛋白基因cDNA全长的基础上,将HbKC01 cDNA编码区插入pET-28a构建原核表达载体pET-28a(+)-HbKCO1,并分别转化大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS和BL21(DE3)菌株.经过条件优化,转化的大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS菌株经1mM IPTG诱导3h能够高效表达HbKCO1重组蛋白,但同等条件下转化的BL21(DE3)菌株仅能微量表达.HbKCO1重组蛋白原核表达具有菌株依赖性. 相似文献
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参照Torque teno mini virus(TTMV)2型的ORF1基因序列,设计一对特异性引物,成功扩增出ORF1基因,并将其转化至表达载体pET-28a中,成功构建原核表达质粒pET28a-ORF1,并导入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达.SDS-PAGE分析结果表明,ORF1基因在大肠杆菌中获... 相似文献
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[目的]为了提高犬传染性肝炎Hexon蛋白基因在大肠杆菌中的表达量,研究Hexon基因蛋白的最佳表达条件和表达蛋白的活性.[方法]在大肠杆菌菌株BL21(DE3)培养过程中,选择诱导剂(IPTG)的最佳加入时间、诱导剂(IFTG)浓度、诱导时间以及不同温度条件观察对Hexon融合蛋白表达的影响,以确定最佳表达条件,并用Westem-blot检测重组蛋白的生物活性.[结果]大肠杆菌BL21(DE3)在37℃培养2.25h后,添加终浓度为2.0 mmol/L的IPTG,27℃培养8 h,Hexon重组蛋白表达量最高(1.67mg/mL),所表达的重组蛋白能与犬传染性肝炎阳性血清相结合.[结论]在高浓度IPTG诱导和冷培养条件下,Hexon蛋白基因的表达量最高,表达出的重组蛋白具有很好的反应原性,为进一步研究六邻体蛋白的作用机理及亚单位疫苗的研究提供了实验基础. 相似文献
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为了将绿色荧光蛋白(GFP)引入大肠杆菌中表达并且进行蛋白的纯化,以提高GFP在大肠杆菌中的表达量,用于传统检测方法的改进及目的菌的应用研究.将人工重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),研究大肠杆菌菌株在温度、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对HIS-GFP融合蛋白表达量的影响.结果:大肠杆菌菌株BL21(DE3)在37℃培养下,D600为0.6～0.8,使用终浓度为0.5 mmol/L的IPTG在15℃诱导培养12 h时,HIS-GFP融合蛋白表达量最高,表达的HIS-GFP融合蛋白可占细菌总蛋白的40％以上.用Ni-IDA亲和层析柱对HIS-GFP融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE分析表明HIS-GFP融合蛋白大小约为68 ku,与预计的分子量大小一致,Western blotting分析表明其能与Anti-HIS单克隆抗体起特异性反应. 相似文献
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根据GenBank上登录的红笛鲷SR-BI基因设计引物,采用RT-PCR方法扩增该基因胞外段序列,然后将该基因胞外段序列定向克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,将重组质粒转入大肠杆菌BL21进行IPTG诱导表达,并对重组表达菌株的表达条件进行优化.结果显示,成功构建了原核表达载体pET28a-SR-BI,并能在大肠杆菌BL21中表达,表达的融合蛋白分子量为50.0ku.融合蛋白的最佳诱导表达温度、IPTG浓度和时间分别为16℃、0.05mmol/L和8h.研究结果为进一步研究SR-BI的功能奠定了基础. 相似文献
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[目的]研究拟南芥AtXCD1蛋白的原核表达.[方法]构建XCD1原核表达载体,根据NCBI基因序列设计引物,并以PCR扩增得到大量目的片段XCD1,将XCD1连接到原核表达载体pET-32a＋,并对重组质粒进行测序鉴定,将重组质粒转化至大肠杆菌原核表达菌株BL21（DE3）,对蛋白表达条件：诱导时间、诱导温度和IPTG浓度等进行优化.IPTG诱导表达获得目的蛋白,对蛋白表达条件：诱导时间、诱导温度和IPTG浓度等进行优化.[结果]XCD1序列全长为1 242bp,与PCR产物大小一致.蛋白XCD1-pET-32a＋较适表达条件为在30℃0.1 mmol/L的IPTG诱导1.5h.[结论]该结果为进一步蛋白纯化及酶活测定试验奠定了基础. 相似文献
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用RT-PCR法从NDV Lasota疫苗株中扩增出HN基因,将其克隆到pGEM-T easy vector中,构建了重组质粒pT-HN.设计了1对引物,用PCR法扩增出HN蛋白主要抗原表位基因(442～1 734 bp共1 239 bp),将其连接到原核表达载体pET-28a( ),构建重组质粒pET-HN.用IPTG诱导使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.SDS-PAGE结果表明,NDV HN主要抗原表住基因在pET-HN中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子量为28 kD.同时,通过试验摸索并确定了表达HN蛋白主要抗原表位基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.4 mmol·L-1,诱导时间为4 h,温度为37℃. 相似文献
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根据家蚕抗菌肽Cecropin B的氨基酸序列,按大肠杆菌基因偏爱密码子,人工合成改造过的Cecropin B基因。将改造过的Cecropin B基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-41a中,构建了融合蛋白表达载体pET41a-cecB,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到表达Cecropin B的大肠杆菌工程菌株。通过SDS-PAGE分析,研究了用乳糖代替IPTG诱导大肠杆菌BL21表达家蚕抗菌肽Cecropin B的诱导条件,得到乳糖的最佳用量为0.25 mmol/L、诱导起始浓度为OD 1.0、诱导时间为5 h。最终Cecropin B的表达量可占细胞总蛋白的17.1%。为乳糖作为诱导剂应用于大肠杆菌生产重组家蚕抗菌肽提供了参考依据。 相似文献
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[目的]通过RT-PCR获得拟南芥AtCOR15a基因的ORF全长,经酶切、连接,以pET-28a(+)为原核表达载体.构建成pET28a-COR15a的重组表达载体,研究该基因在大肠杆菌中的表达情况,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]根据拟南芥AtCOR15a基因序列设计特异引物,利用RT-PCR的方法扩增目的基因,构建原核表达载体pET28a-COR15a,并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,验证其蛋白表达量,并对其体系进行优化.[结果]AtCOR15a在大肠杆菌中成功表达,在37℃条件下诱导表达量最大,而30和16℃条件下蛋白表达量降低,IPTG浓度0.2～1.0 mmol/L对蛋白的表达量影响不大,并没有明显差异.但通过在不同诱导时间取样分析,结果发现加入IPTG后诱导5 h蛋白表达量最大,而8 h后逐渐降低.[结论]构建的原核表达载体在大肠杆菌中能高效表达,AtCOR15a融合蛋白分子量大约为19 kD,为进一步研究该基因的功能奠定了基础. 相似文献
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orfH79是水稻红莲型细胞质的雄性不育基因.为了进一步研究其分子机理,在大肠杆菌中分别构建水稻红莲型细胞质雄性不育基因ofH79的原核表达载体pET-28a -orfH79和pGEX5x -2 - orfH79.分别转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)后利用IPTG诱导分析其表达产物对细菌生长的影响,结果表明PET -... 相似文献
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SOS2(Salt Overly Sensitive 2)是植物中一类耐盐相关基因的统称,在植物对盐害的响应及适应过程中具有重要作用。本试验以花生AhSOS2基因全长cDNA为模板,经PCR扩增获得AhSOS2的蛋白编码区,将该区段与表达载体pET-28a(+)融合,构建获得原核表达载体pET-28a-AhSOS2,并进一步在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。经1.0 mmol/L IPTG诱导后,获得一条约51 kD的融合蛋白条带,且随着IPTG诱导时间的延长,蛋白表达量逐渐提高,诱导8 h可获得较高的蛋白表达水平。 相似文献
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[目的]构建日本蟾蜍(Bufo japonicus formosus)髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,mcl-1)的原核表达载体并诱导其重组蛋白表达。[方法]通过PCR方法扩增日本蟾蜍皮肤mcl-1开放阅读框,将其插入到原核表达载体pET-28b中。经菌落PCR、DNA限制性内切酶消化筛选阳性克隆,并通过DNA测序确定原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功。将pET-28b-mcl-1转入大肠杆菌(E.coli)感受态细胞BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE对重组蛋白的表达进行检测。[结果]原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功;重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。[结论]原核表达载体的构建及重组蛋白的表达,为后续MCL-1的纯化、抗血清的制备及生理功能检测奠定了基础。 相似文献